Name: Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a preparar Drosophila melanogaster adulta para imagem cerebral inteira durante comportamentos e estímulos sensoriais. Este método permite visualizar atividade neuronal em tempo real enquanto a mosca caminha e responde a odores.

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Agradecemos a Heidi Miller-Mommerskamp por ajuda técnica e Iveth Melissa Guatibonza Arevalo por comentários úteis sobre o manuscrito. Versões iniciais do protocolo foram desenvolvidas no laboratório de Ralph Greenspan. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG), em particular por meio de uma bolsa FOR2705 (TP3) ao IGK, e pela Fundação Simons (Aimon – 414701) e pelo Instituto Kavli para Cérebro e Mente (número de subvenção #2017-954) recebido pela SA.

Todas as etapas são executadas sob um estereótipo.
1. Preparando o titular
<ol><li>Imprima o titular 'FlyholderVJove.stl' (ver Material Suplementar) com uma impressora 3D ou imprima-o usando serviços online(Figura 1A). Tanto SLS (Nylon PA12) quanto multijet fusion (PA12) são adequados.</li>
	<li>Crie o slot da cabeça.<ol>
<li>Coloque um pedaço de fita adesiva retangularmente sobre uma superfície plana. Corte uma fatia de aproximadamente 5 mm x 1 cm. Corte a ranhura do pescoço (~400 x 400 μm) no meio do lado mais longo da fita usando lâminas paralelas fixas (duas lâminas de bisturi grudes grudes) para garantir a mesma largura em cada suporte(Figura 1B).</li>
		<li>Coloque a fita sobre o lado liso do orifício no suporte na parte inferior (ver Figura 1C e Figura 1D). A fita pode ser deformada empurrando-a para baixo com fórceps ~500 μm ao redor do buraco; isso minimizará ainda mais o impedimento dos movimentos posteriores de moscas.</li>
		<li>Cubra a fita e o suporte de cima com esmalte preto para evitar que o tampão vaze. O esmalte preto também protegerá os olhos da mosca da luz de excitação do microscópio. Deixe o esmalte secar pelo menos uma hora antes de usar o suporte.</li>
		<li>Uma vez que o esmalte esteja seco, adicione ~1 μL de graxa na ranhura da cabeça usando um tecido enrolado para garantir que a cola não molhe a parte de trás da cabeça da mosca(Figura 2A). Certifique-se de não colocar graxa fora da ranhura que evitaria que a cola grude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criar a ranhura do corpo(Figura 2B).<ol>
<li>Opcionalmente, prepare a fita que será usada para posicionar o corpo da mosca (veja abaixo) com antecedência. Use o design mostrado na Figura 2B (parte superior) para cortar um pedaço de fita de ~2 cm de largura em duas e cortar fatias de 1,5 mm de largura. Corte 0,3 mm de ombros profundos e ranhura corporal. Certifique-se de que ele se encaixa no suporte. NOTA: A variabilidade entre tamanhos de mosca (em particular com sexo, idade, genótipo ou espécie) pode tornar necessário ajustar o desenho da fita. Se a cabeça tende a ser mal centrada, pode ser útil adicionar uma fita em forma de V temporariamente sobre a ranhura do pescoço(Figura 3). Aplique também alguns microliters de graxa dentro da ranhura do pescoço e na fita em forma de V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Colocar a mosca
NOTA: Moscas fêmeas de um a quatro dias de idade são ideais porque a cabeça feminina é maior e, portanto, mais fácil de dissecar do que a cabeça masculina, e moscas mais jovens têm cutícula mais macia. Para experimentos de caminhada, a atividade da mosca pode ser aumentada combinando os experimentos com tempos de maior atividade circadiana (ZT0 ou ZT11), usando soro fisiológico contendo glicose (como 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM de glicose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), passando fome a mosca até 24 h com um ambiente somente de água, e aquecendo o ambiente a ~28 °C durante o experimento. Cortar as asas com pelo menos um dia de antecedência também ajuda a diminuir as tentativas de voar e, assim, aumentar a frequência de ataques de caminhada7,29,30.
<ol><li>Encha uma placa de Petri ou a tampa da caixa de ponta de pipeta com gelo, coloque um tecido de laboratório em cima do gelo e coloque o suporte de cabeça para baixo sobre ele.</li>
	<li>Transfira uma mosca no gelo para paralisá-la, sugando-a de seu frasco para um tubo e soprando-a para o gelo (certifique-se de que o gelo não seja derretido, o que afogaria a mosca).</li>
	<li>Quando a mosca parar de se mover, use fórceps maçante para deslizá-lo para dentro do suporte com o pescoço dentro da fenda (a mosca pode ser mantida na base da asa) como na Figura 4 (esquerda). Os olhos devem estar em posições iguais em relação aos lados da ranhura(Figura 4, meio). Se necessário, adicione 1 μL de graxa na parte superior da cabeça para evitar que a cola (veja o próximo passo) atinja a parte de trás da cabeça e remova mais tarde.</li>
