Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat
20 de outubro de 2020
Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.
Como a Thermobia domestica é um inseto basal, os estudos genéticos sobre esta espécie iluminarão os mecanismos subjacentes à evolução das principais inovações em insetos, como o voo motorizado e as metamorfoses. Este protocolo abrange técnicas básicas desde a manutenção da cultura até a microinjeção de ovos para implementar a Thermobia como uma espécie modelo de laboratório. Este método também pode ser usado para aplicação de outras ferramentas genéticas, como knockdown de genes mediado por RNI e transgênese em termobia.
Mantenha o tipo selvagem e as populações mutantes em um grande recipiente de plástico com comida de peixe artificial regular, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para botar ovos. Mantenha todas as culturas de T.domestica dentro de incubadoras de 37 graus Celsius e defina a umidade relativa dentro de cada recipiente para 60 a 80% Para preparar as colônias de coleta de ovos, transfira cerca de 20 machos e 20 fêmeas adultas para um recipiente de tamanho médio com comida, um suprimento de água, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para postura de ovos. Estabeleça várias colônias para obter um grande número de embriões estadiados em um curto período de tempo.
No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por algodão novo. Oito horas depois, colete os ovos do algodão em camadas, separando-as usando uma pinça. Alinhe os ovos na fita dupla-face usando um pincel úmido, mantendo uma distância de dois milímetros entre os ovos.
Todos os ovos devem ser orientados de modo a que o eixo longitudinal de um ovo esteja virado para o lado da injeção. Pressione suavemente os ovos com um pincel para segurar firmemente durante a injeção. Carregue dois microlitros da solução de gRNA CAS9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador.
Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, bata na agulha para remover as bolhas. Otimize a forma da ponta da agulha quebrando-a levemente com uma pinça para evitar entupimentos e obter melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções.
Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução. Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo do formato da ponta da agulha. Mantenha os ovos injetados em um recipiente de tamanho apropriado com 60 a 80% de umidade relativa a 37 graus Celsius.
Verifique os ovos injetados periodicamente e descarte os ovos danificados para evitar o crescimento de fungos. Se houver muito fungo crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de etanol. Antes de chocar, mergulhe a lâmina de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita dupla-face.
Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira as lâminas de vidro revestidas a pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado. Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou pincel.
Manter o fornecimento de ração artificial regular para peixes. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior com suprimento de água para uma umidade de 60 a 80% Aperte e puxe um cerco de uma ninfa ou adulto usando uma pinça e colete-os em um tubo de 0,2 mililitro contendo 50 microlitros de etanol. Armazene as amostras coletadas a 20 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo.
Coloque os tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 graus Celsius para evaporar o etanol. A injeção do complexo ribonucleoproteico gRNA CAS9 em embriões nas primeiras oito horas após a postura dos ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialélicas em algumas células da geração injetada e fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos.
Quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA projetado para atingir o gene branco, 32,6% das ninfas G0 exibiram uma perda parcial de pigmentação em seus olhos compostos e regiões dorsais. A avaliação da transformação germinativa de adultos G0 e indivíduos G1 mutados foi feita por PCR genômica seguida de um ensaio de mobilidade hetero duplex. Nas amostras G1, os padrões de bandas diferenciais entre o tipo selvagem e as amostras mutadas são claramente distinguíveis.
A edição do genoma em Thermobia fornece uma abordagem sólida para analisar os mecanismos genéticos subjacentes às características prematuras dos insetos. Ajuda a explorar os segredos por trás de seu sucesso excepcional e do nosso.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo abrangente para criação e microinjeção de ovos do traça-do-fogo Thermobia domestica, facilitando a geração e manutenção de linhagens mutantes por meio de edição genômica. Os métodos descritos aumentarão o uso de Thermobia como espécie modelo em laboratório para estudos genéticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética
- Biologia de Insetos
- Protocolos de Laboratório
Contexto
- Thermobia domestica é uma espécie de inseto basal.
