Name: Diferenciação de células precursoras neurais induzidas por campo elétrico em dispositivos microfluidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda a diferenciação de células precursoras neurais por estimulação de corrente contínua em sistema microfluídico. Este método reduz tempo de preparo e volumes de amostra para pesquisas em neurociência.

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Os autores agradecem ao professor Tang K. Tang, do Instituto de Ciências Biomédicas da Academia Sinica, por sua ajuda no fornecimento de células neurais neurais e progenitoras de camundongos (mNPCs). Os autores também agradecem ao Professor Tang K. Tang e à Sra. Ying-Shan Lee, por sua valiosa discussão sobre a diferenciação dos MNPCs.

1. Design e fabricação do chip MOE
<ol><li>Desenhe padrões para camadas individuais de metacrilato de polimetila (PMMA) e a fita de dupla face usando software apropriado(Figura 1A, Tabela de Materiais). Corte tanto as folhas pmma quanto a fita de dupla face com um escribra de máquina laser CO2 (Figura 1B).<ol>
<li>Ligue o escriba laser CO2 e conecte-o a um computador pessoal. Abra o arquivo de padrão projetado usando o software.</li>
		<li>Coloque as folhas PMMA (275 mm x 400 mm) ou fita dupla face (210 mm x 297 mm) na plataforma do escribra laser(Figura 2A). Concentre o laser na superfície das folhas PMMA ou na fita de dupla face usando a ferramenta de foco automático.</li>
		<li>Selecione o escriba laser como a impressora e, em seguida, "imprima" o padrão usando o escribra laser para iniciar a ablação direta na folha pmma ou fita dupla face e obter padrões individuais na folha ou fita PMMA(Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a película protetora das folhas pmma e limpe a superfície usando gás nitrogênio. NOTA: O desenho do padrão PMMA e a usinagem direta da folha pmma foram realizados de acordo com o relatório anterior17.</li>
	<li>Para unir várias camadas de folhas pmma, empilhar três peças de folhas pmma de 1 mm (camadas 1, 2 e 3), e uni-las sob uma pressão de 5 kg/cm2 em um conector térmico por 30 min a 110 °C para formar o conjunto do canal de fluxo/estimulação elétrica(Figura 2C). NOTA: Diferentes lotes de folha pmma obtida comercialmente têm temperatura de transição de vidro ligeiramente diferente (Tg). A temperatura de ligação ideal precisa ser testada a incrementos de 5 °C perto do Tg.</li>
	<li>Adere 12 peças de adaptadores às aberturas individuais na Camada 1 do conjunto de chips MOE com cola cianoacrilato de ação rápida. NOTA: Os adaptadores são feitos de PMMA por moldagem por injeção. As superfícies planas na parte inferior são para conexão ao chip MOE. Os adaptadores com rosca de parafuso feminino de 1/4W-28 são para conectar plugues brancos com os dedos apertados, conectores inferiores planos ou adaptadores Luer. Tenha cuidado ao usar cola cianoacrilato de ação rápida. Evite espirrar nos olhos.</li>
	<li>Desinfete os substratos PMMA de 1 mm (Camadas 1-3), a fita de dupla face (Camada 4) e o PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) usando irradiação ultravioleta (UV) por 30 minutos antes de montar o chip(Figura 1A).</li>
	<li>Adere aos substratos PMMA de 1 mm (Camadas 1-3) no PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) com a fita de dupla face (Camada 4) para completar o conjunto PMMA (Camadas 1-5)(Figura 1A).</li>
	<li>Prepare o vidro de cobertura limpo para o conjunto do chip.<ol>
<li>Encha uma diluição dez vezes maior do detergente em um frasco de coloração (veja a Tabela de Materiais),e limpe o vidro da tampa neste detergente usando um limpador ultrassônico por 15 minutos.</li>
		<li>Enxágue completamente o frasco de coloração sob água da torneira corrente para remover todos os vestígios do detergente.</li>
		<li>Continue enxaguando com água destilada para remover todos os vestígios de água da torneira e repita o passo 1.7.2 duas vezes.</li>
		<li>Seque o vidro de cobertura limpo soprando-o com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfete o conjunto PMMA (Camadas 1-5), a fita de dupla face (Camada 6) e o vidro de capa (Camada 7) usando irradiação UV dentro de um armário de biossegurança por 30 minutos antes de montar o chip(Figura 1A).</li>
