Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos
19 de maio de 2021
Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.
Desenvolvemos um método simples sem Langendorff para isolar células cardíacas individuais do rato por uma técnica de embalagem antegrada. Este método permite o isolamento de células cardíacas de camundongos juvenis para mais velhos. A perfusão retrógrada baseada em Langendorff tem sido considerada um padrão-ouro para isolar miócitos cardíacos em vários animais experimentais.
No entanto, a canulação da LTA é tecnicamente difícil em camundongos devido ao seu pequeno tamanho. Para a colheita do coração do rato, depois de confirmar a eutanásia e raspar o abdômen, abra rapidamente a cavidade torácica para expor o coração e use uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada aproximadamente do tamanho do coração para sugar o coração para dentro da pipeta. Levante a pipeta para criar espaço suficiente para inserir tesouras curvas e use a tesoura para retirar o coração do lado dorsal tomando cuidado para evitar danificar o atria.
Imediatamente, coloque o coração em um copo de vidro de 30 mililitros contendo CIB-EGTA gelado por cerca de um minuto. Quando as contrações pararem, coloque o coração em um prato de cultura de 35 mililitros contendo CIB-EGTA gelado, e remova o pulmão e outros tecidos visíveis. Coloque o coração aproximadamente limpo em um suporte de coração cheio de lado do ápice CIB-EGTA refrigerado para baixo e coloque o suporte sob um microscópio estereoscópico.
Remova a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da aorta. Se o comprimento da aorta cortada for muito longo, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica e oriente o coração para que a superfície anterior esteja voltada para a frente. Use pinças para levantar a extremidade da aorta e use um pequeno grampo vascular para fixar a aorta perto da ária enquanto empurra suavemente para baixo na ária.
Em seguida, coloque o coração preso em uma placa de perfusão com o lado anterior voltado para cima e hidrate o coração com algumas gotas de CIB-EGTA. Para a perfusão antegrada, carregue uma seringa de 20 mililitros contendo CIB-EGTA pré-armado conectado a um tubo de extensão flexível e uma agulha de injeção marcada na bomba de infusão e inicie a bomba a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitro por minuto. Quando a agulha e a bomba tiverem sido preenchidas, coloque a agulha de injeção na placa de perfusão com o lado mais curto da forma diagonal na frente e deslize a agulha até que ela esteja apenas tocando o ápice do coração.
Insira cuidadosamente a agulha perto do ápice do ventrículo esquerdo na câmara ventricular sem torcer ou soltar a agulha da placa, observando a marca para estimar a profundidade da inserção da agulha. Quando a inserção da agulha estiver completa, o sangue deve começar a fluir da artéria coronária. Use fita para fixar a agulha de injeção na placa e aumente a velocidade da bomba para um mililitro por minuto.
Se o coração for perfundido com sucesso, o fluxo do tampão no capilar deve ser visível logo abaixo do epicárdio. Após dois a três mililitros de perfusão CIB-EGTA, substitua o tampão de perfusão por mistura de enzimas. Depois de um a dois mililitros terem sido perfundidos, aumente a velocidade da bomba para 1,5 mililitros por minuto.
Use uma pipeta para remover o perfusato acumulado contendo sangue que flui do coração conforme necessário e parar a perfusão quando o volume total de enzima perfusada atingir 10 mililitros. No final da perfusão, transfira 10 mililitros de mistura de enzimas da seringa para um prato de cultura de 60 milímetros em um tapete de aquecimento e adicione 20 miligramas de BSA ao prato. Gire suavemente o prato para dissolver o pó e remover a agulha de injeção e fixar do coração.
Remova os ventrículos e atria do coração e coloque os tecidos na mistura de enzimas complementadas pela BSA. Para isolar os miócitos ventriculares, use dois pares de pinças para agarrar o epicárdio e puxar suavemente os ventrículos em pequenos pedaços. Quando todos os fragmentos do ventrículo tiverem sido gerados, disperse as células aproximadamente 30 vezes com tubulações suaves e filtre os detritos não digeridos através de um filtro de células de malha de 100 mícrons em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Após a centrifugação, resuspenha a pelota de cardiomioceto em CIB pré-armado complementado com cálcio e BSA e incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, centrifugar as células novamente e resuspensar os cardiomiócitos precipitados em um volume apropriado de solução de resuspensão celular para sua manutenção a 37 graus Celsius até a análise a jusante. Para isolar os miócitos atrial, transfira a atria para um recipiente de CIB pré-armado complementado com cálcio e BSA e rasgue a ária em pedaços como demonstrado.
Use uma pipeta de 20 microliteres definida para 10 microliters para interromper os tecidos por pipetação e coletar as células dissociadas por centrifugação. Em seguida, resuspende a célula atrial em um volume apropriado de solução de ressuspensão celular. Nesta imagem, podem ser observados miócitos ventriculares recém-isolados.
Este procedimento de isolamento resulta em um rendimento de 70 a 80% de miócitos ventriculares quiescentes em forma de vara de oito a 10 semanas de idade em cerca de cinco horas de isolamento. A proporção de células viáveis recém-isoladas é menor em camundongos maiores de dois anos de idade. Os potenciais de ação registrados nos miócitos ventriculares e atrial são semelhantes aos medidos em células obtidas pelo método baseado em Langendorff.
