Name: Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda microinjeção de ovos e manutenção de colônias de Thermobia domestica para edição de genoma. Este protocolo detalhado permite gerar linhagens mutantes e estudar mecanismos evolutivos em insetos basais.

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TO e TD foram apoiados pelos números de subvenção JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999, respectivamente.

1. Manutenção de colônias de laboratório
<ol><li>Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%. NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera11,um fornecimento direto de água não é necessário. O RH apropriado é mantido devido à presença de vapor de água de copos plásticos contendo um orifício de ventilação na parte superior ou de copos sem tampa dentro de cada recipiente. Não há necessidade de umidificar dentro de uma incubadora inteira que contém culturas. A duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento sob a condição descrita neste protocolo é mostrada na Figura 1. A velocidade de desenvolvimento poderia ser ajustada alterando a temperatura e/ou RH12.</li>
	<li>Adicione comida periodicamente. Adicione água antes que se doe.</li>
	<li>Transfira as populações para um novo recipiente limpo pelo menos a cada 3 meses, dado que os adultos param de colocar ovos em um ambiente sujo e/ou população densa (ver Discussão).</li>
</ol>2. Coleta de ovos e microinjeção
<ol><li>Projete um RNA guia (gRNA)<ol>
<li>Projete uma sequência de gRNA para cada alvo necessário e BLAST as sequências de gRNA contra o conjunto do genoma para verificar possíveis locais de reconhecimento fora do alvo.</li>
		<li>Sintetizar e purificar as gRNAs de acordo com as instruções do fabricante8. NOTA: Como exemplo, no caso de direcionar o gene branco do transportador de de ligação ATP, foi projetada uma sequência de alvos de 20 bps e dois oligonucleotídeos de DNA sintetizados 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCACACACACACACTTA-3' foram ordenados. O modelo de DNA foi preparado por annealing esses dois oligonucleotídeos seguidos de amplificação PCR e o gRNA é então in vitro transcrito do modelo com uma polimerase T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare colônias de coleta de ovos<ol>
<li>Transfira cerca de 20 adultos do sexo masculino e 20 do sexo feminino para um recipiente de tamanho médio (200 mm x 150 mm x 90 mm) com alimentos, abastecimento de água, papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para a colocação de ovos(Figura 2B).</li>
		<li>Configure várias colônias para obter um grande número de embriões encenados em um curto período de tempo para serem usados para a edição de genomas. NOTA: Cerca de 20 a 40 ovos devem ser coletados de uma colônia após 8h a 37 °C. Geralmente leva alguns dias para os adultos transferidos começarem a colocar ovos, possivelmente devido à adaptação a um novo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por novos.</li>
	<li>Coloque uma fita de 76 mm x 5 mm de dupla face em uma lâmina de vidro normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Oito horas depois, recolhe os ovos do algodão em camadas separando as camadas usando fórceps.</li>
	<li>Alinhe os ovos na fita de dois lados usando um pincel de tinta molhada e mantenha uma distância de 2 mm entre os ovos. Todos os ovos devem ser orientados para que o eixo longitudinal de um ovo enfrente o lado da injeção(Figura 3A). Pressione suavemente os ovos com uma escova de tinta para segurar firme durante a injeção. NOTA: Neste protocolo, o fungo cresce rapidamente em ovos injetados danificados em condições molhadas e quentes. É importante manter a distância entre os ovos para evitar contaminação cruzada e expansão de fungos.</li>
	<li>Misture a proteína gRNA e Cas9 a uma concentração final de 100 ng/μL e 500 ng/μL, respectivamente. Use água destilada para diluição. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente para promover a formação complexa da ribonucleoproteína e, em seguida, manter a mistura no gelo. NOTA: O vermelho neutro a uma concentração final de 1% pode ser adicionado à solução de injeção para monitorar a quantidade injetada.</li>
	<li>Carregue 2 μL da solução gRNA/Cas9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador. Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, toque na agulha para remover as bolhas. NOTA: Neste experimento, uma agulha pronta é usada para obter uma ponta fina de agulha(Figura 3B). Uma agulha caseira com uma forma semelhante poderia ser usada em vez disso.</li>
	<li>Fixar o capilar de injeção de vidro, previamente carregado com a solução gRNA/Cas9, a um suporte equipado com um manipulador e conectar o suporte a um microinjetor eletrônico.</li>
	<li>Otimize a forma da ponta da agulha, quebrando-a ligeiramente com fórceps para evitar entupimento e melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções (um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 3C). NOTA: Recomenda-se trocar uma agulha quando estiver entupida. É possível continuar injetando com a mesma agulha se for quebrada novamente com fórceps, mas uma ponta mais larga leva a mais danos aos ovos e reduz sua taxa de sobrevivência. Como os ovos T. domestica são macios e frágeis, manter uma ponta fina de agulha é fundamental para ter uma alta taxa de sobrevivência após a injeção.</li>
	<li>Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução (ver Figura 3D-H para referência sobre a quantidade de injeção). Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo da forma da ponta da agulha. NOTA: Recomenda-se aplicar uma pressão constante durante a injeção, caso contrário, o conteúdo de ovos pegajoso pode facilmente fluir para dentro da agulha de vidro e pode entupi-lo. A solução pode ser injetar com um pulso de pressão curta ou com uma pressão constante, dependendo da quantidade de líquido injetado. Tenha em mente que quando uma ponta de agulha tem uma abertura larga, muita solução é injetada em um ovo, o que causa letalidade(Figura 3F-H). Nesse caso, mantenha um fluxo líquido constante por pressão constante, em seguida, insira a agulha em um ovo e puxe-a imediatamente. Se causar muito transbordamento ou o ovo estourar, troque a agulha.</li>
