Name: Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a determinar requisitos de polinização em ameixeiras japonesas usando microscopia de fluorescência e genotipagem molecular por PCR. Esta metodologia combina abordagens de campo e laboratório para identificar polinizadores eficazes.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Fundo Social Europeu, União Europeia (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plano Regional de Investigação (IB16181), Grupo de Investigação (AGA001, GR18196). O B.I. Guerrero foi apoiado por uma bolsa do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología do México (CONACYT, 471839).

1. Polinização manual no campo
<ol><li>
Extração de pólen
	<ol>
<li>Para obter pólen, colete botões de flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26. NOTA: Mais botões de flores são necessários na ameixa japonesa do que em outras espécies de Prunus porque seus anteros produzem menos pólen.</li>
		<li>Retire os anteás usando uma malha plástica (tamanho de poros de 2 mm x 2 mm) e coloque-os no papel em temperatura ambiente por 24 h até que o anther deiscência.</li>
		<li>Peneirar os grãos de pólen através de uma malha fina (0,26 mm x 0,26 mm tamanho de poros), e conservar-os em um tubo de vidro de 10 mL com uma tampa a 4 °C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polinização de flores emasculadas
	<ol>
<li>Quando entre 10% e 20% das flores estiverem abertas, selecione e marque vários ramos. Remova flores abertas e brotos jovens, deixando apenas botões de flores no estágio D24, de acordo com o estágio 57 na escala BBCH25,26.</li>
		<li>Remova as pétalas, sepalas e estamens entre 800 e 1.000 botões de flores por tratamento com unhas ou pinças.</li>
		<li>Polinize as mãos com a ajuda de um pincel fino 24 h após a emasculação. Alguns ramos contendo metade dos pistils com pólen da mesma cultivar, e a outra metade com pólen compatível de outra cultivar como controle. Tenha cuidado para não contaminar a ponta dos dedos ou pincel com grãos de pólen de outras cultivares.</li>
		<li>Recorde semanal de flores e frutas em desenvolvimento para caracterizar o padrão de queda de frutas e quantificar o conjunto final de frutas em cada tratamento de polinização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polinização suplementar no campo
	<ol>
<li>Poucos dias antes das primeiras flores abrirem, inclua árvores selecionadas em uma gaiola de malha de 0,8 mm para evitar a chegada de insetos polinizadores.</li>
		<li>Quando 10%-20% das flores estiverem abertas, selecione e rotule vários ramos por tratamento de polinização, deixando de 1.000 a 1.500 flores por tratamento.</li>
		<li>No dia seguinte, quando as flores estão abertas, poliniza cada flor com a ajuda de um pincel com o pólen correspondente (pólen da mesma cultivar para auto-polinização, e de outras cultivares compatíveis como controle de polinização cruzada).</li>
		<li>Polinizar dia não até que todas as flores se abram.</li>
		<li>Recorde semanal de flores e frutas em desenvolvimento desde a anestesia até a colheita para caracterizar o padrão de queda de frutas e quantificar o conjunto final de frutas em cada tratamento de polinização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Polinizações manuais em laboratório
<ol><li>Colete 50-100 flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26.</li>
	<li>No laboratório, emascular 30 flores por tratamento (auto e polinização cruzada). NOTA: A emasculação deve ser procedida cuidadosamente para evitar qualquer dano nos pistils.</li>
	<li>Faça um corte fresco na base de cada pedicel de flores debaixo d'água antes de colocá-lo em um pedaço de espuma florista molhada (um pedaço de espuma para cada tratamento de polinização).</li>