	<li>Adere ao vidro de tampa limpo (Camada 7) ao conjunto PMMA (Camadas 1-5) com a fita de dupla face (Camada 6)(Figura 1A).</li>
	<li>Incubar o chip MOE em uma câmara de vácuo durante a noite; utilizar o conjunto de chips MOE para procedimentos subsequentes(Figura 3).</li>
</ol>2. Revestimento de poli-L-lysina (PLL) no substrato nas regiões de cultura celular
<ol><li>Prepare o tubo de politetrafluoroetileno, conector de fundo plano, conector de cone, adaptador cone-Luer, plugue branco apertado de dedos (também chamado de rolha), adaptador Luer, seringa de bloqueio Luer e bung de borracha preta(Figura 4A, Tabela de Materiais). Esterilize todos os componentes acima em uma autoclave a 121 °C por 30 min.</li>
	<li>Sele as aberturas dos adaptadores da ponte ágar(Figura 1A)com os plugues brancos apertados dos dedos. Conecte o conector de fundo plano ao conjunto do chip MOE através dos adaptadores de entrada e saída média(Figura 4B). Conecte o adaptador cone-Luer às torneiras de 3 vias.</li>
	<li>Adicione 2 mL de solução PLL de 0,01% utilizando uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada média(Figura 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Conecte uma seringa vazia de 3 mL à torneira de 3 vias da tomada média (Figura 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Preencha as regiões de cultura celular com a solução PLL. Bombeie manualmente a solução de revestimento para frente e para trás lentamente. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões culturais.</li>
	<li>Incubar o chip MOE a 37 °C durante a noite em uma incubadora cheia com 5% de atmosfera de CO2.</li>
</ol>3. Preparação da rede de pontes salgadas
<ol><li>Seguindo o passo 2.6, abra as duas torneiras de 3 vias e limpe as bolhas nos canais, bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas.</li>
	<li>Desenhe 3 mL de meio completo (meio de manutenção de células-tronco consistindo da mistura de nutrientes M-12 (DMEM/F12) modificada de Dulbecco, 20 ng/mL EGF, e 20 ng/mL bFGF) em uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada média (Figura 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> e Figura 4B- <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Adicione 3 mL de meio completo para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura celular. Conecte uma seringa vazia de 5 mL à torneira de 3 vias da tomada média (Figura 4B- <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Prepare a rede de ponte de sal(Figura 5).<ol>
<li>Corte o bung de borracha preta para produzir uma abertura, e insira os eletrodos de cloreto de prata (Ag)/prata (AgCl) através do bung de borracha preta e na seringa de bloqueio Luer(Figura 4A).</li>
		<li>Substitua o plugue de dedo branco pelo adaptador Luer e injete 3% de agarose quente para encher o adaptador Luer. NOTA: Para a preparação da agarose quente, dissolva 3 g de pó de agarose em 100 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) e esterilize em uma autoclave a 121 °C por 30 min.</li>
		<li>Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer. Injete 3% de agarose quente através do bung de borracha preta para encher a seringa de bloqueio Luer usando a seringa com agulha. Deixe de 10 a 20 minutos para a agarose esfriar e solidificar. NOTA: Para aumentar a capacidade de volume da agarose, a seringa de bloqueio Luer é montada no adaptador Luer(Figura 4 e Figura 5). Em seguida, os eletrodos grandes são inseridos na seringa de bloqueio Luer. O eletrodo é capaz de fornecer uma estimulação elétrica estável para o experimento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparação de mNPCs
<ol><li>Cultura os mNPCs1 no meio completo em um frasco de cultura celular 25T a 37 °C em uma incubadora cheia com 5% de atmosfera de CO2. Subcultura as células a cada 3-4 dias, e realizar todos os experimentos com células que sofreram 3-8 passagens da fonte original.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, e gire as neurosferas a 100 × g por 5 min. Aspire o supernasciente e lave as neurosferas com 1x PBS (DPBS) de Dulbecco. Desça as neuroesferas a 100 × g por 5 min.</li>
