Name: Detecção precoce de Flores Cianobacterianas e Cianotoxinas Associadas usando estratégia de detecção rápida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda uma estratégia rápida de detecção de florações de cianobactérias e cianotoxinas em amostras de água e organismos aquáticos. Este método integra sensoriamento remoto, drones e análises laboratoriais por LCMS.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" no quadro do projeto "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania", e realizada em cooperação com a Agência de Proteção Ambiental da Região da Campânia, Itália (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Universidade de Nápoles "Federico II" - Departamento de Medicina Veterinária e Produção Animal, ref. Prof. A. Anastasio).

1. Sensoriamento remoto e proximal: aquisição e análise de dados
NOTA: Neste caso, os dados de sensoriamento remoto/proximal são usados para uma primeira pesquisa de macroemárea e para selecionar pontos específicos de áreas costeiras a serem amostrados. No esquema de estrutura MuM317, o fluxo lógico é baseado em um modelo de monitoramento hierárquico que inclui vários níveis chamados camadas de informação. As informações de cada nível são baseadas em dados adquiridos usando um ou mais sensores transportados a bordo de plataformas localizadas em diferentes altitudes. Cada nível define uma escala espacial dependendo da altitude da medição19. Há o potencial para múltiplos sensores em cada nível. Alguns exemplos são: visível perto do infravermelho (VNIR) e imagem infravermelha térmica (TIR)20 em satélites, aeronaves, helicópteros, UAV21 e na superfície; análises físicas, químicas e biológicas, etc.22 na superfície e em resposta rápida usando o laboratório móvel. Os dados adquiridos por cada sensor são processados e combinados para calcular índices multiespectrais (por exemplo, índice de vegetação de diferença normalizada (NDVI), Índice de Água de Diferença Normalizada (NDWI), Índice de Clorofila, etc.), de modo que os dados brutos são convertidos em parâmetros e formatos mais úteis (por exemplo, mapa temático).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3.jpg"> Figura 2: Análises de sensoriamento remoto/proximal para amostragem (etapas 1-2). Abordagem multi-nível e multi-sensor para a detecção de flor cianobacteriana. A aquisição de dados é realizada por satélite (A),aeronaves (B)e/ou drone(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Recuperação de dados de sensoriamento remoto e proximal
	<ol>
<li>Recuperar dados dos vários conjuntos de dados de sensoriamento remoto público e privado, produzidos especialmente para recuperação baseada em conteúdo e classificação de cena. As fontes típicas de conjunto de dados utilizadas nesta etapa incluem: Produtos Landsat fornecidos pelo U.S. Geological Survey23, Sentinel-2,3 produtos fornecidos pela NASA24e Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26.</li>
		<li>Identifique os produtos disponíveis para a área específica, faixa de datas e considere o limite derivado da cobertura da nuvem. Definir: A) a região de interesse usando interface gráfica de usuário e seleção de polígonos; B) a faixa de datas e a cobertura na nuvem usando os campos de filtro de consulta de texto. NOTA: Mesmo que muitos relatórios científicos citem que um valor aceitável de cobertura de nuvens é &lt;20%, neste tipo de pesquisa, é importante prestar atenção à verdadeira cobertura de nuvens apenas na superfície da água, de modo que um valor de eficácia para esta região é &lt;5%.</li>
		<li>Escolha produtos derivados das plataformas que melhor se encaixam nas necessidades específicas da missão. A partir de cada combinação de especificações técnicas de satélite e carga, é possível obter várias coleções de produtos. Por exemplo, os produtos de dados EOSDIS24 da NASA são processados em vários níveis que vão do Nível 0 ao Nível 4: os produtos nível 0 são dados brutos em resolução completa de instrumentos, enquanto em níveis mais altos os dados são convertidos em parâmetros e formatos mais úteis. Normalmente, os Níveis 0-1 estão disponíveis, enquanto os produtos nos Níveis 2-4 precisam de processamento específico relacionado a metas específicas de pesquisa, de modo que sua disponibilidade é limitada no tempo e a região coberta.</li>
