Construindo um sistema de iluminação simples e versátil para experimentos optogenéticos
12 de janeiro de 2021
Este protocolo descreve como realizar experimentos optogenéticos para controlar a expressão gênica com luz vermelha e vermelha distante usando PhyB e PIF3. Estão incluídas instruções passo-a-passo para a construção de um sistema de iluminação simples e flexível, que permite o controle da expressão gênica ou outra optogenética com um computador.
O sistema permite que os pesquisadores construam facilmente um sistema de iluminação barato e versátil para experimentos optogenéticos. As vantagens desta técnica incluem a capacidade de programar o tempo de iluminação LED com comprimentos de onda disponíveis que abrangem o espectro visível perto do IR, e que os LEDs podem ser usados em uma variedade de contextos Para construir um circuito elétrico, prender a placa de circuito impresso nas mãos amigas e inserir os fios do jumper, conectando-os para formar os orifícios A1 e A3 ao solo, o fio do jumper D2 no orifício D6 e a fonte de alimentação mais os fios do jumper número sete no orifício A7. Dobre os terminais 45 graus e adicione fluxo.
Após a solda, apare as costas dos fios. Insira uma extremidade do conector fêmea fio a fio soldado no orifício A5. Em seguida, conecte uma extremidade do resistor ao orifício A5.
Conecte a outra extremidade do conector ao aterramento. Em seguida, conecte a outra extremidade do resistor ao solo e solde a conexão. Para o conector Arduino, aperte as extremidades dos conectores fio a fio e empurre as extremidades crimpadas através do conector retangular.
Para configurar os LEDs, estanhe um fio aquecendo por baixo enquanto adiciona solda a partir do topo. Coloque uma quantidade generosa de solda sobre a grande ponta de solda e use a ponta para aquecer a base do LED no contato que contém o fluxo. Depois de alguns segundos, arraste individualmente a solda em cada contato e fixe o fio preto no cátodo usando um grampo de cabelo.
Coloque uma quantidade generosa de solda na grande ponta de solda e pressione a ponta no fio até que a solda na base do LED derreta. Segure o fio e remova o ferro de solda enquanto mantém o fio no lugar. Coloque uma pequena quantidade de pasta de solda nas almofadas para as conexões LED e use fórceps para colocar o LED sobre as almofadas.
Segure o fio vermelho pré-estanhado no ânodo e use um grampo de cabelo para prender o fio. Adicione solda à ponta grande, conforme demonstrado, e pressione a ponta na conexão até que a solda na base do LED derreta e a pasta de solda derreta e se torne prata. Para fazer os fios de LED, coloque um tubo de encolhimento de 4,76 milímetros sobre o fio cortado no comprimento e um tubo de encolhimento de 3,18 milímetros sobre o conector fio a fio.
Retire e adicione fluxo às extremidades do fio. Use as mãos que ajudam para prender o conector fio a fio e torça a extremidade do conector com uma extremidade de fio. Solde os materiais juntos e prenda o outro fio à configuração da mesma maneira e solde.
Em seguida, prenda os fios de LED para as mãos de ajuda com fita adesiva sob a base do LED. Em seguida, misture o epóxi de acordo com as instruções do fabricante e espalhe o epóxi sobre a parte superior do LED soldado. Usando a broca de pá, faça um furo de 1,5 centímetro através da parte superior da caixa na qual o LED será colocado e use uma ferramenta rotativa de alta velocidade para fazer um entalhe em um lado do furo para abrir espaço para o fio LED.
Cole um pedaço de filme de privacidade de 25 a 30 milímetros na caixa preta que cobre o orifício através do qual o LED acenderá e cole o LED fora da caixa preta em cima do buraco. Para um sistema de controle de quatro LEDs, faça quatro furos de 0,83 centímetro a 3,81 centímetros de distância na tampa da caixa e use uma ferramenta rotativa de alta velocidade para cortar um orifício retangular de 1,19 por 1,90 centímetro no canto superior esquerdo. Usando uma broca de pá, faça um furo de 1,5 centímetro na parte de trás da caixa e insira um grommet no furo.
Para os LEDs controlados por computador, lixa a área onde o microcontrolador será colado na caixa, bem como o lado inferior do suporte do microcontrolador. Encaixe o microcontrolador no suporte epóxi e, em seguida, epóxi o suporte e a caixa juntos antes de prender o suporte na caixa preta. Em seguida, coloque fita dupla face no clipe e prenda o clipe dentro da caixa.
Em amostras transfectadas para expressar o fitocromo B, mas não a ficocianina bilina, o vazamento aumenta à medida que a quantidade de DNA do repórter aumenta. Além disso, quando todo o interruptor do gene do fitocromo B, incluindo o plasmídeo produtor do cromoquatro bilina ficocianina, é iluminado com luz vermelha distante, a expressão de luciferase também aumenta com as quantidades crescentes de construção do repórter dentro da mistura de transfecção. Da mesma forma, quando as células sensíveis à luz são iluminadas com luz vermelha, a expressão de luciferase também aumenta com o aumento da quantidade de repórteres.
Ao comparar os níveis de indução das células tratadas com a luz vermelha com as células tratadas com a luz vermelha distante, uma pequena diminuição na ativação da dobra é encontrada com quantidades crescentes de repórter. É essencial seguir cuidadosamente cada passo ao construir o circuito elétrico e verificar novamente os números do pinhole linha por linha antes de soldar cada componente. Este protocolo pode ser usado para a estimulação óptica de muitos tipos de amostras ou ferramentas optogenéticas usando uma variedade de comprimentos de onda e permite a programação de horários de iluminação.
Visão Geral
Este protocolo descreve a construção de um sistema de iluminação versátil para experimentos optogenéticos, permitindo o controle da expressão gênica com luz vermelha e vermelha distante. Instruções passo a passo são fornecidas para construir o sistema e programar a iluminação LED.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Optogenética
- Controle da expressão gênica
- Sistemas de iluminação
Fundo
- A optogenética permite o controle preciso das funções celulares usando luz.
- PhyB e PIF3 são componentes-chave na regulação gênica responsiva à luz.
- Os LEDs podem ser programados para vários cronogramas de iluminação.
- Este sistema é projetado para ser econômico e adaptável para diferentes configurações experimentais.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para a construção de um sistema de iluminação optogenética.
- Permitir que os pesquisadores controlem a expressão gênica usando comprimentos de onda específicos de luz.
- Facilitar o uso de ferramentas optogenéticas em diversos contextos experimentais.
Métodos Utilizados
- Construção de um circuito elétrico para controle de LED.
- Programação do tempo e comprimentos de onda da iluminação LED.
- Montagem de um microcontrolador para controle automatizado.
- Teste do sistema com várias construções repórter.
Principais Resultados
- Construção bem-sucedida de um sistema de iluminação flexível.
- Aumento da expressão de luciferase observada com maiores quantidades de DNA repórter.
- Demonstrou-se controle sobre a expressão gênica usando luz vermelha e vermelha distante.
- O sistema permite a estimulação óptica em diferentes tipos de amostras.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para experimentação optogenética.
- Os pesquisadores podem utilizar este sistema para várias aplicações na regulação gênica.
- A adesão cuidadosa ao protocolo garante resultados bem-sucedidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