A análise imunossulínica pode ser usada para avaliar a organização da estrutura sarcomerica dos miócitos ventriculares e a transformação dos fibroblastos cardíacos em miofibroblasts após a subcultura. Recomenda-se a análise de manchas ocidentais para determinar a expressão específica de proteínas de interesse nos átrios e ventrículos após o processamento. Após a perfusão com enzimas, as proteínas dos atria e ventrículos podem ser facilmente homogeneizadas no tampão de lise com força leve para extração de proteínas.
É importante controlar a direção e as profundidades da inserção da agulha. Ao inserir a agulha no ventrículo esquerdo, tome cuidado para não perfurar o septo ventricular ou penetrar na válvula. Você pode alterar a composição do perfusato dependendo do propósito do experimento.
Por exemplo, um detergente suplementado EGTA pode ser usado para fazer um andaime livre de células do coração.
Visão Geral
Este estudo aborda o desafio do isolamento de células cardíacas individuais de camundongo, essencial para a pesquisa cardíaca. Os autores desenvolveram um método livre de Langendorff que utiliza perfusão anterógrada para isolar eficientemente células de camundongos de diversas idades, melhorando significativamente o acesso a tipos específicos de células cardíacas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Isolamento de células cardíacas
- Biologia do coração de camundongo
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Os métodos tradicionais de Langendorff enfrentam dificuldades técnicas em camundongos devido ao seu tamanho.
- O isolamento celular é essencial para compreender a função e a patologia cardíacas.
- O desenvolvimento de métodos acessíveis beneficia uma ampla gama de estudos cardíacos.
Métodos Utilizados
- Técnica de perfusão anterógrada
- Sistema de modelo murino
- Uso de tampões e enzimas específicos para dissociação celular
Resultados Principais
- Isolamento eficiente de miócitos ventriculares e atriais com alta viabilidade celular (rendimento de 70-80%).
- Potenciais de ação celulares semelhantes aos obtidos pelos métodos Langendorff.
- Passos procedimentais detalhados para extração celular ideal.
Conclusões
- Este estudo apresenta um método simplificado e eficaz para o isolamento de células cardíacas de corações de camundongos.
- A abordagem tem relevância para o avanço das metodologias de pesquisa cardíaca.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento eficiente de cardiomiócitos viáveis a partir de corações de camundongos é um fator essencial para descobertas iniciais e estudos mecanicistas na pesquisa de fármacos cardiovasculares. O método de perfusão anterógrada elimina as barreiras técnicas da perfusão retrógrada baseada em Langendorff, ampliando o acesso a células cardíacas de alta qualidade em uma faixa mais ampla de idades de camundongos. Essa capacidade sustenta a validação robusta de alvos e ensaios funcionais, impactando diretamente a confiabilidade preditiva nos processos de P&D cardiovascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses específicas cardíacas utilizando miócitos ventriculares e atriais recém-isolados.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer células de alta viabilidade para ensaios funcionais e moleculares.
- Facilita estudos mecanicistas sobre tipos celulares cardíacos, melhorando a confiança preditiva na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece isolamento padronizado e reprodutível de cardiomiócitos e fibroblastos para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
- Oferece rendimentos celulares quantitativos adequados para análises eletrofisiológicas e de expressão proteica.
- Permite a preparação de sistemas celulares cardíacos validados para triagem de compostos e leituras funcionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos cardíacos relevantes para doenças ao permitir o isolamento desde camundongos jovens até idosos.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, com qualidade e viabilidade celulares consistentes.
- Apóia estudos translacionais de biomarcadores por meio da compatibilidade com análises de imunomarcação e Western blot.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de perfusão anterógrada integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer uma fonte confiável de células cardíacas primárias para testes de hipóteses, desenvolvimento de ensaios e desvio mecanicista de riscos.
- Biologia da Descoberta: Permite testes robustos de hipótese nula e esclarecimento de vias utilizando cardiomiócitos recém-isolados.
- Triagem: Fornece preparações celulares reprodutíveis e quantitativas para padronização de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Apoia leituras quantitativas, como medições do potencial de ação e perfis de expressão proteica.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação com modelos de doenças e a validação de biomarcadores por meio do isolamento de células de alta qualidade.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado e escalável, adaptável entre equipes de pesquisa e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos cardíacos.
- Valor Operacional: Melhora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de isolamento de células cardíacas.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de prosseguir/não prosseguir e reduz riscos biológicos em estágios avançados em portfólios cardiovasculares.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de descoberta cardíaca.
Considerações de Implementação
- Requer experiência técnica em dissecação microcirúrgica e perfusão sob microscopia estereoscópica.
- Exige acesso a bombas de infusão, tapetes aquecidos e infraestrutura analítica para ensaios posteriores.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de perfusão e dos protocolos de manipulação celular.
- Adaptável a diferentes idades de camundongos, mas o rendimento e a viabilidade celular podem diminuir em animais mais velhos.
- O controle cuidadoso da profundidade de inserção da agulha e da composição do perfusato é essencial para a reprodutibilidade.