		<li>Baixe o conjunto de dados escolhido de observações por satélite. Em detalhes, selecionando entre a lista dos resultados da ação anterior, baixe um produto completo de conjunto de dados (por exemplo, um grupo de arquivos geo-tiff, um para cada banda, mais informações e outros metadados) ou apenas uma única banda específica. NOTA: Para a descrição específica de cada ação básica incluída no procedimento da etapa 1, consulte também Huan-Huan Chen et al. 202027.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-processamento e processamento de dados para análise e transformação em parâmetros e formatos mais úteis para permitir uma primeira triagem da macroárea. NOTA: As seguintes ações (etapa 1.2) são dedicadas ao processamento de dados finalizados para transformar dados brutos provenientes de níveis mais baixos em informações e, em seguida, em informações úteis (níveis mais altos). Esta etapa consiste no processamento dos dados brutos de cada sensor (por exemplo, níveis de produto 0-1) e transformação em produtos de nível superior (por exemplo, Níveis 2-4) e, posteriormente, em camadas de informação para gerar parâmetros e formatos mais úteis (por exemplo, mapa temático).<ol>
<li>Pré-processo dados brutos envolvendo calibração geométrica e radiométrica. Essa ação poderia ser realizada utilizando um software específico que, de forma automática ou semiautomática (não supervisionada ou supervisionada), fornece um conjunto de ferramentas conectadas para processamento de rasteres, a fim de realizar uma classificação fácil respeitando um fluxo de trabalho correto. NOTA: Nesta pesquisa, são utilizadas duas ferramentas de código aberto gratuitas: Q-GIS 3.1428 combinado com Plugin de Classificação semiautomática (SCP). O plugin SCP29 permite a classificação semiautomática de imagens de sensoriamento remoto, fornecendo um conjunto completo de ferramentas para o download de imagens gratuitas, o pré-processamento, o pós-processamento e o cálculo raster.</li>
		<li>Processo calibrado dados calculando índices multiespectrais. Normalmente, essa ação é realizada usando uma ferramenta calculadora raster. O cálculo de um índice multiespectral define uma correlação entre diferentes bandas/camadas que, como resultado, gera uma nova camada que poderia ser gerenciada em uma plataforma GIS. Por exemplo, a partir do sensor operacional land imager (OLI) do Sentinel e Landsat, é possível calcular índices multiespectrais, como o Índice de Vegetação de DiferençaNormalizada (NDVI). O índice de vegetação é então usado para estimar o teor de clorofila30,31.</li>
		<li>Analise os resultados obtidos a partir da estimativa do índice de teor de clorofila representado como em mapas temáticos de cores falsas e defina área crítica com alta concentração de clorofila. Neste estudo, o mapa clorofila-a é gerado usando o conjunto de dados do sensor MODIS32, montado nas plataformas de satélite Terra e Aqua. Os pontos amostrais são localizados onde valores anormais são registrados. NOTA: A bandeira de flor de algas (que define cada ponto específico) é levantada no domínio de sensoriamento remoto quando a concentração de Chl-a excede 20 mg/L33.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Amostragem guiada
NOTA: A escolha dos pontos de amostragem é impulsionada pela análise de camada de sensoriamento remoto/proximal que permite selecionar pontos em grandes áreas costeiras. Levando em conta que a amostragem pode ser perigosa para os operadores devido à toxicidade das microcistinas, são necessários procedimentos de amostragem de segurança. Particularmente, é necessário proteger os operadores da inalação de aerossol e do contato com a pele. Em seguida, realize a amostragem seguindo o procedimento detalhado abaixo.