	<li>Mantenha os ovos injetados em um recipiente com o tamanho adequado para o número de ovos injetados (<20 ovos: prato pequeno; >20 ovos: recipiente de tamanho médio) com 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Acasalamento
<ol><li>Verifique periodicamente os ovos injetados e descarte ovos danificados com fórceps para evitar o crescimento fúngico(Figura 3I,J). No caso de muito fungo está crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclodir (aproximadamente 10 dias a 37 °C após a colocação do ovo), mergulhe o deslizamento de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita de dois lados. Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira os slides de vidro revestidos em pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado para esconder os insetos.</li>
	<li>Remova as lâminas de vidro depois que as ninfas chocarem. Forneça periodicamente alimentos até chegarem à idade adulta. NOTA: Leva cerca de 2,0-2,5 meses para os indivíduos chegarem à idade adulta após a eclosão(Figura 1A). A fase adulta é julgada com base em um ovipositor bem desenvolvido em fêmeas(Figura 1B).</li>
	<li>Para acasalar os indivíduos, transfira quantos adultos fêmeas precisam de uma colônia de laboratório para o recipiente de tamanho médio e incuba-os por pelo menos 14 dias a 37 °C para ter certeza de que são virgens. NOTA: Não é necessário coletar fêmeas virgens de uma colônia de laboratório porque a T. domestica adulta tem um ciclo repetido de molting e acasalamento chamado "ciclo reprodutivo e de fusão", durante o qual as fêmeas jogam fora esperma com cada molt e mate novamente no próximo ciclo de fertilização13.</li>
	<li>Transfira um macho ou uma fêmea G0 adulto que se desenvolveu de um ovo injetado e um adulto wildtype(s) para um pequeno prato plástico (Ø 100 mm x 40 mm) com alimentos, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão para a colocação de ovos G1(Figura 2C'; prato de acasalamento). Mantenha os pratos de acasalamento em um recipiente maior com 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Vários adultos selvagens podem ser incluídos em um prato para aumentar a chance de acasalamento bem sucedido, embora altas taxas de sucesso tenham sido alcançadas com um par.</li>
</ol>4. Genotipagem
<ol><li>Design pcr primer pares para cada gRNA para amplificar um produto de 100-200 bp que inclui o site visado pelo gRNA. BLAST cada sequência de primer contra o conjunto do genoma para verificar sua especificidade (um exemplo é mostrado para o direcionamento do gene branco na Figura 4A).</li>
	<li>Verifique a transformação germinal dos adultos G0.<ol>
<li>Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos. NOTA: Recomenda-se genótipo pelo menos 12 ninfas G1 de cada par de acasalamento para avaliar o sucesso da transmissão germinal (ver Resultados Representativos).</li>
		<li>Adicione 15 μL de uma solução Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissolvida em tampão Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneize brevemente amostras com palitos de dente e incubar a 55 °C por 3 a 16 h.</li>
		<li>Inative o Proteinase K colocando as amostras a 95 °C por 10 minutos.</li>
		<li>Adicione 90 μL de água destilada em cada tubo e misture bem. Use 2 μL de supernasário em uma mistura de reação PCR de 10 μL contendo os primers projetados na etapa 4.1. NOTA: Recomenda-se o uso de uma polimerase de DNA otimizada para modelos brutos para atingir amplificação pcr suficiente.</li>
		<li>Para analisar os produtos PCR, realize um ensaio de mobilidade heteroduplex (HMA) com um sistema de eletroforese de microchip(Figura 3B; ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: As mutações podem ser avaliadas com dois métodos alternativos: (1) HMA com polímeros de gel padrão, como 8% poliacrilamida14; (2) digestão de produtos PCR com endonuclease T7 seguida de eletroforese de gel agarose15.</li>
		<li>Mantenha apenas as ninfas G1 resultantes de adultos G0 que contêm mutações em sua germe e descarte as outras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipagem individual de ninfas/adultos do G1<ol>
<li>Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D).. NOTA: Embora esta etapa possa ser realizada em qualquer ponto de estágios ninfais e adultos, recomenda-se realizá-la após atingir a idade adulta e pouco antes do emparelhamento (>2,5 meses após a injeção; Figura 1B) porque é mais fácil manter os focos de incêndio em um recipiente grande. A criação individual é necessária para rastrear o genótipo de cada ninfa G1 nas etapas a seguir. Ninfas G1 do mesmo G0 adulto podem ter mutações diferentes.</li>
		<li>Aperte e puxe cerci e o filamento caudal de uma ninfa/adulto usando fórceps e colete-os em um tubo de 0,2 mL contendo 50 μL EtOH (armazene as amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). NOTA: As amostras de tecido são coletadas em EtOH porque evita a perda dessas pequenas amostras devido à eletricidade estática. Se for preciso parar o movimento dos insetos, anestesia a ninfa/adulto no gelo ao colher amostras de tecido. Como T. domestica não pode sobreviver após o resfriamento a longo prazo no gelo, não anestesia-os por mais de um minuto e imediatamente movê-los de volta à temperatura ambiente. A ablação do cerci e do filamento caudal não causa aumento da mortalidade.</li>
		<li>Coloque tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 °C para evaporar o EtOH.</li>
		<li>Repetir passos 4.2.2-4.2.5 para genotipagem.</li>
		<li>Envie os produtos PCR nos quais um padrão de banda mutante é observado para um serviço padrão de sequenciamento Sanger.</li>
		<li>Mantenha as ninfas/adultos do G1 com as mutações desejadas e descarte as outras (ver Figura 4C para um resultado de sequenciamento representativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruze os adultos contendo as mutações desejadas em um prato de acasalamento e obtenha as próximas gerações para estabelecer uma cepa mutante homozigosa.</li>
</ol>