	<li>Polinizar manualmente 24 h depois usando um pincel fino com pólen coletado anteriormente (ver seção 1.1). Polinizar um conjunto de pistils com pólen da mesma cultivar, e o outro conjunto com pólen de uma cultivar compatível como controle.</li>
	<li>Deixe os pistils polinizados 72 h após a polinização em temperatura ambiente. A espuma floral deve ser continuamente molhada com água.</li>
	<li>Fixar os pistils em uma solução fixativa de etanol/ácido acético (3:1) por pelo menos 24 h a 4 °C. Substitua o fixador por 75% de etanol. As amostras podem ser conservadas nesta solução a 4 °C até o usode 27. NOTA: Certifique-se de que as amostras estão completamente submersas na solução.</li>
</ol>3. Observações microscópicas
<ol><li>
Avaliação da germinação in vitro de pólen
	<ol>
<li>Para elaborar o meio de germinação de pólen, dissolva 25 g de sacarose em 250 mL de água destilada e adicione 0,075 g de nitrato de cálcio [Ca(NO3)2] e 0,075 g de ácido bórico (H3BO3).</li>
		<li>Adicione 2 g de ágar à solução e misture até dissolver completamente28.</li>
		<li>Para esterilizar o meio, autoclave-o a 120 °C por 20 min. Esfrie o meio e, antes de solidificar, distribua 3 mL por placa de Petri estéril (55 mm x 12 mm) em uma capa de fluxo laminar estéril. Após a solidificação média, conservar as placas de Petri embrulhadas em papel alumínio a 4 °C até usar.</li>
		<li>Espalhe o pólen de cada cultivar anteriormente usado como doador de pólen nas polinizações controladas em duas placas de Petri e incuba-as a 25 °C por 24 h. NOTA: A mídia de cultura inoculada pode ser observada com microscopia imediatamente após ou armazenada a -20 °C até o uso. Para isso, as placas de Petri devem ser trocadas do congelador para a geladeira 24 h antes das observações de microscopia.</li>
		<li>Para observar os grãos de pólen, prepare 1% (v/v) solução azul anilina que mancha callose. Primeiro, prepare uma solução 0.1 N de fosfato de potássio tribasic (K3PO4) dissolvendo 7,97 g de K3PO4 em 1.000 mL de água destilada. Para elaborar a solução azul anilina de 1% (v/v), dissolva 1 mL de azul anilina em 100 mL de 0,1 N K3PO4.</li>
		<li>Adicione 2-3 gotas de solução azul anilina a cada placa de placa de Petri e observe após 5 min sob um microscópio de epifluorescência UV usando filtro de excitação BP340-390 e filtro de barreira LP425. Conte grãos viáveis e inviáveis de pólen em três campos por placa, cada campo contendo 100-200 grãos de pólen, em duas placas de Petri para cada cultivar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescimento do tubo de pólen
	<ol>
<li>Enxágüe os pistils fixos com água destilada três vezes (1h cada, 3h no total) e transfisse para 5% (w/v) sulfito de sódio (Na2SO3) a 4 °C por 24 h. Para preparar esta solução, dissolva 5 g de sulfito de sódio em 100 mL de água destilada.</li>
		<li>Autoclave os pistils a 120 °C por 8 min em 5% (w/v) sulfito de sódio para suavizar os tecidos.</li>
		<li>A abóbora amoleceu pistils em uma queda de 1% (v/v) solução azul anilina sob um vidro de cobertura em um slide para manchar callose.</li>
		<li>Observe o crescimento do tubo de pólen ao longo do estilo sob um microscópio com epifluorescência UV usando filtro de excitação BP340-390 e filtro de barreira LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Determinando relações de incompatibilidade
<ol><li>Extração de DNA de folhas<ol>
<li>Para extrair DNA, colete 3 a 4 folhas jovens de cada cultivar no campo, de preferência na primavera. NOTA: O DNA também pode ser extraído de folhas maduras, mas o DNA de folhas jovens tem compostos menos fenólicos.</li>
		<li>Isole o DNA usando um kit comercial e siga o kit de protocolo fornecido (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Quantifique a concentração de DNA e avalie a qualidade do DNA de cada amostra a 260 nm em um espectrômetro de microvolume UV-Vis. Ajuste a concentração de DNA para 10 ng/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condições de PCR para amplificação de fragmentos<ol>