<ol><li>Use óculos para proteção ocular, máscara FFP2 para evitar inalação de aerossol e luvas de segurança para evitar o contato com a pele.</li>
	<li>Coletar 0,5 L de água em triplicado em cada local.</li>
	<li>Meça a salinidade de cada amostra usando um refratômetro. Coloque uma gota da amostra no refratômetro e leia o valor da salinidade em termos de partes por mil (ppt - ⁄).</li>
	<li>No final da amostragem, primeiro lave as mãos; em seguida, remova as luvas, máscaras e óculos tomando cuidado para não tocar na superfície externa do equipamento de proteção pessoal.</li>
	<li>Leve a amostra para o laboratório em temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Identificação de espécies de cianobactérias por observações microscópicas e identificação taxonômica
<ol><li>Centrifugar cada amostra (≈0,5 L) a 11.200 x g por 5 min.</li>
	<li>Extrair supernantes da seguinte forma: despeje 500 mL de butanol em cada amostra e usando um funil, transfira a mistura para ser extraída no funil separador. Coloque o funil separador ereto no grampo do anel para permitir que ambas as camadas separem. Deixe a fase aquosa drenar em um frasco de Erlenmeyer. Repita este passo três vezes. Em seguida, concentre as fases orgânicas sob vácuo e pese-as.</li>
	<li>Colete pelotas da etapa 3.1 e analise-as a 400x e 1.000x de ampliação com um microscópio óptico equipado com uma câmera digital de 18 MP para microscópio. Procure a presença de cianobactérias com base em suas características morfológicas: cor azul-verde, forma celular e tamanho permitem reconhecer cianobactérias entre outros microrganismos.</li>
	<li>Identificar a espécie através de análise taxonômica por observação microscópica, de acordo com o procedimento descrito em Komarék et al. 201434. NOTA: A análise metagenômica complementar 16S pode ser realizada para identificar a taxacianobacteriana 3.</li>
	<li>Diluir uma alíquota das pelotas com 10 mL de água do mar/água doce bg11 mídia, de acordo com sua salinidade, para cultivo.</li>
</ol>4. Identificação de cianotoxinas
<ol><li>Extração de amostras com solventes orgânicos<ol>
<li>Coloque cada amostra de pelota em um frasco e sonicato por 5 minutos usando um banho de gelo. Em seguida, adicione 50 mL de MeOH fresco e agite suavemente. Filtre a solução usando um filtro de papel e colete o filtrado em um frasco fundo redondo. Repita este passo duas vezes. Em seguida, extraia as pelotas adicionando 50 mL de mistura de MeOH/DCM duas vezes (1:1, 50 mL), e duas vezes usando 100% DCM (x2, 50 mL)35. Rotule cada frasco traseiro redondo, respectivamente, como "extrato de MeOH", "extrato de MeOH/DCM" e "extrato dcm", e concentre-se sob vácuo.</li>
		<li>Analise cada extrato orgânico (MeOH, MeOH/DCM, DCM) por LC-HRMS/MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise LC-HRMS/MS<ol>
<li>Preparação de amostras LC-HRMS e LC-HRMS/MS: dissolver cada amostra usando meoh ≥ 99,9% para obter uma concentração final de 10 mg/mL.</li>
		<li>Analise cada amostra usando um espectrômetro de massa ESI de alta resolução, juntamente com um sistema HPLC (sistema LC-HRMS/MS). Trabalhe no HPLC com uma coluna C18 de 5 μm (100 x 2,10 mm), em temperatura ambiente. Use uma elução gradiente com H2O (suplementado com 0,1% HCOOH) e MeOHat 200 μL min-1. O programa de gradiente é: 10% MeOH para 3 min, 10% a 100% MeOH para 30 min, 100% MeOH para 7 min. Use MeOH como controle.</li>
		<li>Aquisição de dados. Coletar dados no modo de aquisição dependente de dados (DDA): os 10 íons mais intensivos de um espectro de massa de varredura completa devem ser submetidos à análise de espectrometria de massa tandem de alta resolução (HRMS/MS). Adquira varreduras hrms/ms para íons selecionados com fragmentação DE CID, largura de isolamento de 2.0, energia de colisão normalizada de 35, Ativação Q de 0,250 e tempo de ativação de 30 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análises bioinformáticas e redes moleculares<ol>
<li>Analise padrões de fragmentação para cada íon intenso usando software específico de MS.</li>
		<li>Use o MS-Cluster para agrupar os dados (tolerância à massa dos pais de tolerância de íons de fragmentos 1.0 Da e MS/MS de 0,5 Da). Espectros de consenso contendo menos de 2 espectros são eliminados.</li>
		<li>Analisar os dados de MS/MS pelo GNPS (Global Natural Products Social36) para redes moleculares.</li>
		<li>Compare em pares os espectros de consenso e também com os relatados nas bibliotecas GNPS-Mass-Ive.</li>
		<li>Visualize a rede obtida37. NOTA: Para rede molecular, consulte Sigrist et al. 202038.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3.jpg"> Figura 3: Passos em laboratório FDS (3-4). Representação visual das principais atividades realizadas em laboratório após amostragem (etapas 3 e 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+marine+toxins+and+the+associated+seafood+poisoning+episodes+in+the+African+countries+of+the+Indian+ocean+and+the+Red+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea.</a> Toxins. 11 (1), 25-48 (2019).</li>
<li>Lürling, M., Faassen, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+poisonings+associated+with+a+Microcystis+aeruginosa+bloom+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands.</a> Toxins. 5 (3), 556-567 (2013).</li>
