Name: Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a criar dispositivos de imagem de esferoides 3D para estudar invasão de células de carcinoma mamário em tempo real usando fluorescência longitudinal. Este método melhora eficiência e reduz custos em pesquisa de metástase.

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Gostaríamos de agradecer aos membros da Temple Bioengineering por discussões valiosas. Agradecemos a David Ambrose no núcleo de citometria de fluxo (Lewis Katz School of Medicine) por sua ajuda com a triagem celular e Tony Boehm do IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) por ajuda com a impressão 3D. Agradecemos também aos nossos recursos de financiamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, todos para a BG.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O espaçador impresso 3D foi projetado para criar folhas de 1 mm de espessura de PDMS que podem então ser usadas para criar facilmente várias formas de PDMS, conforme exigido pelas aplicações experimentais. Devido à simplicidade de sua fabricação e à liberdade de alterar o design, este método de fundição PDMS foi escolhido para o design inicial do SID. Se for necessário um alto volume de SIDs, a produção pode ser mais eficiente criando um molde impresso em 3D, que já contém discos PDMS com três orifícios igualmente espaça...

Durante a progressão do câncer, as células cancerígenas podem adquirir um fenótipo motile e invasivo, permitindo-lhes escapar da massa tumoral e invadir os tecidos circundantes1. Eventualmente, essas células cancerígenas invasivas podem alcançar e crescer dentro de órgãos secundários, um processo chamado metástase do câncer1. A metástase causa mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer2. Uma das razões para isso é que, embora os tumores localizados sejam clinicamente gerenciáveis, não existem métodos eficientes para a eliminação de células cancerígenas invasivas uma vez que a propagação metastática tenha ocorrido. Portanto, o surgimento de células cancerígenas invasivas e a transição de uma doença localizada para uma doença invasiva está representando um grande desafio clínico. Determinar como as células cancerígenas iniciam e sustentam um comportamento invasivo pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes.
O modelo esferoide 3D é uma plataforma ideal para investigar o comportamento motil das células cancerosas sob condições controladas, mas fisiologicamente relevantes3. De fato, neste ensaio, esferoides de células cancerosas são incorporados dentro da matriz extracelular (ECM), por exemplo, colágeno I, que imita um tumor simplificado. Em seguida, a imagem é usada para visualizar a invasão de células cancerígenas do esferoide para a matriz de colágeno. No entanto, vários desafios limitam esse procedimento.
O primeiro desafio ocorre na etapa de incorporação, onde a matriz de colágeno líquido pode se espalhar pela superfície do prato, fazendo com que o esferoide toque na parte inferior do prato. Consequentemente, as células do esferoide se espalham na superfície bidimensional (2D), quebrando a morfologia esferoide tridimensional (3D). Aumentar o volume de colágeno é uma solução eficiente, mas cara. Para evitar que as células se espalhassem na superfície 2D, mantendo um volume mínimo de colágeno, desenvolvemos um dispositivo de imagem esferoide (SID) delimitando uma inserção de polidimtilsiloxano de 3 furos de espessura (PDMS) em uma placa de fundo de vidro.
O segundo desafio do ensaio esferoide é a rotulagem de células cancerígenas em esferoides, que é limitada pela má penetração de anticorpos e corantes fluorescentes, um efeito que aumenta com o tamanho esferoide. Embora a solução ideal para rotular células seja o estabelecimento de linhas celulares expressando de forma estável proteínas fluorescentes, essa opção é restrita principalmente a linhas celulares imortalizadas e é limitada pela disponibilidade de quimeras de proteína fluorescente. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a coloração de imunofluorescência de esferoides fixos, bem como o uso eficiente de um corante citoplasmado para rotular células imediatamente antes de incorporar o esferoide.
O terceiro desafio do ensaio esferoide é a falta de macros fiji simples para quantificação semi-automatizada da invasão celular ao longo do tempo. Para enfrentar esse desafio, descrevemos uma metodologia simples para analisar a área esferoide ao longo do tempo. Ilustramos as vantagens deste protocolo usando as linhas celulares 4T1 e 67NR como exemplos.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>60-014-44</td><td></td></tr><tr><td>10X Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>SH30028.LS</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeído (PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368-9M</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>placa de 48 poços</td><td>Falcon</td><td>T1048</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-cortactina</td><td>Abcam</td><td>ab33333</td><td>1 a 200 diluição</td></tr><tr><td>Anti Anticorpo E-caderina</td><td>Invitrogen</td><td>13-1900</td><td>1 a 100 diluições</td></tr><tr><td>Solução de atelocolágeno bovino I (Nutragen)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>501050ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>FisherBrand</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente descartável</td><td>Grampos</td><td></td><td>Copos plásticos</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência descartável</td><td>Thermo Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>eBioscience</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Coloração nuclear de Hoescht</td><td>Thermo Fischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fischer</td><td>S25371A</td><td></td></tr><tr><td>prato MatTek (prato com fundo de vidro)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6385-100G</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ água</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina</td> Placa de Petri <td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pontas</td> de pipeta <td>de 353003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td></td><td>02-707</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários, específico</td><td></td><td></td><td></td>do usuário</tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato I</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários, específicos do</td><td></td><td></td><td></td>usuário</tr><tr><td>Slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Fita</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>655204-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3d spheroid