<li>Rotule tubos e tampas PCR de 0,2 mL.</li>
		<li>Prepare os reagentes PCR de acordo com a Tabela 1 e deixe-os descongelar no gelo.</li>
		<li>Configure um volume de mistura mestre de cada par de primers em um microtubo de 1,5 mL de acordo com o número de reações mais 10% de excesso, considerando um volume de 16 μL por reação. Adicione os reagentes seguindo a ordem na Tabela 1 e misture bem.</li>
		<li>Aliquot 16 μL de mistura mestre em cada tubo PCR de 0,2 mL contendo 4 μL de modelo de DNA ou 4 μL de água esterilizada como controle negativo (C-). Use DNA de cultivares com genótipo conhecido como controles positivos. Misture suavemente, feche os tubos de reação com as tampas e centrifule a 2.000 x g por 30 s para coletar todo o volume na parte inferior do tubo de reação.</li>
		<li>Coloque os tubos de reação no termociclador e configure o programa PCR utilizando o seguinte perfil de temperatura: um passo inicial de 3 min a 94 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 3 min a 72 °C, e um passo final de 7 min a 72 °C20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eletroforese e estimativa do tamanho do fragmento<ol>
<li>Para preparar um mini gel agarose de 1,7% (w/v), dissolva 0,68 g de agarose e 40 mL de tampão 1x TBE em um frasco de 100 mL Erlenmeyer. Derreta a solução aquecendo em um micro-ondas a 600 W em intervalos de 30 s para evitar a ebulição.</li>
		<li>Deixe a solução ficar no banco para esfriar e, em seguida, adicione 3,5 μL de solução de coloração de ácido nucleico.</li>
		<li>Coloque a bandeja de gel no suporte de fundição e coloque o pente selecionado no molde de gel. Certifique-se de ter poços suficientes para cada produto PCR e escada de DNA.</li>
		<li>Despeje a solução de agarose no molde de gel e deixe esfriar até a polimerização. Remova o pente do gel polimerizado. Coloque o gel no sistema de eletroforese horizontal contendo tampão TBE suficiente para cobrir a superfície do gel.</li>
		<li>Carregue o primeiro e o último poço com 2 μL da escada de peso molecular do DNA (1 kb escada de DNA). Carregar 3 μL de cada produto do PCR nos outros poços. Feche a câmara, ligue a potência e execute o gel a 100 V por 30 min.</li>
		<li>Observe o gel sob luz UV usando um sistema de documentação de gel. Use a escada de peso molecular do DNA para determinar o tamanho do fragmento amplificado e compará-lo com os controles positivos, a fim de identificar os alelos correspondentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Monitorando datas de flores
<ol><li>Monitore a fenologia de diferentes árvores de cada cultivar em floração ao longo de anos diferentes. Estabeleça a duração do período de floração do primeiro (cerca de 5%) até as últimas flores abertas (cerca de 95%). A floração completa é considerada quando pelo menos 50% das flores estão no estágio F24,de acordo com o estágio 65 na escalaBBCH 25,26.</li>
	<li>Para comparar as datas de floração de cultivares intercompatíveis e determinar aquelas que coincidem em época de floração todos os anos, elaborou um calendário de tempos de floração com dados de vários anos.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A metodologia aqui descrita para os requisitos de polinização das cultivares japonesas de ameixa requer determinar a auto-(in)compatibilidade de cada cultivar por polinizações controladas no campo ou no laboratório, e a observação subsequente do crescimento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência. As relações de incompatibilidade são estabelecidas pela caracterização dos S-alelos por genotipagem molecular. Por fim, a seleção de polinizadores é realizada pela fenoologia de monitoramento para detectar as...