	<li>Cubra o corpo com um tecido e um pouco de gelo para garantir que a mosca não se mova durante esta etapa e a próxima(Figura 4, à direita). Outra opção para evitar que as pernas cheguem à cabeça é usar um pedaço de fita logo abaixo da cabeça (ver Figura 6).</li>
</ol>3. Fixar a cabeça
<ol><li>Coloque a cabeça em um ângulo ~20° a partir de uma visão totalmente posterior (ao redor do eixo lateral, ver Figura 5A). Este é um compromisso entre diminuir a profundidade para a imagem e do outro lado manter a perna dianteira livre para se mover e minimizar o estiramento do pescoço.</li>
	<li>Com um tecido enrolado(Figura 5B),coloque cola UV ao redor da cabeça, evitando sujar a área sensorial de interesse (antenas, proboscis e/ou olhos). Para experimentos de sabor, puxe o proboscis para fora e adicione cola em sua base para evitar o movimento. Se nenhum experimento de sabor for planejado, o proboscis é melhor empurrado para a cabeça e fixado com cola para minimizar o movimento(Figura 6).</li>
	<li>Cure a cola com luz UV para 5 s. Limpe cuidadosamente o circundante da cabeça com um tecido enrolado para remover a cola líquida restante que pode grudar nas pernas e/ou áreas sensoriais do solo. NOTA: A fita pode ser áspera com lixa para aumentar a adesão à cola, se necessário.</li>
	<li>Use uma fina tira de fita ou um tecido enrolado para mover as pernas para a frente (se ainda não estiverem), para que não sejam danificadas pelo próximo passo.</li>
</ol>4. Posicionamento do corpo
NOTA: Esta etapa precisa ser executada rapidamente; antes que a mosca se recupere da anestesia.
<ol><li>Retire o recipiente de gelo e gire o suporte. Remova a água ao redor da mosca com um tecido.</li>
	<li>Coloque a fita do entalhe do corpo (criada no passo 1) sobre o orifício e empurre suavemente o corpo da mosca para baixo(Figura 7). Tenha cuidado para não esticar muito o pescoço.</li>
</ol>5. Selar o buraco
<ol><li>Cubra os buracos grandes restantes com fita adesiva.</li>
	<li>Adicione ~1 μL de graxa na parte de trás da cabeça e na área do pescoço para garantir que nenhuma cola molhe lá.</li>
	<li>Com um tecido enrolado, pinte cola UV ao redor e em cima da fita e no tórax (parte dorsal superior do mesonotum) para corrigi-lo. Cure a cola com luz UV por ~5 s. NOTA: É importante minimizar o uso da luz UV, pois pode afetar fortemente a saúde da mosca.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente a graxa e a cola não cicatrizada com um tecido de laboratório.</li>
	<li>Coloque ~1 mL de soro fisiológico em cima da cabeça. Empurre as bolhas de ar de lado com fórceps. Procure vazamentos colocando uma mancha sobre o soro fisiológico e virando o suporte para verificar se há soro fisiológico na parte frontal. Se houver algum vazamento, remova o soro fisiológico e fixe o orifício (adicionando mais cola ou mais graxa). NOTA: Este pode ser um bom momento para pausar, se necessário. A mosca pode ser oferecida um pequeno pedaço de tecido ou bola de isopor para andar para evitar flailing e acalmar a mosca para baixo.</li>
</ol>6. Dissecando a cabeça
NOTA: Use fórceps aguçados para as seguintes etapas. Fórceps muito finos são críticos, pois fórceps maçante tornarão mais difícil abrir a cutícula da cabeça e podem levar a lesões adicionais na cabeça ou cérebro da mosca. A ampliação forte pode ajudar nesta fase. Para esse objetivo, pode-se substituir os oculares do microscópio binóculo por oculares de 30x.
<ol><li>Faça dois cortes na base do triângulo cuticular escuro central em cada lado do pescoço (ver cruzes na Figura 8A).</li>
	<li>Corte ao redor do triângulo escuro e remova esta parte da cutícula.</li>
	<li>O buraco no cérebro através do qual o músculo 16 e o esôfago vão agora deve ser visível e mover-se ritmicamente (Vídeo 1 apresenta esse movimento rítmico em uma mosca com músculos fluorescentes). Belisque cuidadosamente a parte superior desta área para cortar o músculo 16 sem perfurar o esôfago. Se o movimento rítmico do cérebro parou, o músculo 16 provavelmente foi removido, no entanto, o movimento às vezes pausa e reinicia mais tarde. Por isso, é importante prestar atenção aos movimentos rítmicos e realizar esse passo novamente, se necessário.</li>
	<li>Corte a cutícula restante em pequenos pedaços e remova-as cuidadosamente. Tente não puxar muito a cutícula. Em vez disso, use os fórceps como uma tesoura, para cortar pedaços de tecido. Pode-se começar nas bordas medial, onde o triângulo escuro foi removido antes e trabalhar o caminho para os lados. NOTA: Pedaços de cutícula podem ser usados para raspar suavemente corpos de gordura se presentes.</li>
	<li>Remova os sacos de ar uma peça após a outra, agarrando-os com os fórceps e puxando lentamente e de forma constante.</li>
</ol>