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<li>Teta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria+as+indicators+of+water+quality+in+Campania+coasts%2C+Italy%3A+A+monitoring+strategy+combining+remote%2Fproximal+sensing+and+in+situ+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data.</a> Environmental Research Letters. 12 (2), (2017).</li>
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<li>Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cyanobacterial+blooms+to+assess+the+impact+of+wastewaters+discharges+on+coastal+areas+and+lakes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sustainable+Development+and+Planning%22%5BJournal%5D)">Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes.</a> International Journal of Sustainable Development and Planning. 11 (5), 804-811 (2016).</li>
<li>Teta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+molecular+networking+study+of+a%3A+Smenospongia+sponge+and+a+cyanobacterial+bloom+revealed+new+antiproliferative+chlorinated+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Chemistry+Frontiers%22%5BJournal%5D)">A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides.</a> Organic Chemistry Frontiers. 6 (11), 1762-1774 (2019).</li>
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<li>Huisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).</li>
<li>Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+evaluation+of+cyanobacterial+cyclic+peptide+toxin+microcystin+variants+%28LR%2C+RR%2C+YR%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice.</a> Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).</li>
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<li>Savtchenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODIS+data+from+terra+and+aqua+satellites%5BTitle%5D)+AND+%22International+Geoscience+and+Remote+Sensing+Symposium+%28IGARSS%29%22%5BJournal%5D)">MODIS data from terra and aqua satellites.</a> International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).</li>
<li>Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+satellite-derived+chlorophyll+and+algal+bloom+indices+on+Lake+Winnipeg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Great+Lakes+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg.</a> Journal of Great Lakes Research. 44 (3), 436-446 (2018).</li>
<li>Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+classification+of+cyanoprokaryotes+%28cyanobacterial+genera%29+2014%2C+using+a+polyphasic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Preslia%22%5BJournal%5D)">Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach.</a> Preslia. 86, 295-335 (2014).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorinated+thiazole-containing+polyketide-peptides+from+the+caribbean+sponge+smenospongia+conulosa%3A+structure+elucidation+on+microgram+scale%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2016 (16), 2871-2875 (2016).</li>
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<li>Shannon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape%3A+A+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).</li>
<li>Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-guided+genome+mining+as+a+tool+to+uncover+novel+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Durante os últimos anos, nossa equipe testou e validou várias abordagens diferentes que permitiram desvendar a presença de cianobactérias e cianotoxinas em corpos d'água e biválvulas. A nova estratégia desenvolvida representa o resultado desses estudos. As técnicas e tecnologias ideais que se encaixam no escopo da detecção rápida, são reunidas sob o chapéu de um procedimento único que maximiza a eficácia de cada etapa. A área alvo, a extensão da floração e o estágio de crescimento são a força motriz para a escolha de métodos e tecnologias adequados para usar.
Quando a detecção rápida de cianobactérias e cianotoxinas é a prioridade, a estratégia é simplificada reduzindo o número total para quatro etapas principais: (1) Sensoriamento remoto e proximal e análise de dados para um primeiro levantamento, localização de locais e definição de padrão e extensão de floração; (2) Amostragem guiada; (3) Observação microscópica e análise taxonômica; (4) Análise química e rede molecular de dados de LC-MS para desreplicação das amostras de água e detecção rápida de cianotoxinas.
Em relação ao primeiro passo, mesmo que a disponibilidade de dados adquiridos por uma cadeia completa de plataformas que abrangem todas as camadas de abordagem hierárquica de monitoramento seria a melhor solução para ressarcia uma visão completa do cenário analisado, muitas vezes apenas uma camada de informação pode impulsionar a ação de pesquisa da área e efetivamente focar nos pontos quentes para realizar ações de amostragem in situ. De acordo com as experiências relatadas em que os dados foram adquiridos utilizando satélites, aeronaves, helicópteros, UAVs, a solução que corresponde totalmente às necessidades exigidas pela estratégia de detecção rápida é o uso dos únicos produtos de satélite.
Além disso, as camadas de informação que derivam de missões realizadas por plataformas que voam em altitudes mais baixas do que satélites (por exemplo, aeronaves, helicópteros, UAVs) restituem informações com grande resolução, mas estas são muito caras e também requerem mais tempo para concluir todo o processo de aquisição que também inclui definição e aprovação de planos de voo.
