Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Todas as proteínas de membrana são alvos importantes na descoberta de medicamentos. A produção em maior escala de proteínas de membrana continua sendo um gargalo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana. Este método pode ser usado para sintetizar eficientemente proteínas de membrana in vitro e para preparar proteolipossomas purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso.

Depois de adicionar os reagentes apropriados, incluindo o plasmídeo de expressão livre de células para gerar uma mistura de reação de transcrição, misture o conteúdo do tubo por inversão suave ou batida e execute uma rotação rápida em uma microcentrífuga. Após a centrifugação, incubar a mistura de reação de transcrição por seis horas a 37 graus Celsius, seguida de mistura e uma etapa de centrifugação. Para preparar o tampão de tradução, diluir a solução de reserva com água fresca ultrapura.

Para tradução em pequena escala, use copos de diálise de 100 microlitros lavados com água ultrapura para remover o glicerol da membrana de diálise. Adicione um mililitro de água ultrapura a um novo tubo de 1,5 mililitro e insira um copo de diálise em pequena escala no tubo. Em seguida, adicione 500 microlitros de água ultrapura ao copo para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente.

Para preparar lipossomas, transferir uma solução lipídica contendo 50 miligramas de lípidos para um balão de evaporação. Colocar o balão num evaporador rotativo para evaporar o solvente. Quando uma camada fina e uniformemente espalhada de lipídios for gerada na superfície do fundo do frasco, transfira o frasco para um dessecador a vácuo sob pressão negativa durante a noite para remover completamente o solvente.

Na manhã seguinte, retire os frascos do exsicador e verifique a fina película de lípidos. Adicionar um mililitro de tampão de tradução ao balão e rodar o balão para espalhar o tampão sobre a fina película lipídica. Após cinco minutos, sonicar o balão mudando o ângulo ocasionalmente para permitir que a solução entre em contato com toda a superfície do filme lipídico.

Parar a sonicação quando o lípido for completamente retirado do frasco e a suspensão do lipossoma se tornar uniforme. Em seguida, transfira a suspensão lipossomal para um novo tubo de 1,5 mililitro. Antes de realizar uma tradução de proteína in vitro, flutue um tubo de extrato de gérmen de trigo de armazenamento de 80 graus negativos em água em temperatura ambiente por alguns minutos para descongelar rapidamente o material.

Ao descongelar o extrato, misture imediatamente o conteúdo do tubo por inversão suave. Em seguida, gire para baixo e coloque o tubo no gelo. Adicione o mRNA do extrato de gérmen de trigo e os lipossomas para gerar uma mistura de reação de tradução.

Misture o conteúdo do tubo por inversão suave ou batida e execute uma rotação rápida em uma microcentrífuga. Para realizar uma tradução de proteína in vitro em pequena escala, remova a água do copo e tubo de diálise em pequena escala e adicione um mililitro de tampão de tradução ao tubo e 300 microlitros ao copo. Tome 60 microlitros de mistura de reação de tradução.

Insira a ponta da pipeta no tampão de translação no copo de diálise. Em seguida, injete a mistura lenta e suavemente. A mistura de reação com maior densidade afunda espontaneamente no fundo do copo e forma uma camada.

Cubra o copo com uma tampa para evitar a evaporação. Para realizar uma tradução em grande escala, adicione 22 mililitros de tampão de tradução a um tubo de 25 mililitros e coloque um copo de diálise de dois mililitros no tubo. Adicione dois mililitros de tampão de tradução ao copo de diálise.

Pegue 500 microlitros da mistura de reação de tradução, injete lenta e suavemente a mistura no tampão de tradução no copo. Incube as reações por 24 horas a 15 graus Celsius. No dia seguinte, misture bem a reação no copo de diálise pipetando e transfira as suspensões brutas de proteolipossomas para novos tubos.

Para purificar os proteolipossomas, sedimentar o proteolipossomo nas suspensões brutas por centrificação. Em seguida, lave o proteolipossomo ressuspendendo no volume apropriado de tampão PBS gelado três vezes. Após a lavagem, ressuspenda completamente os pellets de proteolipossomas em um pequeno volume de PBS e meça o volume da suspensão usando uma micropipeta.

Em seguida, adicione PBS para ajustar o volume da suspensão. Transfira cada suspensão para um novo microtubo. Para configurar uma análise de página SDS, adicione 70 microlitros de água e 40 microlitros de tampão de amostra de página SDS concentrado em três tempos a 10 microlitros de cada suspensão de proteolipossomo.

Configure um gel de página SDS de cinco a 20% de gradiente em uma câmara de eletroforese. Carregue o gel com dois microlitros do marcador de tamanho de proteína três, seis e 12 microlitros de cada amostra de proteolipossomo e 10 microlitros de padrões de albumina de soro bovino. Após o carregamento das amostras, execute a eletroforese seguida de coloração do gel com o corante Coomassie Brilliant Blue.

Por fim, descolore o gel em água quente com agitação suave e escaneie a imagem do gel. Usando este protocolo, conforme demonstrado, uma variedade de proteínas de membrana com três ou mais hélices transmembranares pode ser facilmente produzida como proteolipossomas em um curto espaço de tempo. Neste método de diálise de bicamada, um fornecimento contínuo de substratos e a remoção do subproduto podem ser conduzidos de forma eficiente tanto na parte superior quanto na inferior da mistura de reação por um longo período de tempo, levando a uma excelente eficácia de tradução.

O método de diálise de bicamada resulta em um aumento de quatro a 10 vezes na produtividade em comparação com o uso apenas dos métodos de bicamada ou diálise. A coleta dos proteolipossomas sintetizados por centrificação e sua purificação parcial com um tampão de lavagem encurta muito o processo de purificação das proteínas da membrana. Este sistema sem células é fácil de manipular e altamente escalável.

Também pode ser usado para produzir proteínas de memória que são difíceis de expressar usando outros métodos. Este método é extremamente útil para investigações e experimentos que usam ou visam proteínas de membrana, como proteína antimembrana, produção de anticorpos, SPR, Elisa e AlphaScreen.