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<li>Shiozaki, H. M., Ohta, K., Kazama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-regional+Network+Encoding+Heading+and+Steering+Maneuvers+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Multi-regional Network Encoding Heading and Steering Maneuvers in Drosophila.</a> Neuron. 106, 126-141 (2020).</li>
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<li>Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+contact+activates+male-specific+interneurons+that+trigger+stereotypic+courtship+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila.</a> Neuron. 69, 498-508 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Drosophila é um dos raros animais adultos onde todo o cérebro pode ser imagen durante comportamentos complexos. Aqui, apresentamos um método para preparar a mosca e expor todo o seu cérebro à imagem de toda a atividade cerebral. Vários pontos importantes devem ser observados.
Dissecar um pequeno animal como D. melanogaster é um desafio. O método, portanto, requer muita prática e paciência para dominá-lo. No entanto, após o treinamento, o procedimento leva menos de 30 minutos e produz resultados reprodutíveis.
O método que apresentamos tem limitações adicionais. Primeiro, inclinar a cabeça de mosca de sua posição natural leva ao alongamento do pescoço que pode ser prejudicial ao tecido conjuntivo, nervos ou músculo. Em segundo lugar, embora a zona subesofágica ventral (SEZ) seja opticamente acessível, está abaixo do esôfago semitranspar transparent, o que diminui a intensidade e a resolução nesta área. Finalmente, embora o titular esteja fora de alcance na maioria das direções, a mosca ainda às vezes percebe sua presença e empurra sobre ele para tentar escapar.
Apesar dessas limitações, os dados abrangentes obtidos de imagens cerebrais inteiras durante o comportamento e respostas a estímulos permitirão decifrar a função cerebral ao nível de toda a rede quando o animal interagir e navegar em ambientes complexos e naturalistas.

