Caracterização e Previsão Funcional de Bactérias em Tecidos Ovarianos
23 de outubro de 2021
A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento do gene RNA ribossômico 16S (gene 16S rRNA) foram realizados a fim de descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerígenos in situ. As diferenças composicionais e funcionais das bactérias foram previstas pelo uso do BugBase e da Investigação Filogenética das Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt).
Este protocolo é projetado para descobrir bactérias em tecidos ovarianos e prever suas funções. A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento de rRNA 16S foram usados para descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerosos in situ. A compensação e as diferenças funcionais das bactérias são previstas pelo uso de BoPs e investigação celular-genética das comunidades por meio da reconstrução de dias não observados.
Nosso protocolo visa extrair bactérias de tecidos ovarianos in situ. Também pode ser usado para descobrir bactérias em tumores de qualquer tipo. As principais vantagens do nosso protocolo são que é fácil e conveniente, que pode ser realizado em quase todos os laboratórios.
Também é rápido obter os resultados. Durante a prática no protocolo, é importante excluir qualquer bactéria fora do local tecidos tumorais. Assim, todos os procedimentos neste protocolo precisam ser estéreis.
Durante a cirurgia, separam os ovários ressecados em amostras de tecido de aproximadamente um centímetro de espessura com um par de novas pinças estéreis. Evite tocar em qualquer outra coisa durante todo o procedimento. Após a separação, remova a amostra em um tubo estéril e coloque-a em nitrogênio líquido para transmissão.
Preservar amostras em menos 80 graus Celsius. Fixar tecidos por formalina, e depois incorporá-los por parafina. Este protocolo pode ser pausado aqui.
Os tecidos podem ser mantidos em temperatura ambiente para maior preservação. Para operar outras etapas, corte as amostras em cinco seções de série de micrômetros. Então, seque as amostras.
Faça de parafina e reidratação para as amostras. Para recuperar o antígeno, é necessário um tratamento de micro-ondas de 10 minutos no buffer EDTA. Mergulhe as amostras em PBS que contém 0,3% de hidrogênio.
Peroxidize por 20 minutos para parar a atividade peroxidase endógena. Realize o anticorpo EMA no núcleo LPS, com uma concentração de 1 sobre 300. E mantê-lo por uma noite a quatro graus Celsius.
Para descobrir as bactérias, empregue um kit de substrato DAP para detectar a existência de HRP. Baseando-se nas instruções do fabricante, use polímero HRP, anticorpo anti-coelho. Use o concentrador de mesa para deixar o anticorpo totalmente combinado.
Use PBS para eliminar anticorpos não combinados. Faça sua coloração química de acordo com as instruções do fabricante e depois lave as amostras debaixo d'água. Faça desidratação nas amostras.
Terno amostras assinando. E insira como uma amostra usando a imagem Pro Plus Prepare biblioteca com base no protocolo do fabricante. Pratique o padrão primer, que consiste nas sequências específicas do gene e nas sequências de nucleotídeos de saliência do adaptador de Illumina.
Para amplificar as taxas de natalidade para a região V4 de 16 bactérias em sequências genéticas rRNA, amplifique o modelo da entrada da amostra de DNA usando amplicon PCR. Use contas magnéticas Mag-Bind RxNPure Plus para remover a mistura de reação do produto PCR. Realize a amplificação pcr indexada pela segunda vez.
Use o Agilent 2200 TapeStation para verificar a biblioteca. Use o sistema DSDNA QuantiFluor para quantificar a biblioteca. Com um ciclo de 600, a célula de fluxo padrão V3 produz aproximadamente 100.000 extremidades emparelhadas.
2 vezes 300 base 3. Bibliotecas são desnormalizadas, agrupadas e sequenciadas. As taxas brutas de cada amostra são filtradas com base na qualidade de sequenciamento pela Trimmomatic.
As sequências de primer e adaptador devem ser removidas. Leituras de sequência com par e qualidades inferiores a 25 devem ser encurtadas. Analise o rRNA 16s pelo pacote de software QIIME.
Reúna sequências para formar OTUs com um corte de similaridade em 97% Para os OTUs, a abundância relativa deve ser calculada em cada amostra. Empregue um classificador bayesiano, que está no conjunto de treinamento RDP para classificar todas as sequências. Com dado OTU, uma classificação que tem a maior coerência das sequências é atribuída às OTUs.
As OTUs estão alinhadas ao banco de dados de Silva, baseando-se em informações de grupo amostral. Realize a diversidade alfa e a análise principal de coordenadas baseada na UniFrac. Para prever a apresentação das características das bactérias, use o BugBase.