	<li>Aspire o 1x DPBS e, em seguida, resuspenda as neurosferas no meio completo. Misture bem e suavemente.</li>
	<li>Adicione 1 mL da suspensão da neurosfera usando uma seringa de 1 mL que se conecta à torneira de 3 vias da tomada (Figura 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
</ol>5. Instalação do sistema microfluido para estimulação de pulso DC(Figura 6)
<ol><li>Instale o chip MOE sem célula no aquecedor ITO transparente que está preso em um estágio motorizado X-Y-Z programável. NOTA: A temperatura da superfície da ITO é controlada por um controlador de derivativos integrais proporcionais e mantida a 37 °C. Um termopar do tipo K é fixado entre o chip e o aquecedor ITO para monitorar a temperatura das regiões de cultura celular dentro do chip. O chip MOE é instalado em um estágio motorizado X-Y-Z programável e é adequado para aquisição automática de imagens de lapso de tempo em seções de canais individuais. A fabricação do aquecedor ITO e a configuração do sistema de aquecimento da cultura celular foram descritas anteriormente18,19.</li>
	<li>Infundir os mNPCs bombeando manualmente no chip MOE através da tomada média. Incubar o chip MOE semeado por células no aquecedor ITO de 37 °C por 4 h.</li>
	<li>Após 4h, bombeie o meio completo através do chip MOE através da entrada média a uma vazão de 20 μL/h usando uma bomba de seringa. NOTA: Os mNPCs são cultivados e mantidos no chip por mais 24 horas antes da estimulação EF para permitir o apego e o crescimento das células. O líquido de resíduos é coletado em uma seringa vazia de 5 mL conectada à torneira de 3 vias da tomada, mostrada como "resíduo" na Figura 6A. A configuração do sistema microfluido MOE é mostrada na Figura 6. Este sistema microfluido fornece um suprimento contínuo de nutrição para as células. O meio fresco completo é continuamente bombeado para o chip MOE para manter um valor constante de pH. Portanto, as células podem ser cultivadas fora de uma incubadora de CO2.</li>
	<li>Use fios elétricos para conectar um multiplexer EF ao chip MOE através dos eletrodos Ag/AgCl no chip. Conecte um multiplexer EF e um gerador de função a um amplificador para saída de pulsos DC de ondas quadradas com uma magnitude de 300 mV/mm a uma frequência de 100 Hz a 50% de ciclos de serviço (50% de tempo de tempo e 50% de tempo de folga)(Figura 6B).<ol>
<li>Conecte os fios elétricos ao multiplexer EF. Conecte os fios elétricos ao chip MOE através dos eletrodos Ag/AgCl.</li>
		<li>Conecte o multiplexer EF ao amplificador usando fios elétricos. Conecte o gerador de função ao amplificador e ao osciloscópio digital. NOTA: O multiplexer EF é um circuito que inclui a impedância da câmara de cultura no circuito e conecta todas as câmaras individuais em uma rede eletrônica paralela. Cada uma das três câmaras de cultura é eletricamente conectada em série a um resistor variável (Vr) e um amômetro (mostrado como μA na Figura 6A) no multiplexer. A corrente elétrica através de cada câmara de cultura é variada controlando o Vr, e a corrente é mostrada no amômetro correspondente. A força do campo elétrico em cada região de cultura celular foi calculada pela Lei de Ohm, I= σEA, onde eu sou a corrente elétrica, σ (definida como 1,38 S·m-1 para DMEM/F1220) é a condutividade elétrica do meio cultural, E é o campo elétrico, e A é a área transversal da câmara eletrotática. Para a dimensão da região da cultura celular mostrada na Figura 1,a corrente elétrica é de ~87 mA e ~44 mA para pulso DC e DC a 50% do ciclo de responsabilidade, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sujeito os mNPCs a pulsos DC quadrados com uma magnitude de 300 mV/mm na frequência de 100 Hz para 48h. Bombeie continuamente o meio completo a uma taxa de 10 μL/h para fornecer nutrição adequada às células e manter um valor constante de pH no meio.</li>
</ol>6. Ensaios de imunofluorescência de mNPCs após estimulação de DC pulsada
NOTA: Nesta etapa, todo o reagente é bombeado através da entrada média usando uma bomba de seringa.