A atividade cerebral por imagem usando várias técnicas aprofundou a compreensão da função cerebral. Em humanos, as técnicas de imagem cerebral têm limitações importantes: enquanto a ressonância magnética funcional (fMRI) oferece resolução espátula-temporal muito abaixo da resolução de neurônios únicos, técnicas rápidas como a eletroencefalografia (EEG) só permitem acesso indireto e parcial ao cérebro1. Em modelos animais suficientemente grandes, como roedores, o registro de sensores de atividade fluorescente (por exemplo, GCaMP) usando microscópios montados na cabeça permite observar a atividade cerebral enquanto o animal está se movendo em seu ambiente2. No entanto, essas técnicas atualmente dão acesso apenas a uma pequena parte do cérebro. Animais com fixação da cabeça podem ser imagens de forma mais abrangente, mas a cobertura ainda é parcial (por exemplo, a superfície do córtex3). É apenas em animais pequenos, como as larvas de zebrafish, C. elegans e Drosophila que todo o cérebro pode ser imageado com resolução temporal e espacial ao nível ou próximo de neurôniosúnicos 4.
D. melanogaster é particularmente promissor porque tem sido usado há muito tempo como um organismo modelo genético5 e poderosas ferramentas genéticas foramdesenvolvidas 6. Complementada pela nova rede anatômica em larga escala derivada da microscopia eletrônica7,a mosca poderia fornecer oportunidades únicas para estudar dinâmicas cerebrais complexas geradas em uma rede de grande escala8. Embora a cutícula não seja transparente e, portanto, deve ser removida para imagem do cérebro, a imagem funcional in vivo tornou-se cada vez mais comum desde o primeiro estudo em 20029 e vários protocolos já foram publicados. No entanto, esses métodos envolvem separar a cabeça de mosca do corpo10,restringindo severamente os movimentos e/ou respostas da mosca aos estímulos11,12,13,14,15, ou apenas permitindo um pequeno parte do cérebro a ser imageado9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Para complementar essas abordagens, no entanto, poderosas, desenvolvemos recentemente uma preparação para imagem de todo o cérebro durante o comportamento e respostas a vários estímulos28.
Aqui, baseamos neste estudo para apresentar um método especificamente desenvolvido para imagem de todo o cérebro enquanto a mosca executa comportamentos seminat naturalistas (ou seja, caminhada e preparação) e responde a estímulos sensoriais. Isso é conseguido usando um suporte de observação projetado para dar acesso a todo o cérebro a partir do lado dorsal-posterior, deixando as antenas e proboscis intactas, e permitindo que a mosca mova suas pernas para andar (por exemplo, em uma bola amortecida a ar). Os passos para dissecar a parte de trás da cabeça foram refinados para velocidade, reprodutibilidade e para minimizar seu efeito sobre a viabilidade e mobilidade da mosca.

<table><tbody><tr><td>#5 pinça</td><td>FST by DUMONT</td><td>11252-30</td><td>ponta reta 0,05 x 0,02 mm, Dumoxel, 11 cm de comprimento</td></tr><tr><td>#55 pinça</td><td>FST by DUMONT</td><td>11255-20</td><td>ponta reta 0,05 x 0,02 mm, Inox, 11 cm de comprimento</td></tr><tr><td>30x oculares</td><td>yegren</td><td>WF30-9-30-H</td><td>WF30X/9 Ocular de ponto de olho alto Lente óptica ocular de visão ampla para microscópio estéreo ou microscópio biológico 30X, 30mm sem retículo</td></tr><tr><td>AHOME/UV lanterna</td><td>Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd</td><td>B07V2W9543 (ASIN)</td> <td>365 nm</td></tr><tr><td>Fotoplast Gel / UV Cola</td><td>Dreve Otoplastik GmbH</td><td>44791</td><td>GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>Fita Transparente com Acabamento Brilhante</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH Ciência / Toalhetes de Precisão</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td>11 x 21 cm</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD / Luz do microscópio</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>WF30X/9</td></tr><tr><td>Laqueur para Unhas</td><td>Opi Products Inc., N. Hollywood</td><td>6306585338</td><td>solução</td></tr><tr><td>salina preta: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sacarose threalose</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Werner Dorsch GmbH</td><td>78 621; B07SXCXWFS (ASIN)</td> <td>cabo macio</td></tr><tr><td>Graxa a vácuo</td><td>Dow corning</td><td>0020080 /100 gr</td><td>Moly Kote 111 Composto Graxa Válvula de Graxa Carimbo 100 g</td></tr></tbody></table>