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

A invasão de células cancerígenas do tumor primário para os tecidos saudáveis adjacentes é um passo inicial na metástase. As células cancerígenas invasivas representam um grande desafio clínico porque não existem métodos eficientes para sua eliminação uma vez que sua disseminação está em andamento. Uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a invasão de células cancerosas pode levar ao desenvolvimento de novas terapias potentes. Devido à sua semelhança fisiológica com tumores, os esferoides incorporados no colágeno tenho sido amplamente utilizado pelos pesquisadores para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular (ECM). No entanto, este ensaio é limitado por (1) falta de controle sobre a incorporação de esferoides no ECM; (2) alto custo de colágeno I e pratos de fundo de vidro, (3) rotulagem imunofluorescente não confiável, devido à penetração ineficiente de anticorpos e corantes fluorescentes e (4) processamento de imagem demorado e quantificação dos dados. Para enfrentar esses desafios, otimizamos o protocolo esferoide tridimensional (3D) para imagem fluorescente rotulada células cancerígenas embutidas no colágeno I, seja usando vídeos de lapso de tempo ou imagens longitudinais, e analisar a invasão de células cancerosas. Primeiro, descrevemos a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide (SID) para incorporar esferoides de forma confiável e em um volume mínimo de colágeno I, reduzindo o custo do ensaio. Em seguida, delineamos os passos para rotulagem robusta de fluorescência de esferoides vivos e fixos. Finalmente, oferecemos uma macro Fiji fácil de usar para processamento de imagens e quantificação de dados. Ao todo, essa metodologia simples fornece uma plataforma confiável e acessível para monitorar a invasão de células cancerígenas no colágeno I. Além disso, este protocolo pode ser facilmente modificado para atender às necessidades dos usuários.

Devido à sua biocompatibilidade, o PDMS é amplamente utilizado para microfabificação de poços, selos e moldes de confinamento, o que revolucionou os dispositivos micropatterning e microfluidos. No método descrito aqui, é usado para criar SIDs, poços personalizáveis que otimizam o procedimento de incorporação e imagem de spheroid. A Figura 1 ilustra os principais componentes utilizados na fabricação dos SIDs. Para lançar o molde PDMS, um espaçador de 1 mm de espessura é impresso em 3D<strong ...