<ol><li>Após 3, 7 ou 14 dias in vitro (DIV) culminando após a semeadura1, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 25 μL/min por 20 minutos.</li>
	<li>Fixar as células com 4% de paraformaldeído (PFA). Bombeie 4% PFA no chip a uma vazão de 25 μL/min por 20 min para substituir o PBS 1x. Para substituir o PFA de 4%, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 25 μL/min por 20 minutos.</li>
	<li>Bombeie 0,1% Triton X-100 no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min para permeabiliizar as células. Reduza a vazão para 50 μL/h por mais 30 minutos para reagir com as células. Para substituir o Tritão X-100 de 0,1%, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 6 min.</li>
	<li>Bloqueie as células com PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) para reduzir a ligação de anticorpos não específicos. Bombeie 1% BSA no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min. Reduza a vazão para 100 μL/h e bombee por 1h.</li>
	<li>Bombeie os anticorpos para imunossuer dupla no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min, e incubar o chip por 18h a 4 °C. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.</li>
	<li>Bombeie os anticorpos secundários conjugados pela Alexa Fluor no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min. Reduza a vazão para 50 μL/h e bombeie os anticorpos por 1h à temperatura ambiente no escuro. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.</li>
	<li>Para coloração nuclear, bombeie Hoechst 33342 para dentro do chip a uma taxa de fluxo de 20 μL/min por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.</li>
	<li>Após a imunostenção, observe as células usando um microscópio de fluorescência confocal.</li>
</ol>7. Análise de imagens e processamento de dados
<ol><li>Analise as imagens fluorescentes utilizando software com ferramentas de medição incorporadas (ver a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Compare os núcleos hoechst-neutralizado (número total de células) nos grupos de controle e tratamento, e calcule a porcentagem de células expressando cada marcador fenotípico.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+DC+electric+field-induced+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).</li>
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<li>Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+current+electric+fields+of+varying+frequencies%3A+effects+on+proliferation+and+differentiation+of+porcine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Durante a fabricação do chip MOE, os adaptadores são anexados à Camada 1 do chip MOE com cola cianoacrilato de ação rápida. A cola é aplicada em 4 cantos dos adaptadores e, em seguida, a pressão é aplicada uniformemente sobre os adaptadores. O excesso de cola deve ser evitado para garantir a polimerização completa da cola. Além disso, o conjunto completo de chips MOE é incubado em uma câmara de vácuo. Esta etapa ajuda a remover as bolhas entre a camada PMMA, a fita de dupla face e o vidro de cobertura.
<p class="jove...

As células precursoras neurais (NPCs, também conhecidas como células-tronco neurais e progenitoras) podem ser como um candidato promissor para a estratégia terapêutica neurodegenerativa1. Os NPCs indiferenciados têm capacidade de autoconexão, multi potência e capacidade proliferativa2,3. Um estudo anterior relatou que a matriz extracelular e os mediadores moleculares regulam a diferenciação do NPC. O fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF) promovem a proliferação do NPC, mantendo assim o estado indiferenciado4.
Estudos anteriores relataram que a estimulação elétrica pode regular atividades fisiológicas celulares como divisão5,migração6,7,8,diferenciação1,9,10e morte celular11. Os campos elétricos (EFs) desempenham papéis vitais no desenvolvimento e regeneração do desenvolvimento do sistema nervoso central12,13,14. De 2009 a 2019, este laboratório investigou as respostas celulares à aplicação de EF no sistema microfluido1,6,7,8,15,16,17. Um chip eletrostático multicanal, opticamente transparente e eletrotático (MOE) foi projetado para ser adequado para coloração de imunofluorescência para microscopia conocal. O chip tinha alta transparência óptica e boa durabilidade e permitia a condução simultânea de três experimentos independentes de estimulação e várias condições imunossuís em um único estudo. O sistema microfluido é benéfico na simplificação da configuração experimental global e, por sua vez, do reagente e do consumo amostral. Este artigo descreve o desenvolvimento de um sistema de cultura celular microfluidic que foi usado para um estudo de diferenciação celular de longo prazo.