Prever a composição funcional de um metagenome no PICRUSt. Com o uso de dados de monitoramento e um banco de dados contendo genomas de referência, analise as diferentes funções entre cada grupo com a ajuda do software STAMP. Use um software estatístico para calcular o resultado.
A indicação de significância estatística deve ser definida como p inferior a 0,05. Calcular fatores de confusão, que incluem idade e paridade, pelo teste t do Aluno. Calcule o estado da menopausa, histórico de hipertensão e diabetes pelo teste qui-quadrado.
Calcule o número de taxas de bactérias do ovário pelo teste mann-whitney u. 16 pacientes foram inscritos neste estudo. BugBase foi usado para praticar análises de metagenomes previstos.
A potencialmente patogenética e imunohistoquímica dos ovários usando anticorpo LPS antibacteriano. Este número mostra riqueza bacteriana e diversidade nos grupos de câncer e controle. Revelado pelo sequenciamento de rRNA 16S.
Os números são de índice de espécies observados. Índice Chao1, índice ACE, Índice Shannon, Índice de Evenness, Índice Simpson, respectivamente. A abundância relativa de filos e as 12 espécies bacterianas mais abundantes nas amostras ovarianas é mostrada nesta figura.
Figura A, B, C e D.Significa a abundância relativa do painel nos ovários dos pacientes do grupo controle e do grupo de câncer de ovário. As abundâncias relativas das doze espécies de bactérias mais abundantes nos ovários dos pacientes de controle e do grupo de câncer de ovário. Este é o mais comum, agrupado usando PCoA e a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata.
A Figura A mostra os mais comuns, que foram agrupados usando PCoA. PC1 e PC2 são plotados em x e no eixo y. O bloco vermelho é igual à amostra do grupo de câncer de ovário.
O círculo azul é igual a uma amostra no grupo de controle. As amostras do grupo de câncer de ovário podem ser separadas de outras amostras do grupo controle. A Figura B mostra os mais comuns que foram agrupados usando PCoA.
PC1 e PC2 são plotados no eixo x e y. O bloco vermelho é igual a uma amostra no grupo de câncer de ovário. O círculo azul sólido é igual a uma amostra do paciente com mioma uterino.
E o círculo oco azul é igual a uma amostra de um paciente com adenomiose uterina. A Figura C mostra a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum. A figura D é a tumocina vacuolata.
Este número é a análise bugbase da metagenômica prevista. O fenótipo potencialmente patogenético e oxidativo de tolerância ao estresse dos ovários no grupo do câncer foi mais forte do que o do grupo controle. Este número é significativamente diferente do espaço de caminho KEGG entre os grupos de câncer e controle pela análise PICRUSt.
Quando tivermos nossas amostras, um par de novas pinças estéreis são necessárias. Preste atenção à contaminação potencial das amostras. Que as bactérias fora do local podem afetar muito a resolução.
Definir o grupo de controle para cada etapa é preferível. A fim de reduzir o efeito da contaminação potencial.
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Visão Geral
Este protocolo foi projetado para descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerosos e não cancerosos in situ. A coloração por imuno-histoquímica e o sequenciamento de 16S rRNA são utilizados para prever as diferenças composcionais e funcionais das bactérias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Oncologia
- Imunologia
Fundo
- Entender a composição bacteriana nos tecidos ovarianos pode fornecer insights sobre a biologia do câncer.
- A coloração por imuno-histoquímica permite a visualização de bactérias em amostras de tecido.
- O sequenciamento de 16S rRNA é uma ferramenta poderosa para identificar espécies bacterianas.
- Ferramentas preditivas como BugBase e PICRUSt podem inferir funções bacterianas com base em suas informações genéticas.
Propósito do Estudo
- Extrair e identificar bactérias de tecidos ovarianos.
- Comparar populações bacterianas em tecidos cancerosos versus não cancerosos.
- Prever os papéis funcionais das bactérias identificadas.
Métodos Utilizados
- Coloração por imuno-histoquímica para visualização do tecido.
- Sequenciamento do gene 16S rRNA para identificação bacteriana.
- BugBase para prever composição bacteriana.
- PICRUSt para prever diferenças funcionais entre bactérias.
Principais Resultados
- Identificação de populações bacterianas distintas em tecidos ovarianos cancerosos e não cancerosos.
- Previsões funcionais indicam diferenças nas capacidades metabólicas entre os dois tipos de tecido.
- O protocolo é adaptável para uso com vários tipos de tumor.
Conclusões
- Este estudo fornece uma estrutura para entender o papel das bactérias no câncer ovariano.
- Os métodos são acessíveis e podem ser implementados na maioria dos laboratórios.
- Pesquisas adicionais podem explorar as implicações dessas comunidades bacterianas na progressão do câncer.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