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<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada moltadulto 13. Um adulto <...

A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas1. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto reprodutivo; Figura 1A) e uma criação fácil. Nas últimas três décadas, seu uso foi expandido para investigar características ancestrais de vários traços, como plano corporal, diferenciação neural e ritmos circadianos2,3,4.
A aplicação de ferramentas genéticas avançadas em T. domestica poderia acelerar ainda mais tais contribuições em uma ampla área de pesquisa. A interferência de RNA bem sucedida (RNAi) mediada por danos genéticos em embriões, ninfas e adultos foi relatada em T. domestica4,5,6. A eficiência do RNAi sistêmico ainda é altamente dependente de espécies — por exemplo, é geralmente alta em coleoptera, enquanto é baixa na ordem lepidoptera7. A eficiência e duração do knockdown rnai em T. domestica ainda está para ser avaliada. Além da RNAi, já reportamos um nocaute genético bem sucedido no CRISPR/Cas9 mediado em T. domestica8. O sistema CRISPR/Cas tem sido amplamente aplicado para edição de genomas em insetos particularmente para nocaute genético direcionado. Seu uso poderia ser expandido para outras aplicações, como ensaio de repórteres genéticos, rastreamento de linhagem celular e manipulação da atividade transcricional, derrubando construções exógenas após o estabelecimento de um protocolo para a entrega de componentes do sistema CRISPR/Cas em núcleos9. Combinado com o conjunto de genomas publicado10,o amplo uso e o desenvolvimento da edição de genoma baseada em CRISPR/Cas em T. domestica facilitaria estudos com foco nos mecanismos evolutivos por trás do excelente sucesso adaptativo dos insetos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para microinjeção de embriões e para acasalamento adulto T. domestica para gerar uma cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Considerando este novo método, discutimos a importância de considerar a biologia única de espécies modelos não tradicionais para aplicações bem sucedidas dessas técnicas.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &micro; g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Limpador antiestático</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>para remover eletricidade estática de uma placa de 24 poços</td></tr><tr><td>Caixa de barreira 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Recipiente grande</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Microinjetor eletrônico</td></tr><tr><td>Femtotip II, capilar de injeção</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Injeção de vidro capilar</td></tr><tr><td>alto pacote 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Incubadora de contêiner de tamanho médio</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>para 37 &deg; C incubação. Não há necessidade de umidificar dentro da incubadora.</td></tr><tr>Enzima do PCR de <td>Toyobo</td><td>KFX-101</td> <td>de KOD Fx Neo</td><td>para a genotipagem. Otimizado para uma amplificação a partir de modelos brutos.</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>para segurar o micromanipulador</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>para microinjeção. A ampliação de mais de 35X é suficiente para a microinjeção</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202 Sistema de</td><td>eletroforese de microchip</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Fita dupla face para colocar ovos em uma lâmina de vidro</td></tr><tr><td>Pincel (crina de cavalo)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura de plantas</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Prato de acasalamento e abastecimento de água para recipientes grandes e médios</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, Liofilizado de grau PCR de Pichia pastoris</td><td>Microscópio</td><td>Roche 3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>Mais de 35X de ampliação é suficiente para a microinjeção</td></tr><tr><td>Pó de talco</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold</td><td>Growth Spectrum Brands</td><td></td><td>Comida de peixe regular artificial</td></tr></tbody></table>

