Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat
October 20th, 2020
Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.
Como a Thermobia domestica é um inseto basal, os estudos genéticos sobre esta espécie iluminarão os mecanismos subjacentes à evolução das principais inovações em insetos, como o voo motorizado e as metamorfoses. Este protocolo abrange técnicas básicas desde a manutenção da cultura até a microinjeção de ovos para implementar a Thermobia como uma espécie modelo de laboratório. Este método também pode ser usado para aplicação de outras ferramentas genéticas, como knockdown de genes mediado por RNI e transgênese em termobia.
Mantenha o tipo selvagem e as populações mutantes em um grande recipiente de plástico com comida de peixe artificial regular, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para botar ovos. Mantenha todas as culturas de T.domestica dentro de incubadoras de 37 graus Celsius e defina a umidade relativa dentro de cada recipiente para 60 a 80% Para preparar as colônias de coleta de ovos, transfira cerca de 20 machos e 20 fêmeas adultas para um recipiente de tamanho médio com comida, um suprimento de água, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para postura de ovos. Estabeleça várias colônias para obter um grande número de embriões estadiados em um curto período de tempo.
No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por algodão novo. Oito horas depois, colete os ovos do algodão em camadas, separando-as usando uma pinça. Alinhe os ovos na fita dupla-face usando um pincel úmido, mantendo uma distância de dois milímetros entre os ovos.
Todos os ovos devem ser orientados de modo a que o eixo longitudinal de um ovo esteja virado para o lado da injeção. Pressione suavemente os ovos com um pincel para segurar firmemente durante a injeção. Carregue dois microlitros da solução de gRNA CAS9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador.
Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, bata na agulha para remover as bolhas. Otimize a forma da ponta da agulha quebrando-a levemente com uma pinça para evitar entupimentos e obter melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções.
Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução. Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo do formato da ponta da agulha. Mantenha os ovos injetados em um recipiente de tamanho apropriado com 60 a 80% de umidade relativa a 37 graus Celsius.
Verifique os ovos injetados periodicamente e descarte os ovos danificados para evitar o crescimento de fungos. Se houver muito fungo crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de etanol. Antes de chocar, mergulhe a lâmina de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita dupla-face.
Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira as lâminas de vidro revestidas a pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado. Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou pincel.
Manter o fornecimento de ração artificial regular para peixes. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior com suprimento de água para uma umidade de 60 a 80% Aperte e puxe um cerco de uma ninfa ou adulto usando uma pinça e colete-os em um tubo de 0,2 mililitro contendo 50 microlitros de etanol. Armazene as amostras coletadas a 20 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo.
Coloque os tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 graus Celsius para evaporar o etanol. A injeção do complexo ribonucleoproteico gRNA CAS9 em embriões nas primeiras oito horas após a postura dos ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialélicas em algumas células da geração injetada e fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos.
Quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA projetado para atingir o gene branco, 32,6% das ninfas G0 exibiram uma perda parcial de pigmentação em seus olhos compostos e regiões dorsais. A avaliação da transformação germinativa de adultos G0 e indivíduos G1 mutados foi feita por PCR genômica seguida de um ensaio de mobilidade hetero duplex. Nas amostras G1, os padrões de bandas diferenciais entre o tipo selvagem e as amostras mutadas são claramente distinguíveis.
A edição do genoma em Thermobia fornece uma abordagem sólida para analisar os mecanismos genéticos subjacentes às características prematuras dos insetos. Ajuda a explorar os segredos por trás de seu sucesso excepcional e do nosso.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo abrangente para a criação e microinjeção de ovos do inseto Thermobia domestica, facilitando a geração e manutenção de linhagens mutantes através da edição do genoma. Os métodos descritos aprimorarão o uso de Thermobia como uma espécie modelo de laboratório para estudos genéticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética
- Biologia de Insetos
- Protocolos de Laboratório
Fundamentos
- Thermobia domestica é uma espécie de inseto basal.
- Estudos genéticos nesta espécie podem revelar insights sobre a evolução dos insetos.
- Inovações-chave nos insetos incluem o voo motorizado e a metamorfose.
- Este protocolo suporta a aplicação de ferramentas genéticas em Thermobia.
Propósito do Estudo
- Estabelecer Thermobia domestica como um organismo modelo para pesquisa genética.
- Fornecer uma metodologia detalhada para microinjeção de ovos.
- Facilitar a manutenção de populações de tipo selvagem e mutantes.
Métodos Utilizados
- Manutenção da cultura em grandes recipientes de plástico.
- Microinjeção de ovos para edição do genoma.
- Alimentação regular com ração artificial para peixes.
- Configuração de condições ambientais a 37°C e 60-80% de umidade.
Principais Resultados
- Estabelecimento bem-sucedido de colônias de reprodução para coleta de ovos.
- Geração eficiente de embriões em estágios para pesquisa.
- Manutenção de linhagens tanto selvagens quanto mutantes.
- Aplicação de ferramentas genéticas para estudos adicionais.
Conclusões
- Thermobia domestica é um modelo promissor para estudos genéticos.
- O protocolo descrito aumenta a viabilidade da manipulação genética.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esses métodos para insights evolutivos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Genome editing in Thermobia domestica enables functional genetic interrogation in a basal insect model, supporting evolutionary and developmental biology pipelines. The protocol's robust microinjection and colony management steps facilitate reproducible generation of mutant strains, expanding the toolkit for non-traditional model systems. This capability strengthens early discovery and target validation for insect biology and comparative genomics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function in a basal insect lineage.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of evolutionary innovations.
- Provides a platform for functional target validation in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized protocols for embryo microinjection and mutant generation.
- Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs for downstream analysis.
- Prepares validated biological systems for genetic screening workflows.
- Enables scalable colony management for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with comparative studies of gene function across insect taxa.
- Supports continuity from genetic manipulation to phenotypic assessment.
- Provides a foundation for translational biomarker discovery in evolutionary contexts.
- De-risks preclinical model selection by expanding available genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to phenotypic screening and comparative analysis in insect models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a basal insect system.
- Screening: Provides reproducible mutant phenotypes for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of gene editing outcomes via PCR and mobility assays.
- Translational Research: Facilitates cross-species genetic comparisons relevant to evolutionary biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other non-traditional insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function studies and evolutionary hypotheses.
- Operational Value: Standardizes microinjection and colony management for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in comparative genomics and model selection.
- Portfolio Impact: Expands the range of genetically tractable insect models for R&D prioritization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and insect colony management.
- Needs access to controlled incubators and humidity regulation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible mutant generation.
- Adaptation may be necessary for other insect species with differing biology.
- Limitations include species-specific handling and environmental requirements.