<table><tbody><tr><td>Substratos de PMMA de 1 mm (Camadas 1-3)</td><td>BHT</td><td>K2R20</td><td>Polimetilmetacrilato (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td></tr><tr><td>tubo de plástico de 15 mL</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>Tubo de fundo cônico com tampa, montado, pré-esterilizado</td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Seringas orais de 3 mL, sem agulha</td></tr><tr><td>PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY Folha</td> de <td>PMMA de grau óptico</td></tr> torneira <tr><td>de 3 vias</td><td>NIPRO</td><td>NCN-3L</td><td>Torneira descartável estéril de 3 vias</td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3410</td><td>Seringas orais de 5 mL, sem agulha</td></tr><tr><td>Adaptador</td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>Adaptador PMMA personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Agarose, baixa temperatura de gelificação</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>A.A. Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>Amplificador de alta tensão</td></tr> Software <tr><td>AutoCAD</td> Versão <td>educacional</td><td>da Autodesk</td><td>Redação</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>Suplemento B-27 (50x), menos vitamina A</td></tr><tr><td>Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>Também chamado de recombinante humano FGF-básico</td></tr><tr><td>Bung de borracha preta</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>De seringas orais de 3 mL, sem agulha</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>Reagente bloqueador&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>CO2 laser scriber</td><td>Laser Tools and Technics Corp.&nbsp;</td><td>ILS-II</td><td>Comprado http://www.lttcorp.com/index.htm</td></tr><tr><td>conector de cone</td><td>IDEX Health & Ciência</td><td>F-120X</td><td>Uma peça à prova de dedos 10-32 cone, para 1/16" OD natural</td></tr><tr><td>Cone-Luer adaptador</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-659</td><td>Luer Adapter 10-32 Fêmea para Fêmea Luer, PEEK</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Leica TCS SP5 manual do usuário, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>Aquisição automática de imagem com lapso de tempo</td></tr><tr><td>Osciloscópio digital</td><td>Tektronix</td><td>TDS2024</td><td>Meça sinais de tensão ou corrente ao longo do tempo em um circuito ou componente eletrônico para exibir amplitude e frequência.</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td>comprado de http://en.thd.com.tw/</td></tr> <tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio / mistura de nutrientes do presunto F-12 (DMEM / F12)</td> <td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM / F-12, pó, HEPES</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td> <td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, pó, sem cálcio, sem magnésio</td></tr><tr><td>Multiplexador EF</td><td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td>Personalizado</td><td>Monitore e controle a corrente elétrica em canais individuais</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Também chamado de EGF humano recombinante</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato de ação rápida</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>Adesivo instantâneo de força (líquido)</td></tr><tr><td>Conector de fundo plano</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-206</td><td>Porca macho sem flange Delrin, 1/4-28 fundo plano, para gerador de função azul de 1/16" OD</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A</td><td>Sintetizado de alto desempenho 15 MHz&nbsp; gerador de funções&nbsp; com capacidade de forma de onda arbitrária integrada</td></tr><tr><td>Cabra anti-mouse IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td> <td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>cabra anti-rato IgG H & L (Alexa Fluor 488) pré-adsorvido</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>Anticorpo secundário policlonal de cabra para IgG de coelho - H& L (Alexa Fluor 555), pré-adsorvido</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> National <td>Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>Analise as imagens fluorescentes&nbsp;</td></tr><tr><td>Índio&ndash; Estanho&ndash; vidro de óxido (ITO)</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Para aquecedor ITO</td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase invertida</td><td>OLYMPUS</td><td>CKX41</td><td>Para observação da morfologia celular</td></tr><tr><td>Termopar tipo K</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>Temperatura&nbsp; adaptador Luer de termopares</td></tr><tr><td></td><td>IDEX Health & Ciência</td><td>P618-01</td><td>Luer