preparando melanogaster de drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Apresentamos um método desenvolvido especificamente para a imagem de todo o cérebro de Drosophila durante comportamentos contínuos, como a caminhada. A fixação e dissecção da cabeça são otimizadas para minimizar seu impacto no comportamento. Isso é conseguido pela primeira vez usando um suporte que minimiza os obstáculos de movimento. A parte de trás da cabeça da mosca é colada a este suporte em um ângulo que permite acesso óptico a todo o cérebro, mantendo a capacidade da mosca de andar, noivo, cheirar, saborear e ver. A parte de trás da cabeça é dissecada para remover tecidos no caminho óptico e músculos responsáveis pelos artefatos de movimento da cabeça. O cérebro de mosca pode ser posteriormente imageado para registrar a atividade cerebral, por exemplo, usando indicadores de cálcio ou tensão, durante comportamentos específicos, como caminhar ou aliciamento, e em resposta a diferentes estímulos. Uma vez que a dissecção desafiadora, que requer uma prática considerável, tenha sido dominada, essa técnica permite registrar conjuntos de dados ricos relacionando toda a atividade cerebral a respostas de comportamento e estímulo.

A preparação descrita acima permite a observação de todo o cérebro sob um microscópio para imagens 3D em larga escala, como fótons clássicos 2 ou microscopia confocal, mas também técnicas mais rápidas, como a folha de luz31 e outras técnicas estruturadas de microscopia de iluminação (revisada em32), ou microscopia de campo leve28.
O acesso a todo o cérebro observando o comportamento e mantendo órgãos sensoriais funcionais permite responder a várias perguntas.
Primeiro, qual é a atividade cerebral geral quando a mosca está em repouso, durante o comportamento, e quando ela responde a estímulos? Como exemplo, incluímos dados obtidos com um microscópio de campo leve mostrando a ativação cerebral durante respostas a estímulos e comportamentos. Por exemplo, no Vídeo 2,uma sonda de cálcio foi expressa em todos os neurônios (nsyb-GAL4 e UAS-syt-GCaMP6s (esquerda) ou UAS-GCaMP6M (direita)) e um sopro de odor foi apresentado. Observe como a preparação permite obter uma visão geral da atividade cerebral durante a resposta ao estímulo. As poderosas ferramentas genéticas em Drosophila podem ser usadas para restringir a expressão desses sensores a subtipos neuronais específicos. No Vídeo 3,restringimos a expressão de um sensor de cálcio a neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos (TH-GAL4, DDC-GAL4 e UAS-GCaMP6M). Observe a forte atividade síncronica sobre o cérebro fortemente correlacionada com a mosca andando, permitida observando todo o cérebro durante o comportamento. Além da atividade de cálcio, outros sinais físicos ou químicos podem ser imagens (utilizando, porexemplo,sensores para tensão28,33, produtos metabolismos34,35 ou neuromoduladores específicos36).
Para entender o papel da atividade cerebral de forma mais especifica, podemos perguntar quais regiões estão envolvidas em que comportamento, resposta a estímulos ou padrões espontâneos de atividade. Os dados podem de fato ser usados como uma tela imparcial para extrair regiões funcionais usando técnicas como análise de componentes principais e análise de componentes independentes. A Figura 9A mostra diferentes regiões funcionais em cores diferentes. A forma e localização das regiões funcionais permitem mapeá-las para modelos anatômicos para identificar regiões cerebrais e, em alguns casos, tipo de neurônio. Além disso, uma vez alinhados ao modelo anatômico, os valores de fluorescência podem ser mediados em regiões cerebrais anatômicas para análise quantitativa (ver Figura 9B). Por exemplo, um modelo gaussiano hierárquico aplicado aos dados na Figura 9B mostra que as regiões são mais ativas durante a caminhada (com uma mediana ΔF/F de 0,029, Intervalo 95% crível=[0,017 0,041]) mas não durante o noivo (mediana ΔF/F = -0,0049 com intervalo 95% crível=[-0,016 0,0059]).
Somando-se à profundidade de compreensão, as gravações simultâneas das diferentes regiões funcionais permitidas pela preparação podem ser utilizadas para estudar as propriedades dinâmicas da rede funcional. Isso é importante porque as regiões cerebrais em todos os cérebros estudados até agora são altamente recorrentemente interconectadas e cada vez mais estudos mostram que mesmo áreas sensoriais respondem ao estado comportamental do animal. Vários aspectos podem ser analisados, como propriedades de gráficos funcionais (por exemplo, módulos) e padrões espáteris-temporais que podem ser adequados com sistemas dinâmicos (ver8 por exemplo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig01.jpg"> Figura 1: Preparando o titular (passo 1). A) Design do suporte (vista a partir da parte superior). B) Preparação do slot do pescoço. topo: design de fita, fundo: lâminas paralelas usadas para cortar a ranhura do pescoço. C) Vista do suporte de baixo. D) Vista inferior indicando onde adicionar a fita do entalhe do pescoço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig02.jpg"> Figura 2: Preparativos adicionais (etapa 1). A) Adicione graxa na fenda do pescoço para evitar a cola para cobrir a parte de trás da cabeça e evitar vazamentos salinos. Barras de escala, 1 mm. B) Topo: forma da peça de fita que será usada para empurrar o corpo para baixo. Inferior: certifique-se de que a fita se encaixa no