Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Este protocolo pode fornecer medições de alto rendimento de eletrofisiologia celular de uma maneira que convém à tecnologia em rápido desenvolvimento de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos complexa e menos trabalhosa do que a técnica tradicional de patch clamp, mas é capaz de produzir resultados equivalentes. Portanto, este protocolo pode ser expandido para programas de triagem de toxicidade em larga escala usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos.

Por exemplo, o abrangente ensaio de pró-arritmia in vitro. Para preparar culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para o experimento, primeiro reveste lamínulas de vidro redondas individuais de 10 milímetros com 150 microlitros de matriz de membrana basal 1:60 dentro de cada poço de uma placa de 24 poços e incube as lamínulas a quatro graus Celsius por quatro horas. No final da incubação, remova o excesso de matriz das lamínulas e aplique o volume apropriado de células em cada lamínula.

Após uma hora a 37 graus Celsius, encha cuidadosamente cada poço com meio de revestimento e retorne a placa à incubadora. Para se preparar para imagens de corante sensíveis à tensão, equipe um microscópio de epifluorescência invertida com uma lente de alta abertura numérica com ampliação de 40x e acople um LED branco quente de comutação rápida à porta de iluminação transmitida. Insira um filtro vermelho simples de 660 nanômetros no caminho da luz transmitida e monte uma cabeça de LED de 470 nanômetros de comutação rápida para gravação de fotometria.

Insira um filtro de excitação 470/40 na porta de epifluorescência para limpar a luz gerada pelo LED e insira um cubo de microscópio contendo um divisor de feixe de passagem de 495 nanômetros de comprimento no carrossel da unidade de espelho dentro do microscópio. Encaixe um braço de detecção contendo um diafragma de campo ajustável na porta de montagem C para permitir a seleção da região de interesse e acople um detector PMT e uma câmera USB ao microscópio. Insira um cubo de filtro contendo um divisor de feixe de passagem de 565 nanômetros e um filtro de emissão 535/50 na porta PMT para dividir a luz de emissão entre os dois detectores.

Acople o PMT a uma fonte de alimentação e a um amplificador PMT e conecte o PMT ampsaída do amplificador a um pino de entrada analógica de um sistema de aquisição de dados. Para atender aos critérios de Nyquist e evitar aliasing, filtre os dados analógicos do PMT em um kilohertz ou mais e digitalize os dados em uma frequência que seja pelo menos o dobro da frequência mais alta presente no sinal analógico. Para carregar as células com corante sensível à tensão, misture cinco microlitros de 1000x FluoVolt e 50 microlitros de solução de carga de energia e adicione três microlitros da solução de carga resultante a três mililitros de solução de Tyrode aquecida em uma placa de Petri.

Adicione uma única lamínula revestida de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas ao prato e coloque-o a 37 graus Celsius por 20 minutos. Monte uma câmara de imagem de células vivas aquecida no estágio do microscópio e encha a câmara com 500 microlitros de solução fresca de Tyrode. Em seguida, lave a lamínula com solução fresca de Tyrode a 37 graus Celsius e use uma pinça de ponta fina para transferir cuidadosamente a lamínula para a câmara de banho pré-aquecida.

Para padronizar a dinâmica celular e os parâmetros experimentais, insira dois eletrodos de platina na câmara, espaçados cinco milímetros, e conecte os eletrodos a um estimulador externo. Defina o estimulador para pulsos de campo bipolar de cinco milissegundos a 0,5 hertz e aumente o estímulo de um volt até que as células comecem a se contrair. Em seguida, defina a tensão para aproximadamente 25% acima desse limite.

Para aquisição do potencial de ação óptica, use o caminho da luz transmitida e a câmera USB para visualizar os miócitos em condições de campo claro. Selecione uma célula isolada e use o diafragma de campo para cortar firmemente seu caminho óptico, garantindo que apenas a luz da célula de interesse seja monitorada. Ative o PMT amplifier, e defina a alimentação PMT para 750 volts.

Execute o protocolo de estimulação junto com o software de aquisição enquanto ativa simultaneamente a luz de excitação de 470 nanômetros. Registre 10 varreduras, garantindo que potenciais de ação estáveis sejam detectados. Após a última varredura, mova imediatamente o estágio do microscópio enquanto ainda grava para adquirir brevemente o sinal de fundo de uma região desprovida de células e desligar a luz de excitação.

Para analisar os dados do potencial de ação, abra uma gravação salva no software de análise apropriado e calcule a média de 10 varreduras contendo potenciais de ação estimulados de uma única célula. Subtraia a média do sinal de linha de base que representa o deslocamento de fluorescência do traço médio e, em seguida, use a fórmula para calcular a mudança na fluorescência usando a fluorescência diastólica como F0. Identifique as áreas de interesse diastólica e de potencial de ação e meça os parâmetros desejados do potencial de ação cardíaca, incluindo, mas não se limitando a, a duração da repolarização de 50% e 90%. Em seguida, exporte os dados dessa única célula para um programa de planilha.

Este método permite a quantificação rápida e precisa da mecânica de repolarização, que pode fornecer informações valiosas sobre anormalidades iônicas celulares. Características pronunciadas de fase um podem ser observadas em sinais ópticos de cardiomiócitos murinos, que são morfologicamente distintos daqueles de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Além disso, os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos respondem à manipulação farmacológica com nifedipina, um conhecido antagonista dos canais de cálcio do tipo L.

Durante a aplicação contínua de medicamentos, foi observada uma redução de 41,5% na duração do potencial de ação com 90% de repolarização, sugerindo a funcionalidade da imagem baseada em indicadores de tensão fluorescente como uma plataforma para estudos prospectivos de triagem de medicamentos cardíacos de alto rendimento. É importante ter em mente que, embora o corante sensível à voltagem usado neste estudo seja menos citotóxico do que outros, a luz de excitação ainda deve ser usada com moderação para conservar a viabilidade celular. O equipamento de fotometria modulatória usado neste protocolo é incrivelmente versátil.

Por exemplo, pode ser usado para medições simultâneas de outros parâmetros eletrofisiológicos, como cálcio intracelular.