Uma vez selecionadas as manchas a serem amostras (etapa 2), análises analíticas/bioinformáticas (rede molecular de dados LC-MS) são a ferramenta para a desreplicação rápida das amostras de água e detecção rápida de cianotoxinas (etapas 3 e 4). A análise metagenômica 16S leva pelo menos 2 semanas de trabalho. Além disso, mesmo quando espécies cianobacterianas que são genericamente tóxicas são identificadas, sua produção de toxinas não é demonstrada. Pela mesma razão, a observação microscópica não é suficiente para revelar a presença de cianobactérias tóxicas. É claro que a análise de ESM e a rede molecular têm algumas limitações; eles são bastante eficazes se compostos de interesse (por exemplo, toxinas) são bem ionizados nas condições aplicadas, se estiverem em quantidade suficiente para serem detectados. Para efeitos da conhecida detecção e monitoramento de toxinas cianobacterianas, a rede molecular baseada em MS representa uma das tecnologias mais robustas e confiáveis.
Portanto, essa abordagem se mostra bastante útil quando é necessária uma detecção rápida de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas; além disso, a quantificação tanto da flor cianobacteriana quanto da toxina sobre o espaço e o tempo também é possível por essa estratégia para prevenir os problemas das comunidades de saúde que poderiam surgir por grandes flores tóxicas cianobacterianas.

As flores cianobacterianas surgiram como um problema ambiental em todo o mundo nos últimos 15 anos1,2. As flores cianobacterianas são devido ao crescimento excessivo de microrganismos chamados cianobactérias. Eles são um grupo notável de microrganismos fotossintéticos que se adaptaram para viver em uma grande variedade de ambientes, incluindo áreas tropicais e águas extremamente frias. Eles são conhecidos por produzir grandes flores que cobrem superfícies da água, especialmente em resposta a um enriquecimento maciço de nutrientes, o chamado processo de eutrofização3.
Portanto, as cianobactérias são excelentes bioindicadores de poluição da água4,5,6. Eles também podem produzir uma ampla gama de compostos naturais com interessantes propriedades farmacológicas7,8. O problema ambiental relacionado às cianobactérias são as próprias flores. As flores podem bloquear a luz solar para gramíneas subaquáticas, consumir oxigênio na água levando a mortes de peixes, produzir escória e odores superficiais e interferir com a alimentação filtrante dos organismos9.
Além disso, e ainda mais seriamente, em uma combinação específica de fatores como temperatura, nutrientes (fósforo e nitrogênio), luz solar (para a fotossíntese) e pH da água, as flores cianobacterianas desencadeiam a produção de toxinas; portanto, eles se tornam prejudiciais para humanos e animais. A classe mais estudada de cianotoxinas é produzida pelo genera Microcystis. Estes são peptídeos cíclicos conhecidos sob o nome geral de microcistinas (MCs): microcistina-LR sendo o mais estudado como capaz de produzir hepatoxicidade grave10. Animais e seres humanos podem ser expostos a MCs por ingestão de água potável contaminada ou alimentos. A Organização Mundial da Saúde (OMS) sugeriu um valor total de microcistina-LR de 0,001 mg/L como diretriz11. No entanto, isso está relacionado apenas a uma variante (ou seja, MC-LR) de mais de 100 microcistinas que foram isoladas até agora.
Métodos combinados relatados anteriormente, como sensoriamento remoto com análise MALDI-TOF MS12,13,14,15, têm focado na detecção de concentração de MCs. Os métodos mais recentes utilizam sensores de baixa resolução que são eficazes na detecção apenas de extensões de flores largas; eles também são capazes de revelar apenas toxinas para as quais os padrões estão disponíveis. Além disso, a maioria desses procedimentos são demorados, e o tempo é um fator dramático para a detecção precoce da florada para prevenir ou minimizar problemas de segurança. A estratégia multidisciplinar aqui proposta proporciona detecção rápida de cianobactérias e cianotoxinas, após apenas 24h16.
No quadro do programa chamado MuM3, "Monitoramento multidisciplinar, Multiesquente e Multi-paramétrico no espaço físico tridimensional (3D) "17,18, uma Estratégia de Detecção Rápida (FDS) combina as vantagens de várias técnicas: 1) sensoriamento remoto para detectar a floração; 2) observação microscópica para detectar espécies de cianobactérias; e 3) análises analíticas/bioinformáticas, ou seja, redes moleculares baseadas em LC-HRMS, para detectar cianotoxinas. Os resultados são obtidos dentro de 24 h.