suporte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig03.jpg"> Figura 3: Colocação de uma fita em forma de V para auxiliar o centro. (A) Vista inferior. (B) Vista superior. Barra de escala, 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig04.jpg"> Figura 4: Coloque a mosca (passo 2). À esquerda, use dois fórceps maçante para colocar o corpo para que o pescoço esteja na fenda do pescoço. No meio, alinhe a cabeça. Os olhos estão em ambos os lados nas bordas da fenda. A cabeça da mosca está reta. Certo, coloque a mosca com um tecido coberto de gelo para evitar que ela se mova. Barra de escala, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig05.jpg"> Figura 5: Fixar a cabeça (passo 3). A) Ângulo ideal da cabeça. B) Adicione cola UV ao redor da cabeça, evitando áreas sensoriais de interesse. Barra de escala, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig06.jpg"> Figura 6: A ponta do proboscis e as antenas podem ser mantidas livres de cola (passo 3). O círculo branco indica a área onde a cola UV foi aplicada. A seta mostra quais partes são deixadas livres de cola para experimentos olfativos e gustativos. Observe a fita opcional que impede que as pernas toquem na área da cola. Barra de escala, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig07.jpg"> Figura 7: Coloque a fita traseira (passo 4.2). A fita criada na etapa 1 (ver Figura 2, esquerda) é usada para colocar o corpo e cobrir o grande orifício no suporte. Barra de escala, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2.jpg"> Figura 8: Etapas de dissecação (etapa 6). A-B) Corte em cada lado na base do triângulo escuro (cruzes) e remova esta parte da cutícula C). D) e E) removam o músculo 16. Em seguida, remova suavemente o resto da cutícula F, os sacos de ar G), e músculos. H) Cabeça dissecada. Barra de escala, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig09.jpg"> Figura 9: Resultados representativos. A) Regiões funcionais (extraídas usando PCA e ICA como em28) para uma mosca expressando GCaMP6 pan-neuronalmente imagens com um microscópio de campo leve (25x, NA=0,95 com uma matriz de lentes de microsetos f/12 correspondente). Barra de escala, 100 μm. B) Atividade média de cálcio em grandes regiões cerebrais durante respostas a estímulos e comportamento (reproduzido a partir de28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Movimentos musculares 16 (passo 6.3). A GFP foi expressa em músculos. Observe o movimento de bombeamento que vem do orifício logo acima da traqueia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Muscle16_Movie.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Atividade pan-neuronal de cálcio durante a resposta ao odor para duas preparações diferentes. Vinagre balsâmico foi soprado na mosca. A atividade pan-neuronal de cálcio (driver nsyb-GAL4, UAS-syt-GCaMP6s esquerda e UAS-GCaMP6M à direita) foi imagem com um microscópio de campo leve (25x, NA=0,95 com uma matriz de microlens f/12 correspondente). As imagens de campo de luz foram então reconstruídas como descrito no ref.28,37. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/B9_B10CombinedStacks.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Atividade de cálcio em um subconjunto do tipo neurônio durante o comportamento. GCaMP6 foi expresso em neurônios dopaminérgicos e serotoninérgicos (com TH-GAL4 e DDC-GAL4). Em combinação com as ferramentas genéticas da mosca, a preparação permite observar um forte aumento da atividade em muitas regiões durante a caminhada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Video3.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Material Suplementar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/FlyHolderVJove.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Apresentamos um método especificamente adaptado para a imagem de todo o cérebro da Drosophila adulta durante o comportamento e em resposta a estímulos. A cabeça está posicionada para permitir acesso óptico a todo o cérebro, enquanto a mosca pode mover suas pernas e antenas, a ponta do proboscis, e os olhos podem receber estímulos sensoriais.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Nosso protocolo permite a imagem de todo o cérebro de mosca durante o comportamento, o que é importante para entender como os neurônios em diferentes áreas cerebrais interagem para moldar o comportamento. Ao contrário de outros protocolos publicados, este foi desenvolvido especificamente para acessar todo o cérebro enquanto a mosca está se comportando e sentindo por um cheiro, paladar ou estimulação visual. Para criar um slot para a cabeça.Depois de imprimir o suporte com uma impressora 3D, coloque um pedaço de fita adesiva retangularmente sobre uma superfície plana sob um microscópio estéreo. E corte cerca de cinco milímetros por um centímetro de peça. Use dois bisturis fixados juntos em paralelo para cortar uma ranhura de 400 por 400 micrômetros no meio do lado mais longo da fita, e coloque a fita sobre o lado liso do orifício na parte inferior do suporte.Use fórceps para empurrar a fita aproximadamente 500 micrômetros ao redor do buraco. E use esmalte preto para cobrir a parte superior da fita e o suporte. Depois de deixar o esmalte secar por pelo menos uma hora use um tecido enrolado para adicionar aproximadamente um microliter de graxa à ranhura da cabeça.Para preparar a ranhura do corpo, corte um pedaço de fita larga de aproximadamente dois centímetros em dois pedaços e corte fatias de 1,5 milímetros de