- Estudos genéticos nessa espécie podem revelar informações sobre a evolução dos insetos.
- Inovações-chave nos insetos incluem o voo autopropelido e a metamorfose.
- Este protocolo auxilia na aplicação de ferramentas genéticas em Thermobia.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer Thermobia domestica como organismo modelo para pesquisa genética.
- Fornecer uma metodologia detalhada para microinjeção em ovos.
- Facilitar a manutenção de populações selvagens e mutantes.
Métodos Utilizados
- Manutenção de cultivo em recipientes plásticos grandes.
- Microinjeção de ovos para edição do genoma.
- Alimentação regular com ração artificial para peixes.
- Estabelecimento de condições ambientais em 37°C e umidade de 60-80%.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de colônias reprodutivas para coleta de ovos.
- Geração eficiente de embriões em estágios definidos para pesquisa.
- Manutenção de linhagens selvagens e mutantes.
- Aplicação de ferramentas genéticas para estudos adicionais.
Conclusões
- Thermobia domestica é um modelo promissor para estudos genéticos.
- O protocolo descrito aumenta a viabilidade da manipulação genética.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esses métodos para obter insights evolutivos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A edição do genoma em Thermobia domestica permite a investigação funcional da genética em um modelo de inseto basal, apoiando linhas de pesquisa em biologia evolutiva e desenvolvimental. Os passos robustos do protocolo, envolvendo microinjeção e manejo da colônia, facilitam a geração reprodutível de linhagens mutantes, ampliando o conjunto de ferramentas para sistemas modelo não tradicionais. Essa capacidade fortalece a descoberta inicial e a validação de alvos em portfólios de biologia de insetos e genômica comparativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o teste direto da função gênica em uma linhagem basal de insetos.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao esclarecer as relações entre genes e fenótipos.
- Facilita a exploração orientada por hipóteses das inovações evolutivas.
- Oferece uma plataforma para a validação funcional de alvos em organismos não-modelo.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Estabelece protocolos padronizados para microinjeção de embriões e geração de mutantes.
- Fornece resultados fenotípicos quantitativos e reprodutíveis para análises posteriores.
- Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem genética.
- Permite gerenciamento escalável de colônias para estudos de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estudos comparativos de função gênica entre táxons de insetos.
- Apoia a continuidade do manejo genético até a avaliação fenotípica.
- Oferece uma base para a descoberta translacional de biomarcadores em contextos evolutivos.
- Reduz os riscos na seleção de modelos pré-clínicos ao ampliar as ferramentas genéticas disponíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se ao continuum de descoberta, desde a manipulação genética inicial até a triagem fenotípica e análise comparativa em modelos de insetos.
- Biologia de Descoberta: Permite testar hipóteses e esclarecer vias em um sistema de inseto basal.
- Triagem: Fornece fenótipos mutantes reprodutíveis para o desenvolvimento e validação de ensaios.
- Análises: Permite avaliação quantitativa dos resultados da edição gênica por meio de PCR e ensaios de mobilidade.
- Pesquisa Translacional: Facilita comparações genéticas entre espécies relevantes para a biologia evolutiva.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo reutilizável adaptável a outros modelos de insetos não tradicionais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de função gênica e hipóteses evolutivas.
- Valor Operacional: Padroniza microinjeção e manejo de colônias para reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir ou não em genômica comparativa e seleção de modelos.
- Impacto no Portfólio: Amplia o leque de modelos de insetos geneticamente manipuláveis para priorização de P&D.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microinjeção e manejo de colônias de insetos.
- Necessita de acesso a incubadoras controladas e infraestrutura para regulação de umidade.
- Requer padronização entre equipes para geração reprodutível de mutantes.
- Pode ser necessária adaptação para outras espécies de insetos com biologia distinta.
- As limitações incluem exigências específicas por espécie no manejo e nas condições ambientais.