A ameixa japonesa(Prunus salicina Lindl.) é nativa da China1. No séculoXIX, esta cultura foi introduzida do Japão para os Estados Unidos, onde foi intercalada com outras ameixas diploides norte-americanas2. No séculoXX, alguns desses híbridos foram espalhados para regiões temperadas ao redor do mundo. Atualmente, o termo "ameixa japonesa" refere-se a uma ampla gama de híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a Salicina P. original com até 15 outros diploides Prunus spp.3,4,5.
A ameixa japonesa, como outras espécies da família Rosaceae, exibe a Autoincompatibilidade Gametofitica (GSI), que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locuscontendo múltiplos alelos6. O S-locus contém dois genes que codificam uma ribonuclease (S-RNase) expressa no pistil, e uma proteína F-box (SFB) expressa no grão de pólen7. Na reação de autoincompatibilidade, quando o alelo Sexpresso no grão de pólen (haploide) é o mesmo que um dos dois expressos no pistil (diploide), o crescimento do tubo de pólen em todo o estilo é preso devido à degradação do tubo de pólen RNA pela ação do S-RNase8. Uma vez que esse processo impede a fertilização do gametofito feminino no ovulo, o GSI promove o cruzamento entre cultivares.
Embora algumas cultivares japonesas de ameixa sejam autocompatíveis, a maioria das cultivares cultivadas atualmente são auto-incompatíveis, e precisam de pólen de doadores intercompatíveis para fertilizar suas flores3. Em espécies de frutas de pedra do gênero Prunus como amêndoa9, damasco10,11,12 e cereja doce13, os requisitos de polinização de cultivares podem ser estabelecidos por diferentes abordagens. A auto-(in)compatibilidade pode ser determinada pela auto-polinização das flores no campo e monitoramento subsequente do conjunto de frutas, ou por auto-polinizações semi-in vivo em condições controladas em laboratório e pela observação de tubos de pólen sob o microscópio14,15,16,17,18 . As relações de incompatibilidade entre as cultivares podem ser determinadas por polinizações cruzadas no campo ou no laboratório utilizando pólen da cultivar polinizadora potencial, e pela identificação de S-alelosde cada cultivar pela análise PCR14,15,16,19,20,21,22 . Em espécies como cereja doce ou amêndoa, a auto-(in)compatibilidade também pode ser avaliada pela identificação de alelos S específicos associados à auto-compatibilidade, como S4' na cereja doce13 ou Sf na amêndoa23.
Vários programas de criação de ameixas dos principais países produtores estão liberando uma série de novas cultivares2,14, muitas delas com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por auto-polinizações tanto no campo quanto no laboratório, seguida por observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência. A seleção de cultivares polinizadores combina a identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Glacial Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>iNtRON Biotecnologia</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Azul de anilina</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 &middot; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr> Digital <tr><td></td><td>Camera Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr>Digital<td>Camera Software Suite</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM cada</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA polimerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96&deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb DNA Ladder (Patente dos EUA No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Tamanho: 250&micro; g; Conc: 1.0 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Sistema de Documentação de Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Mãos</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Software de Laboratório de Imagens</td><td>Sistema de Análise de Imagem Bio-Rad</td><td></td><td>para Sistema de Documentação de Gel</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5415 R</td> Microscópio <td>Z605212</td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>com UV epifluescência</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Filtro excitador BP340-390, Filtro de barreira LP425</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini Sistema de Eletroforese</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Tribásico (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer para a frente 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer para a frente Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverso 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Solução de coloração de ácido nucleico</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sódio anidro (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA de plantas Speedtools</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Vertical Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, microscopia de fluorescência e genotipagem molecular