microinjeção de ovos e acasalamento eficiente para edição de genoma na thermobia domestica firebrat

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.

Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA que é p...

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Como a Thermobia domestica é um inseto basal, os estudos genéticos sobre esta espécie iluminarão os mecanismos subjacentes à evolução das principais inovações em insetos, como o voo motorizado e as metamorfoses. Este protocolo abrange técnicas básicas desde a manutenção da cultura até a microinjeção de ovos para implementar a Thermobia como uma espécie modelo de laboratório. Este método também pode ser usado para aplicação de outras ferramentas genéticas, como knockdown de genes mediado por RNI e transgênese em termobia.Mantenha o tipo selvagem e as populações mutantes em um grande recipiente de plástico com comida de peixe artificial regular, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para botar ovos. Mantenha todas as culturas de T.domestica dentro de incubadoras de 37 graus Celsius e defina a umidade relativa dentro de cada recipiente para 60 a 80% Para preparar as colônias de coleta de ovos, transfira cerca de 20 machos e 20 fêmeas adultas para um recipiente de tamanho médio com comida, um suprimento de água, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para postura de ovos. Estabeleça várias colônias para obter um grande número de embriões estadiados em um curto período de tempo.No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por algodão novo. Oito horas depois, colete os ovos do algodão em camadas, separando-as usando uma pinça. Alinhe os ovos na fita dupla-face usando um pincel úmido, mantendo uma distância de dois milímetros entre os ovos.Todos os ovos devem ser orientados de modo a que o eixo longitudinal de um ovo esteja virado para o lado da injeção. Pressione suavemente os ovos com um pincel para segurar firmemente durante a injeção. Carregue dois microlitros da solução de gRNA CAS9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador.Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, bata na agulha para remover as bolhas. Otimize a forma da ponta da agulha quebrando-a levemente com uma pinça para evitar entupimentos e obter melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções.Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução. Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo do formato da ponta da agulha. Mantenha os ovos injetados em um recipiente de tamanho apropriado com 60 a 80% de umidade relativa a 37 graus Celsius.Verifique os ovos injetados periodicamente e descarte os ovos danificados para evitar o crescimento de fungos. Se houver muito fungo crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de etanol. Antes de chocar, mergulhe a lâmina de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita dupla-face.Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira as lâminas de vidro revestidas a pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado. Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou pincel.Manter o fornecimento de ração artificial regular para peixes. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior com suprimento de água para uma umidade de 60 a 80% Aperte e puxe um cerco de uma ninfa ou adulto usando uma pinça e colete-os em um tubo de 0,2 mililitro contendo 50 microlitros de etanol. Armazene as amostras coletadas a 20 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo.Coloque os tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 graus Celsius para evaporar o etanol. A injeção do complexo ribonucleoproteico gRNA CAS9 em embriões nas primeiras oito horas após a postura dos ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialélicas em algumas células da geração injetada e fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos.Quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA projetado para atingir o gene branco, 32,6% das ninfas G0 exibiram uma perda parcial de pigmentação em seus olhos compostos e regiões dorsais. A avaliação da transformação germinativa de adultos G0 e indivíduos G1 mutados foi feita por PCR genômica seguida de um ensaio de mobilidade hetero duplex. Nas amostras G1, os padrões de bandas diferenciais entre o tipo selvagem e as amostras mutadas são claramente distinguíveis.A edição do genoma em Thermobia fornece uma abordagem sólida para analisar os mecanismos genéticos subjacentes às características prematuras dos insetos. Ajuda a explorar os segredos por trás de seu sucesso excepcional e do nosso.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve a microinjeção, um método comum de criação de cepas transgênicas de C. elegans. No exemplo, veremos a microinjeção usada para introduzir um complexo de ribonucleoproteína (RNP) para edição de genes baseados em CRISPR.

Microinjeção de gônadas: um método de entrega de compostos diretamente na linha germinativa de C. elegans

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aprenda microinjeção de ovos e manutenção de colônias de Thermobia domestica para edição de genoma. Este protocolo detalhado permite gerar linhagens mutantes e estudar mecanismos evolutivos em insetos basais.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

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