largura. Em seguida, corte uma ranhura de ombro e corpo de 0,3 milímetros e certifique-se de que a fita se encaixa no suporte. Para fixar uma mosca no suporte, primeiro coloque um recipiente raso com gelo sob o microscópio dissecando, e coloque o suporte de cabeça para baixo sobre um pedaço de tecido de laboratório colocado sobre o gelo.Aspirar uma fruta fêmea de um a quatro dias de idade voar de sua vil, e soprar a mosca em gelo des fundição. Quando a mosca parar de se mover use fórceps Dell para agarrar a mosca na base das asas, e deslize a mosca para dentro do suporte com o pescoço dentro da fenda. Os olhos devem estar igualmente posicionados em ambos os lados da ranhura.Se necessário, adicione um microliter de graxa na parte superior da cabeça para evitar que a cola atinja a parte de trás da cabeça. Em seguida, cubra o corpo com um tecido e um pouco de gelo para garantir que a mosca não se mova. Para fixar a cabeça, coloque-a em um ângulo de aproximadamente 20 graus a partir de uma visão totalmente posterior.E use um tecido enrolado para aplicar cola UV ao redor da cabeça, evitando sujar a área sensorial de interesse. Para experimentos de sabor, use fórceps para retirar os proboscis e adicionar cola na base proboscis para evitar o movimento. Se nenhum experimento de gosto for planejado empurre e cole o proboscis na cabeça.Cure a cola com luz UV por cinco segundos, e use um tecido enrolado para limpar cuidadosamente as áreas ao redor da cabeça, para remover qualquer cola líquida restante que possa grudar nas pernas e portas do solo, áreas sensoriais. Em seguida, use uma fina tira de fita ou um tecido para mover as pernas para a frente, conforme necessário. Para posicionar o corpo, remova o recipiente de gelo e gire o suporte.Remova a água ao redor da mosca e atuando rapidamente antes que a mosca se recupere da anestesia coloque a fita do slot do corpo sobre o buraco e empurre suavemente o corpo da mosca para baixo, tomando cuidado para não esticar demais o pescoço. Cubra quaisquer furos grandes restantes com fita adesiva e adicione aproximadamente um microliter de graxa na parte de trás da cabeça, para evitar que a cola grude naquele local. Use um tecido enrolado para pintar cola UV ao redor do tórax e em cima da fita e do tórax, e cure a cola com luz UV por aproximadamente cinco segundos.Remova cuidadosamente qualquer graxa e cola não cicatrizada com um tecido de laboratório e adicione aproximadamente um mililitro de soro fisiológico ao topo da cabeça. Use fórceps para afastar quaisquer bolhas de ar e verificar se há vazamentos colocando um deslizamento de cobertura sobre o soro fisiológico e girando o suporte ao redor para verificar se há soro fisiológico na parte frontal. Se for observado soro fisiológico, remova o soro fisiológico e fixe o orifício com mais cola ou mais graxa.Para dissecar a cabeça selecione a ampliação mais alta e use fórceps muito finos afiados para fazer dois cortes na base do triângulo de cutícula escura central em cada lado do pescoço. Corte ao redor do triângulo escuro, e remova esta parte da cutícula. O músculo 16 e o esôfago devem ser visíveis através deste buraco e movendo-se ritmicamente.Use os fórceps muito finos para beliscar cuidadosamente a parte superior desta área para cortar o músculo 16 sem perfurar o esôfago. Se o movimento rítmico parar o músculo 16 provavelmente foi removido. Quando o músculo tiver sido extirpado a partir da borda medial da região do triângulo escuro, use os fórceps como um par de tesouras para cortar cuidadosamente e remover a cutícula restante em pequenos pedaços.Em seguida, use os fórceps para agarrar e lentamente e constantemente puxar um saco de ar de cada vez. Neste vídeo, uma sonda de cálcio foi expressa em todos os neurônios desses dois cérebros de moscas-das-frutas. E um sopro de odor foi apresentado.Neste experimento, a expressão do sensor de cálcio foi restrita a neurônios dopaminérgicos e serotonérgicos. Observe a correlação apertada entre a forte atividade síncroca sobre o cérebro e o comportamento de caminhada das moscas ilustrando como todo o cérebro pode ser observado durante um comportamento específico. Utilizando a análise de componentes princípios e a análise de componentes independentes diferentes regiões funcionais destacadas em cores diferentes podem ser extraídas.A forma e localização das regiões funcionais permite que as regiões sejam mapeadas em modelos anatômicos. Para identificar regiões cerebrais e, em alguns casos, tipos de neurônios. Uma vez alinhados aos valores de fluorescência do modelo anatômico apropriado podem ser mediados dentro de regiões cerebrais anatômicas específicas para análise quantitativa.Por exemplo, nesta análise podemos observar que todas as regiões são mais ativas durante a caminhada do que durante o preparo. Seja paciente. Aprender essa técnica de dissecção cardíaca é difícil.No meu laboratório, as pessoas precisam, em média, de três a quatro meses antes de dominá-lo e obter suas primeiras preparações úteis. Seguindo este protocolo, podemos registrar atividade cerebral em larga escala usando um microscópio de fluorescência. Métodos rápidos, como microscopia de campo leve, são particularmente indicados.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Este vídeo descreve um método de montagem de cérebros intactos de moscas adultas sob uma lâmina de ponte e mostra o protocolo realizado em cérebros imunomarcados para microscopia fluorescente.

