Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos que regem a invasão de células cancerígenas na matriz extracelular em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um simples dispositivo de imagem esferoide, o que torna o ensaio de invasão esferoide mais fácil de configurar e melhora sua eficiência e custo. Embora demonstremos o uso do ensaio de invasão esferoide para modelar o carcinoma mamário, este ensaio é um excelente modelo para a invasão de qualquer tumor sólido no tecido saudável circundante.

Após a impressão 3D do espaçador, pondere uma proporção de 10:1 de polímero base para cross-linker em um copo plástico e use uma pipeta descartável para misturar completamente a solução PDMS resultante no copo. Coloque o copo em uma câmara de vácuo e solte rapidamente a pressão de vácuo para remover qualquer ar preso na superfície da mistura e dissipar as bolhas de ar restantes. Incubar o espaçador impresso em 3D a 100 graus Celsius por cinco minutos para aumentar sua flexibilidade e limpar duas placas de vidro com isopropanol 100%.

Coloque o espaçador para que ele fique alinhado entre as duas placas limpas e coloque dois grandes clipes de aglutinante na borda inferior e um no canto superior para selar o molde nas bordas externas das placas. Inspecione a parte superior do molde para garantir que o espaçador esteja alinhado com as placas de vidro e use uma pipeta descartável com aproximadamente dois centímetros cortados da ponta para lentamente, mas adicione continuamente a mistura de PDMS ao canto superior esquerdo do molde. Quando todo o molde estiver preenchido, coloque o molde na câmara de vácuo para remover quaisquer bolhas de ar que se formaram, antes de curar o PDMS por uma hora a 100 graus Celsius.

No final da incubação, coloque o molde em temperatura ambiente. Quando estiver frio ao toque, remova os clipes de aglutinante e as placas de vidro do espaçador contendo o PDMS curado e use uma lâmina de barbear para cortar o selo que foi criado em todos os quatro lados do molde entre o espaçador e a placa de vidro. Retire o molde para revelar a folha PDMS no espaçador e use pinças para retirar cuidadosamente a folha PDMS do espaçador.

Coloque a folha em um tapete de corte e use um soco de biópsia para perfurar um disco PDMS de 17,5 milímetros de diâmetro, em seguida, perfurar três furos distribuídos uniformemente 5,5 milímetros no disco. Use fita para remover quaisquer partículas de poeira de cada inserção e coloque as pastilhas limpas em um pedaço de fita dupla face. Enrole a fita ao redor da tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros e coloque a tampa em uma máquina de plasma junto com pratos abertos de vidro de 35 milímetros.

Ative as pastilhas e o vidro com um minuto de tratamento plasmápico em 300 militores e use pinças para fixar rapidamente o lado tratado de cada inserção à parte de vidro de uma placa de fundo de vidro tratada por inserção. Quando todas as pastilhas tiverem sido aplicadas, use o dedo do ponteiro e o polegar para aplicar até mesmo pressão em cada inserção enquanto gira o prato para fixar as pastilhas com segurança nos pratos. Quando todas as pastilhas tiverem sido protegidas, incubar os dispositivos de imagem esferoide resultantes por 20 minutos a 60 graus Celsius, antes de realizar uma segunda rodada de tratamento plasmático como demonstrado.

Após o segundo tratamento, adicione 35 microliters de solução de revestimento recém-preparada a cada orifício de inserção. Após uma hora em temperatura ambiente, remova a solução de revestimento e enxágue o dispositivo três vezes com água destilada. Após a última lavagem, adicione 35 microliters de solução de ligação cruzada a cada orifício para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.

No final da incubação, enxágue o dispositivo três vezes com água destilada como demonstrado, antes de encher cada dispositivo com 70% de etanol para uma incubação de 30 minutos sob luz UV. No final da esterilização, enxágüe os dispositivos três vezes com água destilada e adicione 2,5 mililitros de solução de armazenamento a cada dispositivo. Para incorporar os esferoides em colágeno, lave os dispositivos três vezes com três mililitros de PBS por lavagem.

Após a última lavagem, deixe os dispositivos secarem completamente, antes de adicionar um esferoide em 30 microliters de uma solução recém-preparada na faculdade em um orifício da inserção e iniciar um temporizador. Depois de confirmar a presença do esferoide no orifício, adicione eferóides aos outros dois orifícios como demonstrado. Use uma ponta de pipeta de 10 microliter para recentementer quaisquer esferoides que estejam localizados perto da borda do PDMS, ou para separar os esferoides se vários esferoides forem dispensados e parar o temporizador.

Para centralizar verticalmente o esferoide na camada de colágeno, após a semeadura, gire o dispositivo de cabeça para baixo e incuba o dispositivo a 37 graus até que o colágeno polimerize, invertendo a orientação do dispositivo a cada dois minutos por um total de 30 minutos, em seguida, adicione 2,5 mililitros de dispositivo médio por dispositivo e adquira uma imagem dos esferoides no ponto de tempo zero. O uso de um dispositivo de imagem esferoide facilita a incorporação eficiente e a gravação de lapso de tempo da invasão de células cancerosas dentro do colágeno ou através de imagens longitudinais. Embora este esferoide tenha sido retratado longitudinalmente ao longo de seis dias exigindo a expressão estável de proteínas citoplasmáticas e/ou fluorescentes nucleares, imagens longitudinais semelhantes podem ser realizadas durante um período de tempo mais curto usando rotulagem de tingimento.

Esferoides também podem ser consertados e imunolabelados. Por exemplo, esses esferoides foram imunolabelados para epitelial-cadherina, cortactina e F-actin. Nestas imagens, pode-se observar uma ilustração passo a passo do procedimento de processamento de imagem usando a macro Fiji para medir a área do esferoide ao longo do tempo.

Certifique-se de distribuir um único esferoide em cada orifício do dispositivo de imagem esferoide e posicionar o esferoide no centro do orifício nas direções XY e Z. O design do dispositivo pode ser facilmente modificado alterando o tamanho e o arranjo dos orifícios, inserções e pratos de fundo de vidro para acomodar uma taxa de throughput mais alta esferoide.