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um simples dispositivo de imagem esferoide, o que torna o ensaio de invasão esferoide mais fácil de configurar e melhora sua eficiência e custo. Embora demonstremos o uso do ensaio de invasão esferoide para modelar o carcinoma mamário, este ensaio é um excelente modelo para a invasão de qualquer tumor sólido no tecido saudável circundante.Após a impressão 3D do espaçador, pondere uma proporção de 10:1 de polímero base para cross-linker em um copo plástico e use uma pipeta descartável para misturar completamente a solução PDMS resultante no copo. Coloque o copo em uma câmara de vácuo e solte rapidamente a pressão de vácuo para remover qualquer ar preso na superfície da mistura e dissipar as bolhas de ar restantes. Incubar o espaçador impresso em 3D a 100 graus Celsius por cinco minutos para aumentar sua flexibilidade e limpar duas placas de vidro com isopropanol 100%.Coloque o espaçador para que ele fique alinhado entre as duas placas limpas e coloque dois grandes clipes de aglutinante na borda inferior e um no canto superior para selar o molde nas bordas externas das placas. Inspecione a parte superior do molde para garantir que o espaçador esteja alinhado com as placas de vidro e use uma pipeta descartável com aproximadamente dois centímetros cortados da ponta para lentamente, mas adicione continuamente a mistura de PDMS ao canto superior esquerdo do molde. Quando todo o molde estiver preenchido, coloque o molde na câmara de vácuo para remover quaisquer bolhas de ar que se formaram, antes de curar o PDMS por uma hora a 100 graus Celsius.No final da incubação, coloque o molde em temperatura ambiente. Quando estiver frio ao toque, remova os clipes de aglutinante e as placas de vidro do espaçador contendo o PDMS curado e use uma lâmina de barbear para cortar o selo que foi criado em todos os quatro lados do molde entre o espaçador e a placa de vidro. Retire o molde para revelar a folha PDMS no espaçador e use pinças para retirar cuidadosamente a folha PDMS do espaçador.Coloque a folha em um tapete de corte e use um soco de biópsia para perfurar um disco PDMS de 17,5 milímetros de diâmetro, em seguida, perfurar três furos distribuídos uniformemente 5,5 milímetros no disco. Use fita para remover quaisquer partículas de poeira de cada inserção e coloque as pastilhas limpas em um pedaço de fita dupla face. Enrole a fita ao redor da tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros e coloque a tampa em uma máquina de plasma junto com pratos abertos de vidro de 35 milímetros.Ative as pastilhas e o vidro com um minuto de tratamento plasmápico em 300 militores e use pinças para fixar rapidamente o lado tratado de cada inserção à parte de vidro de uma placa de fundo de vidro tratada por inserção. Quando todas as pastilhas tiverem sido aplicadas, use o dedo do ponteiro e o polegar para aplicar até mesmo pressão em cada inserção enquanto gira o prato para fixar as pastilhas com segurança nos pratos. Quando todas as pastilhas tiverem sido protegidas, incubar os dispositivos de imagem esferoide resultantes por 20 minutos a 60 graus Celsius, antes de realizar uma segunda rodada de tratamento plasmático como demonstrado.Após o segundo tratamento, adicione 35 microliters de solução de revestimento recém-preparada a cada orifício de inserção. Após uma hora em temperatura ambiente, remova a solução de revestimento e enxágue o dispositivo três vezes com água destilada. Após a última lavagem, adicione 35 microliters de solução de ligação cruzada a cada orifício para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, enxágue o dispositivo três vezes com água destilada como demonstrado, antes de encher cada dispositivo com 70% de etanol para uma incubação de 30 minutos sob luz UV. No final da esterilização, enxágüe os dispositivos três vezes com água destilada e adicione 2,5 mililitros de solução de armazenamento a cada dispositivo. Para incorporar os esferoides em colágeno, lave os dispositivos três vezes com três mililitros de PBS por lavagem.Após a última lavagem, deixe os dispositivos secarem completamente, antes de adicionar um esferoide em 30 microliters de uma solução recém-preparada na faculdade em um orifício da inserção e iniciar um temporizador. Depois de confirmar a presença do esferoide no orifício, adicione eferóides aos outros dois orifícios como demonstrado. Use uma ponta de pipeta de 10 microliter para recentementer quaisquer esferoides que estejam localizados perto da borda do PDMS, ou para separar os esferoides se vários esferoides forem dispensados e parar o temporizador.Para centralizar verticalmente o esferoide na camada de colágeno, após a semeadura, gire o dispositivo de cabeça para baixo e incuba o dispositivo a 37 graus até que o colágeno polimerize, invertendo a orientação do dispositivo a cada dois minutos por um total de 30 minutos, em seguida, adicione 2,5 mililitros de dispositivo médio por dispositivo e adquira uma imagem dos esferoides no ponto de tempo zero. O uso de um dispositivo de imagem esferoide facilita a incorporação eficiente e a gravação de lapso de tempo da invasão de células cancerosas dentro do colágeno ou através de imagens longitudinais. Embora este esferoide tenha sido retratado longitudinalmente ao longo de seis dias exigindo a expressão estável de proteínas citoplasmáticas e/ou fluorescentes nucleares, imagens longitudinais semelhantes podem ser realizadas durante um período de tempo mais curto usando rotulagem de tingimento.Esferoides também podem ser consertados e imunolabelados. Por exemplo, esses esferoides foram imunolabelados para epitelial-cadherina, cortactina e F-actin. Nestas imagens, pode-se observar uma ilustração passo a passo do procedimento de processamento de imagem usando a macro Fiji para medir a área do esferoide ao longo do tempo.Certifique-se de distribuir um único esferoide em cada orifício do dispositivo de imagem esferoide e posicionar o esferoide no centro do orifício nas direções XY e Z. O design do dispositivo pode ser facilmente modificado alterando o tamanho e o arranjo dos orifícios, inserções e pratos de fundo de vidro para acomodar uma taxa de throughput mais alta esferoide.

time-resolved-fluorescence-imaging-analysis-cancer-cell-invasion-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir...

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Fonte: Guyon, J., et al. Um modelo esferóide 3D para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra a geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais. Os esferóides são formados a partir de células tumorais cerebrais humanas e incorporados em uma matriz de colágeno. As células tumorais na periferia esferóide adotam um fenótipo invasivo, secretando proteases para degradar o colágeno e avançando para invadir a matriz circundante.

Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda a criar dispositivos de imagem de esferoides 3D para estudar invasão de células de carcinoma mamário em tempo real usando fluorescência longitudinal. Este método melhora eficiência e reduz custos em pesquisa de metástase.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

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