Montagem de cérebros de Drosophila adulta: um método para preparar lâminas para imagens confocais

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o cérebro adulto de Drosophila – um procedimento necessário para visualizar o órgão, que é obscurecido pela cutícula, olho e tecido traqueal. O protocolo de exemplo mostra uma demonstração detalhada produzindo preparações de alta qualidade que podem ser usadas para imunocoloração e métodos de imagem em neurobiologia de Drosophila.

drosófila Dissecção do cérebro adulto: um método em neurobiologia de moscas

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de um cérebro transgênico de Drosophila para imagens de células gliais de células únicas. O cérebro expressa proteínas direcionadas à membrana fundidas com diferentes combinações de epítopos antigênicos sob o controle de um sistema de recombinase específico da glia. Os cérebros isolados e fixados são corados com anticorpos primários específicos para os epítopos antigênicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo.

Coloração por imunofluorescência de cérebros de Drosophila para a imagem de célula única de células gliais

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Uma barreira significativa para o estudo da atividade celular durante processos cognitivos como aprendizado e memória é o uso de anestésicos para preparação de imagens in vivo . A anestesia prejudica a memória de curto prazo e a cognição em vários modelos, incluindo Drosophila. Este estudo apresenta um método único para preparar Drosophila adulta para imagens in vivo sem anestesia.

In vivo Imagem da atividade neural em moscas adultas Drosophila não anestesiadas

Aprenda a preparar Drosophila melanogaster adulta para imagem cerebral inteira durante comportamentos e estímulos sensoriais. Este método permite visualizar atividade neuronal em tempo real enquanto a mosca caminha e responde a odores.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

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