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

As cultivares japonesas de ameixa comumente cultivadas são híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a salicina prunus original com outras espécies de Prunus. A maioria dos híbridos exibe autoincompatibilidade gametofítica, que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locus que contém vários alelos. A maioria dos híbridos cultivados são auto-incompatíveis e precisam de pólen de um doador compatível para fertilizar suas flores. O estabelecimento de requisitos de polinização na ameixa japonesa está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por polinizações manuais tanto no campo quanto no laboratório, seguida pelo monitoramento do alongamento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência, e também pelo monitoramento da maturação da fruta no campo. A seleção de cultivares polinizadores é avaliada pela combinação da identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo. Conhecer os requisitos de polinização das cultivares facilita a seleção de cultivares para a concepção de novos pomares e permite a detecção precoce de problemas de produtividade relacionados à deficiência de polinização em pomares estabelecidos.

Cada broto de flor de ameixa japonês contém uma inflorescência com 1-3 flores. Como em outras espécies de frutas de pedra, cada flor é composta de quatro prostitutas: carpel, estamens, pétalas e sepalas, que são fundidas formando um copo na base da flor. As estruturas florais são menores do que outras frutas de pedra, com um mitil curto e frágil cercado pelos estamens que contêm uma pequena quantidade de grãos de pólen. Em plena floração, as flores de cada inflorescência aparecem separadas em talos curtos, mostrando as p...

Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Este protocolo está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares de ameixa japonesa auto-incompatíveis com requisitos de polinização desconhecidos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a determinação das exigências de polinização das cultivares, combinando duas abordagens complementares em condições de campo e laboratório. Essa abordagem também pode ser aplicada para determinar os requisitos de polinização e outras espécies de árvores frutíferas autoincompatíveis, como damasco ou cereja doce.Para a extração de pólen, colete botões florais no estágio de balão de acordo com o estágio 57 na escala BBCH. Retirar as anteras com uma tela plástica e colocá-las sobre papel à temperatura ambiente durante 24 horas até à deiscência da antera. Peneire os grãos de pólen através de uma malha fina e conserve-os em um tubo de vidro de 10 milímetros com tampa a quatro graus Celsius até o uso.Quando 10 a 20% das flores estiverem abertas, selecione e rotule vários ramos, deixando 1.000 a 1.500 flores por tratamento de polinização. No dia seguinte, quando mais flores estiverem abertas, polinize cada flor usando um pincel com pólen da mesma cultivar para autopolinização e pólen de outras cultivares como controle de polinização cruzada. Polinize todos os dias até que todas as flores estejam abertas.Registre as contagens semanais de flores e frutos em desenvolvimento desde a antese até a colheita para caracterizar o padrão de queda dos frutos e quantificar a frutificação final em cada tratamento de polinização. Colete de 50 a 100 flores no estágio de balão de acordo com o estágio 57 na escala BBCH. Emascular 30 flores por tratamento em laboratório para autopolinização e polinização cruzada.Faça um novo corte na base de cada pedículo de flor debaixo d'água e coloque-o em um pedaço de espuma de florista úmida. Use um pedaço de espuma para cada tratamento de polinização. Após 24 horas, polinize manualmente cada pistilo com o pólen coletado anteriormente usando um pincel fino.Polinizar um conjunto de pistilos com pólen da mesma cultivar e o outro conjunto com pólen de outra cultivar compatível como controle. Fixar estes pistilos polinizados numa solução fixadora de etanol e ácido acético durante, pelo menos, 24 horas a quatro graus Celsius. Espalhe o pólen de cada cultivar anteriormente usada como doador de pólen nas polinizações em duas placas de Petri e incube-as a 25 graus Celsius por 24 horas.Para observar os grãos de pólen, adicione duas a três gotas de solução de azul de anilina a cada placa de Petri e observe-as em um microscópio de epifluorescência UV após cinco minutos. Conte grãos de pólen viáveis e não viáveis nos três campos por placa de Petri, com cada campo contendo cerca de 100 a 200 grãos de pólen em duas placas de Petri para cada cultivar. Para observar os tubos polínicos, esmague pistilos amolecidos em uma gota de solução de azul de anilina a 1% sob uma lamínula em uma lâmina.Observe o crescimento do tubo polínico ao longo do estilete sob um microscópio com epifluorescência UV usando o filtro excitador BP340-390 e o filtro de barreira LP425. Colete de três a quatro folhas jovens de cada cultivar no campo e extraia o DNA das folhas. Configure uma mistura mestre para cada par de primers em microtubos de 1,5 mililitro.Adicione todos os reagentes e misture bem. Alíquota de 16 microlitros desta mistura mestre em cada tubo de PCR de 200 microlitros contendo quatro microlitros de molde de DNA ou controle. Misturar delicadamente, fechar as tampas e centrifugar a 2 000 vezes G durante 30 segundos.Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de PCR conforme mencionado no manuscrito do texto. Para estimar o tamanho do fragmento por eletroforese em gel, carregar o primeiro e o último poços com dois microlitros da escada de DNA e três microlitros do produto da PCR nos demais poços. Feche a câmara e deixe o gel funcionar a 100 volts por 30 minutos.Observe o gel sob luz ultravioleta usando um sistema de imagem de gel. Use a escada de DNA para estimar o tamanho dos fragmentos amplificados e compará-lo com os controles positivos e negativos. Monitore a fenologia de diferentes árvores de cada cultivar ao longo de diferentes anos de floração.Estabeleça a duração do período de floração da primeira à última flor aberta. A floração total é considerada quando pelo menos 50% das flores estão no estágio F de acordo com o estágio 65 no BBCH. O padrão de queda de frutos de flores polinizadas manualmente após emasculação ou polinização suplementar mostrou que a maioria das flores caiu duas a três semanas após a polinização, mas 4% das flores autopolinizadas permaneceram na árvore, indicando que esta cultivar é autocompatível.Os grãos de pólen viáveis apresentaram um tubo polínico maior que seu comprimento após 24 horas no meio de cultura e os grãos de pólen não viáveis não germinaram. Durante a polinização, os grãos de pólen foram transferidos para o estigma. Cada grão de pólen em germinação produziu um tubo polínico, que cresceu através das estruturas do pistilo.Nas cultivares auto-incompatíveis, o tubo polínico parou de crescer no terço superior do estilete. No entanto, em cultivares autocompatíveis, o tubo polínico pode crescer através do estilete, atingir o ovário e fertilizar um óvulo. A análise de PCR foi realizada utilizando primers das regiões conservadas de sRNAs de cereja doce e ameixeira japonesa, possibilitando determinar o tamanho dos alelos S em cada cultivar.A duração do período de floração para um total de quatro anos foi calculada. A floração em condições de pomar permitiu determinar quais cultivares são coincidentes na época de floração a cada ano. Ao tentar este protocolo, certifique-se de usar um número maior de flores de ameixa japonesa para polinizações manuais, pois a porcentagem de frutificação é muito baixa em comparação com outras espécies de Prunus.Não é possível determinar a auto-incompatibilidade por abordagens moleculares. Mais trabalhos de sequenciamento do alelo S são necessários para avaliar se alguns alelos S estão associados à autocompatibilidade. A combinação de abordagens de campo e laboratório resultou em informações valiosas para o projeto de novos pomares comerciais e pode ser usada em outras espécies de árvores frutíferas.