A nova abordagem é útil para monitorar amplas áreas costeiras em pouco tempo, evitando inúmeras amostrais e análises, e reduzindo o tempo de detecção e os custos. Essa estratégia é resultado do estudo e da aplicação de diferentes abordagens para o monitoramento de cianobactérias e suas toxinas e combina as vantagens de cada uma delas. Especificamente, a análise dos resultados, provenientes do uso de diferentes plataformas (satélite, aeronaves, drones) e sensores (MODIS, infravermelho térmico) para análise de sensoriamento remoto, como de diversas abordagens metodológicas para identificação de espécies cianobacterianas (microscópio, espectroscopia UV-Vis, análise 16S) e toxinas (análise LC-MS, rede molecular), permitiu a seleção do método mais adequado tanto para fins gerais quanto para fins gerais específicos. A nova metodologia foi experimentada e validada em campanhas subsequentes de monitoramento nas costas da Campânia (Itália), no quadro do programa de monitoramento de agências de proteção ambiental da Campânia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3.jpg"> Figura 1: Estratégia FDS. Uma visão geral da Estratégia de Detecção Rápida para cianobactérias e cianotoxinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10X Mistura</td><td></td><td></td> de vitaminas <td>Ácido nicotínico 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotina 1 mg/100 mL; Tiamina 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Ácido Fólico 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantotenato 100 mg / 100 mL</td></tr><tr><td>1-BuOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33065.2.5L-R</td><td></td></tr><tr><td>BG11 solução</td><td></td><td></td> estoque <td>Na2EDTA 20 mg / L; Citrato de amônio férrico 120 mg/L; Ácido cítrico&middot; 1H2O 120 mg/L; CaCl2&middot; 2H2O 700 mg/L, MgSO4&middot; 7H2O 1,5 g/L, K2HPO4&middot; 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4&middot; 6H2O (estoque de 0,1 mM) 5 mL; Na2SeO4 (estoque de 0,1 mM) 2 mL, Solução de Nitsch 20 mL</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Z36HK</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Honeywell</td><td>32211.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kinetex C18 cloumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa ESI de alta resolução LTQ Orbitrap XL acoplado a um sistema HPLC U3000</td><td>Microscópio Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Honeywell</td><td>32213.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>equipado com uma câmera CMOS OMAX de 18 MP&nbsp;</td><td>Câmera Multibanda Optech</td><td>Biostar B3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Intergraph DMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitsch's Solution</td><td></td><td></td><td>H3BO3 0.5 g/L MnSO4&middot; H2O 2,28 g/L ZnSO4&middot; 7H2O 0,5 g/L CuSO4&middot; 5H2O 0,025 g/L COCl2&middot; 6H2O 0,135 g/L Na2MoO4&middot; 2H2O 0,025 g/L</td></tr><tr><td>Refratômero mr 100 ATC</td><td>AQL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWBG11 meio</td><td></td><td></td><td>BG11 solução estoque 50 mL/L; Oceano Instantâneo 33 g/L; Água 950 mL/L 10X; Mistura de vitaminas 100 &micro; L/L</td></tr></tbody></table>

detecção precoce de flores cianobacterianas e cianotoxinas associadas usando estratégia de detecção rápida

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

A detecção rápida de cianobactérias e cianotoxinas é alcançada usando uma Estratégia de Detecção Rápida (FDS). Apenas 24 h são necessários para desvendar a presença de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas em amostras de água e em uma matriz orgânica, como extratos bivalve. O FDS combina técnicas de sensoriamento remoto/proximal com análises analíticas/bioinformáticas. Os pontos de amostragem são escolhidos por meio de monitoramento multidisciplinar, multiesquenista e multi-paramétrico em um espaço físico tridimensional, incluindo sensoriamento remoto. Observação microscópica e análise taxonômica das amostras são realizadas no ambiente laboratorial, o que permite a identificação de espécies cianobacterianas. As amostras são então extraídas com solventes orgânicos e processadas com LC-MS/MS. Os dados obtidos pela MS/MS são analisados usando uma abordagem bioinformática usando a plataforma online Global Natural Products Social (GNPS) para criar uma rede de moléculas. Essas redes são analisadas para detectar e identificar toxinas, comparando dados dos espectrotras de fragmentação obtidos pela espectrometria de massa com a biblioteca GNPS. Isso permite a detecção de toxinas conhecidas e análogos desconhecidos que aparecem relacionados na mesma rede molecular.