adaptador fêmea Luer para 1/4-28 macho polipropileno</td></tr><tr><td>Luer seringa de bloqueio</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Para pontes de sal de ágar</td></tr><tr><td>Rato anti-GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>Astrócito marcador</td></tr><tr><td>Oligodendrócito &nbsp; marcador&nbsp; O4&nbsp; anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>Marcador de Oligodendrócitos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixação&nbsp; agente</td></tr><tr><td>Fosfato tampolado com solução salina (PBS)</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td>Solução de lavagem</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina (PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Solução de revestimento</td></tr><tr><td>Espessura de vidros de cobertura de precisão nº 1.5H</td><td>MARIENFELD</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>Programável X-Y-Z estágio motorizado</td><td>Tanlian Inc</td><td>Personalizado</td><td>Comprado de http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>Proporcional&ndash; integral&ndash; controlador derivado (PID)</td><td>Toho Electronics</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Controlador de temperatura&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de PTFE</td><td>Professional Plastics Inc. Taiwan Branch</td><td>Diâmetro externo 1/16 polegadas</td><td>Tubo de PTFE translúcido branco</td></tr><tr><td>Coelho anti-Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>Marcador de neurônio</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 bomba de seringa única programável</td></tr><tr><td>TFD4 detergente</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>Limpador de vidro</td></tr><tr><td>de cobertura Adesivo térmico</td><td>Fornecedor:Kuan-MIN Tech Co.</td><td></td><td>Comprado de http://kmtco.com.tw/</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Solução permeabilizada</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>Limpador ultrassônico Câmara de</td></tr><tr><td>vácuo</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.</td><td>DOV-30</td><td>Forno de secagem a vácuo</td></tr><tr><td>Branco plugue à prova d'água</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-316</td><td>1/4-28 Fundo Plano, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

diferenciação de células precursoras neurais induzidas por campo elétrico em dispositivos microfluidos

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Os campos elétricos fisiológicos (EF) desempenham papéis vitais na migração celular, diferenciação, divisão e morte. Este artigo descreve um sistema de cultura celular microfluidic que foi usado para um estudo de diferenciação celular de longo prazo usando microscopia. O sistema microfluido consiste nos seguintes componentes principais: um chip eletrotático opticamente transparente, um aquecedor transparente de óxido de indium (ITO), uma bomba de enchimento de mídia de cultura, uma fonte de alimentação elétrica, um amplificador de energia de alta frequência, um multiplexer EF, um estágio motorizado X-Y-Z programável e um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera digital. O sistema microfluido é benéfico na simplificação da configuração experimental global e, por sua vez, do reagente e do consumo amostral. Este trabalho envolve a diferenciação de células neurais e progenitoras (NPCs) induzidas pela estimulação de pulso de corrente direta (DC). No meio de manutenção de células-tronco, os NPCs do camundongo (mNPCs) se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos após a estimulação do pulso DC. Os resultados sugerem que o simples tratamento de pulso dc poderia controlar o destino dos mNPCs e poderia ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso. O sistema pode ser usado para a cultura celular em múltiplos canais, para estimulação de EF de longo prazo, para observação morfológica celular e para aquisição automática de imagens de lapso de tempo. Este sistema microfluido não só encurta o tempo experimental necessário, mas também aumenta a precisão do controle sobre o microambiente.

A configuração detalhada do chip MOE é mostrada na Figura 1. O chip microfluido fornece uma abordagem benéfica para reduzir o tamanho da configuração experimental, o volume da amostra e o volume de reagentes. O chip MOE foi projetado para realizar três experimentos independentes de estimulação de EF e várias condições de imunossuagem simultaneamente em um único estudo(Figura 3). Além disso, o chip MOE, que possui alta transparênc...

Neste estudo, apresentamos um protocolo para a diferenciação de células neurais e progenitoras (NPCs) induzidas unicamente pela estimulação de pulso de corrente direta (DC) em um sistema microfluido.