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Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização.

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da<em&gt; Sanguinea de Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Aqui, apresentamos um protocolo para forçar a floração em tangerineiras sob condições phytotron. Água, stress, alta luminosidade e um fotoperíodo de primavera simulado permitido flores viáveis a serem obtidos em um curto período de tempo. Esta metodologia permite que os pesquisadores ter vários períodos de floração em 1 ano.

Forçado a floração em tangerineiras Phytotron condições

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Determinação das Relações de Auto e Inter-(in)compatibilidade em Damasco combinando polinização manual, microscopia e análises genéticas

Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

Aqui, descrevemos um aprimoramento do método semi-in vitro (SIV) para observação da orientação e recepção do tubo polínico em Arabidopsis thaliana, que aumenta a receptividade dos óvulos. O método SIV cum septum de alto rendimento pode ser acoplado a linhagens de marcadores gametófitos e biossensores codificados geneticamente para monitorar o processo dinâmico de fertilização.

Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum

Um método aprimorado para medir o perfil de hidratação polínica em Arabidopsis thaliana é descrito aqui. O novo método oferece maior resolução, não é invasivo e é altamente reprodutível. O protocolo representa uma nova ferramenta para uma dissecação mais fina dos processos que regulam os estágios iniciais da polinização.

Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Para estudar o mecanismo de utilização de lipídios nas membranas do saco vitelino durante os estágios finais do desenvolvimento embrionário aviário, estabelecemos um sistema primário de cultura de células epiteliais endodérmicas embrionárias de codorna japonesa.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

Aprenda a determinar requisitos de polinização em ameixeiras japonesas usando microscopia de fluorescência e genotipagem molecular por PCR. Esta metodologia combina abordagens de campo e laboratório para identificar polinizadores eficazes.

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

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