Em um primeiro estudo3, quatro locais antropogenicamente impactados ao longo da costa da Campânia na Itália foram observados usando satélite Landsat 8 e aeronaves durante o verão de 2015. Landsat 8 sensor operacional land imager (OLI) e a câmera multiespectral da aeronave permitiram criar imagens do Índice de Água de Diferença Normalizada (NDWI) para as áreas, portanto, para revelar a presença de comunidades cianobacterianas. A composição da comunidade cianobacteriana foi determinada por meio de análises espectrofotométricas para a detecção da ficocitanina de pigmento cianobacteriano (PC). Em seguida, a análise metagenômica complementar 16S permitiu identificar taxa cianobacteriana. A indexação e classificação simplificadas de imagem multiespectral por meio de plataformas satélite/aéreas em combinação com análises metagenômicas foram eficazes na detecção da presença de cianobactérias pertencentes a gêneros associados a fortes condições eutróficas (como Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), em estágio inicial de floração.
Em um segundo estudo14, a abordagem FDS foi testada durante a Primavera/Verão 2017. Os dados de satélite foram usados como o único nível de sensoriamento remoto. Em detalhes, os dados adquiridos pelo sensor MODS (MoDerate Image Spectroradiometer, montado nas plataformas de satélite Terra e Aqua), permitiram quantificação de clorofila-a (Chl-a) nos corpos d'água ao longo das costas da Campânia e impulsionaram a escolha de dez pontos de amostragem. As amostras foram processadas em laboratório por observação microscópica e identificação taxonômica, depois extraídas com solventes orgânicos. Os extratos orgânicos foram processados pela análise LC-MS-MS. Os dados obtidos pela MS-MS foram analisados por meio de uma abordagem bioinformática, utilizando-se a plataforma GNPS para criar uma rede de moléculas. A rede foi analisada para detectar e identificar toxinas comparando dados dos espectros de fragmentação obtidos pela espectrometria de massa com a biblioteca GNPS. Isso permitiu detectar toxinas conhecidas e análogos desconhecidos que aparecerão relacionados na mesma rede molecular. Especificamente, lyngbyatoxina A, uma dermatotoxina lipofílica, foi detectada em todas as amostras de água e bivalves; na lyngbyatoxina Um aglomerado molecular, nós não relacionados a nenhum composto conhecido da família lyngbyatoxinas também estavam presentes, sugerindo a presença de análogos desconhecidos de lyngbyatoxina. Não foram detectadas microcistinas e outras toxinas nas amostras. Todos os resultados foram obtidos em 24 horas-homem.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3.jpg"> Figura 4: Resultados representativos da FDS. Um exemplo de aplicação da estratégia FDS na costa da Campânia (Itália). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Uma estratégia rápida-multidisciplinar para detecção precoce de flores cianobacterianas e cianotoxinas associadas é descrita aqui. Permite a detecção de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas em amostras de água e em matrizes orgânicas, como amostras de bivalve, em 24 h.