Diferenciação de células precursoras neurais induzidas por campo elétrico em dispositivos microfluidos

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Este estudo apresenta um protocolo para a diferenciação de células precursoras neurais induzidas apenas pela estimulação de pulso de corrente direta em um sistema microfluido. Esta técnica fornece uma abordagem benéfica para reduzir o tempo de configuração experimental, o volume da amostra e o volume do reagente. Além disso, o chip MOE é adequado para observações de microscopia confocal.O simples tratamento de pulso de corrente direta pode controlar o destino das células precursoras neurais do camundongo e pode ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso. Para começar, desenhe padrões para camadas pmma individuais e a fita de dupla face usando software apropriado. Ligue o escriba laser de dióxido de carbono e conecte-o a um computador pessoal.Abra o arquivo de padrão projetado usando o software. Coloque as folhas pmma ou fita dupla face na plataforma do escribra laser e, em seguida, concentre o laser na superfície das folhas pmma ou na fita de dupla face usando a ferramenta de foco automático. Selecione o escriba laser como a impressora e use o escriba laser para iniciar a ablação direta na folha pmma ou fita dupla face.Remova a película protetora das folhas pmma e limpe a superfície usando gás nitrogênio. Para unir várias camadas de folhas pmma, empilhe três pedaços de folhas pmma de um milímetro e uni-las sob uma pressão de cinco quilos por centímetro quadrado em um conector térmico por 30 minutos a 110 graus Celsius para formar o fluxo ou o conjunto do canal de estimulação elétrica. Adere 12 peças de adaptadores às aberturas individuais na camada um do conjunto de chips MOE com cola cianoacrilato de ação rápida.Desinfete os substratos PMMA de um milímetro, a fita de dupla face e o PMMA de grau óptico de três milímetros usando irradiação ultravioleta por 30 minutos antes de montar o chip. Adere aos substratos PMMA de um milímetro no PMMA de grau óptico de três milímetros com a fita de dupla face para completar o conjunto PMMA. Adere o vidro de cobertura limpo ao conjunto PMMA com a fita de dupla face.Sele as aberturas dos adaptadores da ponte ágar com plugues brancos apertados. Conecte o conector inferior plano ao conjunto do chip MOE através dos adaptadores de entrada e saída médias e, em seguida, conecte o adaptador Luer cone às torneiras de três vias. Adicione dois mililitros de solução PLL de 0,01% usando uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média, e conecte uma seringa vazia de três mililitros à torneira de três vias da tomada média.Encha as regiões de cultura celular com a solução PLL e bombeie lentamente a solução de revestimento para frente e para trás. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões culturais. Incubar o chip MOE a 37 graus Celsius durante a noite em uma incubadora cheia de atmosfera de dióxido de carbono de 5%.Abra as duas torneiras de três vias e limpe bolhas nos canais bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas. Desenhe três mililitros de meio completo em uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média e adicione-a para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura celular. Substitua o plugue branco com o adaptador Luer e injete 3% de agarose quente para encher o adaptador.Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer e injete 3% de agarose quente através do bong de borracha preto para encher a seringa de bloqueio Luer. Deixe de 10 a 20 minutos para que a agarose esfrie e solidifique. Instale o chip MOE semeado de célula no aquecedor ITO transparente que é fixado em um estágio motorizado XYZ programável mantido a 37 graus Celsius.Infundir os mNPCs bombeando manualmente para dentro do chip MOE através da tomada média e, em seguida, incubar o chip MOE semeado celular no aquecedor ITO por quatro horas. Use fios elétricos para conectar um multiplexer EF ao chip MOE através dos eletrodos do chip. Conecte um multiplexer EF e um gerador de função a um amplificador para saída de pulsos DC de onda quadrada.Remova todos os conectores e adaptadores de fundo plano no chip MOE e encha os adaptadores com PBS e, em seguida, sele as aberturas do adaptador com parafilm. Após a imunostenção, observe as células usando um microscópio de fluorescência confocal. A estimulação de pulso DC resultou em mNPCs simultâneos diferenciando-se em neurônios, astrócitos e oligódendrocitos no meio de manutenção de células-tronco.Os percentuais de neurônios, astrócitos e oligodenrócitos no grupo controle e no grupo de estimulação são mostrados aqui. Após o tratamento de pulso dc, os mNPCs expressaram um número significativamente alto de neurônios em DIV sete, astrócitos em DIV três, e oligodendrocitos em DIV sete e DIV 14 estavam presentes em níveis relativamente mais altos nos grupos de estimulação do que no grupo controle. Neuroesferas formadas por 30 a 40 células são preferidas para iniciar a diferenciação do MNPC.O crescimento excessivo de mNPCs prejudicará a sobrevivência celular durante o processo de diferenciação.

electric-field-induced-neural-precursor-cell-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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