Detecção precoce de Flores Cianobacterianas e Cianotoxinas Associadas usando estratégia de detecção rápida

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

A estratégia de detecção rápida permite a detecção precoce de flores de cianobactérias e cianotoxinas relacionadas nas amostras de água, seja nessa matriz orgânica, como peixes de casca e outros produtos de peixe. As flores das cianobactérias são devido ao crescimento excessivo de cianobactérias, que podem viver em qualquer tipo de ambiente. E eles emergiram como um problema ambiental em todo o mundo nos últimos 15 anos.Como o número de flores prejudiciais das cianobactérias aumentou nos últimos anos, a necessidade de detecção precoce, que é fundamental para lidar com a floração e a propagação tóxica, tornou-se mais urgente. Nossa estratégia de primeira direção combina tecnologia técnica de sensoriamento remoto e proximal com a análise química e bioinformática laboratorial em um único fluxo de trabalho integrado. Todo o processo é seguro.Medidas de segurança apropriadas são tomadas para evitar a inalação de aerossol e o contato com a pele durante a amostragem e análise laboratorial. Para a recuperação de dados, primeiro localize a área de destino em um mapa mundial global e recupere os dados de vários conjuntos de dados de sensoriamento remoto público e privado para a data de coleta. Após a recuperação, processe os dados brutos, calcule os índices multiespectrais e classifique as informações resultantes.Em seguida, defina os locais de amostragem no mapa temático gerado. Para coleta de amostras, transporte o equipamento para o local de amostragem selecionado no laboratório móvel e planeje a rota de voo do drone para a realização de uma pesquisa de macro área. No local, use vários drones equipados com diferentes cargas para realizar missões de voo.E use as imagens adquiridas pelo drone para validar a presença e extensão da flor e identificar pontos de amostragem precisos. No ponto de amostragem identificado, coloque os equipamentos de proteção individual adequados e colete três amostras de água de 500 mililitros de cada local. Meça vários parâmetros ambientais, como a temperatura do ar e da água e o local pH e salinidade.Em seguida, armazene as amostras coletadas no laboratório móvel para transporte para o laboratório universitário. Prepare slides e trie as amostras com o microscópio de laboratório móvel equipado com uma câmera digital para permitir a análise taxonômica microscópica e a identificação das espécies presentes nas amostras com base em sua cor azul-verde, forma celular e pelotas de tamanho. Uma vez identificadas as espécies de cianobactérias coletadas nas amostras, no laboratório universitário, centrifugar as amostras e transferir cada supernasciente para um novo recipiente sem perturbar as pelotas de amostra.Adicione 500 mililitros de butanol a cada supernanato de amostra e transfira cada solução para ser extraída em um funil separador. Depois de sacudir e colocar os funis eretos em grampos individuais, permita que as fases aquosas escorram em frascos individuais de Erlenmeyer. Depois de repetir a separação da camada três vezes, concentre as fases orgânicas sob vácuo e pese-as.Para extração de amostras usando solventes orgânicos, adicione 50 mililitros de metanol fresco a cada amostra de pelotas e sonicar as amostras em um banho de gelo. Após cinco minutos, adicione 50 mililitros de metanol fresco a cada amostra e agite suavemente o frasco antes de filtrar as soluções através de pedaços individuais de papel filtro e coletar os filtros em frascos traseiros redondos. Após filtrar cada amostra mais duas vezes, como apenas demonstrado, analise os extratos amostrais por cromatografia líquida e espectrometria de massa tandem de alta resolução de acordo com os protocolos padrão.Em seguida, gere uma rede molecular usando a plataforma social global de produtos naturais e use as ferramentas apropriadas para analisar os dados de espectrometria de rede e massa resultantes para identificar quaisquer toxinas determinadas a estar presentes dentro das amostras coletadas. A estratégia proposta foi validada pelos resultados obtidos no programa de monitoramento costeiro, ativo na região da Campânia, no sul da Itália, de 2015 a 2021. Foi gerado um fluxo de trabalho visual que liga as técnicas aos resultados produzidos.Durante as campanhas subsequentes de monitoramento, cada passo foi otimizado com o objetivo de detecção rápida. A otimização do fluxo de trabalho de sensoriamento remoto permitiu uma redução no número de plataformas e missões, melhorando o nível do produto gerado. Por exemplo, essa estratégia de detecção rápida facilita a transição do uso de várias plataformas aéreas diferentes apenas para plataformas de satélite e drones.E desde o uso de vários diferentes índices especializados multiespectrais até os mapas temáticos mais informativos da clorofila e da diferença normalizada. Paralelamente, o fluxo de trabalho foi reduzido da necessidade de uma análise metogenômica de 16 S para o uso de observação microscópica apenas para determinar a comunidade cianobacteriana. E o novo fluxo de trabalho químico utiliza redes moleculares baseadas em LCMS para uma rápida e precisa detecção de cianotoxinas.Essa estratégia permite o estudo das cianobactérias como bioindicadoras da poluição, particularmente dentro de áreas em que a presença da flor está relacionada aos processos de eutrofização e utilizada pela pressão antropogênica. Essa estratégia multidisciplinar requer a integração combinada de diferentes técnicas, tecnologia e expertise em um fluxo de trabalho único para sua implementação bem-sucedida. A estratégia de detecção rápida é útil para prevenir problemas da comunidade de saúde devido às flores prejudiciais das cianobactérias e monitorar grandes áreas em pouco tempo.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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