Diferenciação de células precursoras neurais induzidas por campo elétrico em dispositivos microfluidos
14 de abril de 2021
Neste estudo, apresentamos um protocolo para a diferenciação de células neurais e progenitoras (NPCs) induzidas unicamente pela estimulação de pulso de corrente direta (DC) em um sistema microfluido.
Este estudo apresenta um protocolo para a diferenciação de células precursoras neurais induzidas apenas pela estimulação de pulso de corrente direta em um sistema microfluido. Esta técnica fornece uma abordagem benéfica para reduzir o tempo de configuração experimental, o volume da amostra e o volume do reagente. Além disso, o chip MOE é adequado para observações de microscopia confocal.
O simples tratamento de pulso de corrente direta pode controlar o destino das células precursoras neurais do camundongo e pode ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso. Para começar, desenhe padrões para camadas pmma individuais e a fita de dupla face usando software apropriado. Ligue o escriba laser de dióxido de carbono e conecte-o a um computador pessoal.
Abra o arquivo de padrão projetado usando o software. Coloque as folhas pmma ou fita dupla face na plataforma do escribra laser e, em seguida, concentre o laser na superfície das folhas pmma ou na fita de dupla face usando a ferramenta de foco automático. Selecione o escriba laser como a impressora e use o escriba laser para iniciar a ablação direta na folha pmma ou fita dupla face.
Remova a película protetora das folhas pmma e limpe a superfície usando gás nitrogênio. Para unir várias camadas de folhas pmma, empilhe três pedaços de folhas pmma de um milímetro e uni-las sob uma pressão de cinco quilos por centímetro quadrado em um conector térmico por 30 minutos a 110 graus Celsius para formar o fluxo ou o conjunto do canal de estimulação elétrica. Adere 12 peças de adaptadores às aberturas individuais na camada um do conjunto de chips MOE com cola cianoacrilato de ação rápida.
Desinfete os substratos PMMA de um milímetro, a fita de dupla face e o PMMA de grau óptico de três milímetros usando irradiação ultravioleta por 30 minutos antes de montar o chip. Adere aos substratos PMMA de um milímetro no PMMA de grau óptico de três milímetros com a fita de dupla face para completar o conjunto PMMA. Adere o vidro de cobertura limpo ao conjunto PMMA com a fita de dupla face.
Sele as aberturas dos adaptadores da ponte ágar com plugues brancos apertados. Conecte o conector inferior plano ao conjunto do chip MOE através dos adaptadores de entrada e saída médias e, em seguida, conecte o adaptador Luer cone às torneiras de três vias. Adicione dois mililitros de solução PLL de 0,01% usando uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média, e conecte uma seringa vazia de três mililitros à torneira de três vias da tomada média.
Encha as regiões de cultura celular com a solução PLL e bombeie lentamente a solução de revestimento para frente e para trás. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões culturais. Incubar o chip MOE a 37 graus Celsius durante a noite em uma incubadora cheia de atmosfera de dióxido de carbono de 5%.
Abra as duas torneiras de três vias e limpe bolhas nos canais bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas. Desenhe três mililitros de meio completo em uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média e adicione-a para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura celular. Substitua o plugue branco com o adaptador Luer e injete 3% de agarose quente para encher o adaptador.
Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer e injete 3% de agarose quente através do bong de borracha preto para encher a seringa de bloqueio Luer. Deixe de 10 a 20 minutos para que a agarose esfrie e solidifique. Instale o chip MOE semeado de célula no aquecedor ITO transparente que é fixado em um estágio motorizado XYZ programável mantido a 37 graus Celsius.
Infundir os mNPCs bombeando manualmente para dentro do chip MOE através da tomada média e, em seguida, incubar o chip MOE semeado celular no aquecedor ITO por quatro horas. Use fios elétricos para conectar um multiplexer EF ao chip MOE através dos eletrodos do chip. Conecte um multiplexer EF e um gerador de função a um amplificador para saída de pulsos DC de onda quadrada.
Remova todos os conectores e adaptadores de fundo plano no chip MOE e encha os adaptadores com PBS e, em seguida, sele as aberturas do adaptador com parafilm. Após a imunostenção, observe as células usando um microscópio de fluorescência confocal. A estimulação de pulso DC resultou em mNPCs simultâneos diferenciando-se em neurônios, astrócitos e oligódendrocitos no meio de manutenção de células-tronco.
Os percentuais de neurônios, astrócitos e oligodenrócitos no grupo controle e no grupo de estimulação são mostrados aqui. Após o tratamento de pulso dc, os mNPCs expressaram um número significativamente alto de neurônios em DIV sete, astrócitos em DIV três, e oligodendrocitos em DIV sete e DIV 14 estavam presentes em níveis relativamente mais altos nos grupos de estimulação do que no grupo controle. Neuroesferas formadas por 30 a 40 células são preferidas para iniciar a diferenciação do MNPC.
O crescimento excessivo de mNPCs prejudicará a sobrevivência celular durante o processo de diferenciação.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para a diferenciação de células precursoras neurais induzida pela estimulação com pulsos de corrente contínua em um sistema microfluídico. Esta técnica reduz o tempo de preparação experimental, o volume de amostra e o volume de reagentes, tornando-se eficiente para aplicações em pesquisa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microfluídica
Antecedentes
- As células precursoras neurais (NPCs) são fundamentais para compreender o desenvolvimento neural.
- A estimulação por pulsos de corrente contínua pode influenciar o destino celular.
- Os sistemas microfluídicos permitem um controle preciso das condições experimentais.
- Essa abordagem pode auxiliar no desenvolvimento de terapias para distúrbios do sistema nervoso.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para a diferenciação de NPCs.
- Utilizar a estimulação com corrente contínua como um método para controlar o destino celular.
- Demonstrar a eficácia de um sistema microfluídico na pesquisa em neurociência.
Métodos Utilizados
- Projetar padrões para camadas de PMMA e fita dupla face.
- Utilizar um riscador a laser de dióxido de carbono para fabricação.
- Aplicar estimulação com pulso de corrente contínua em NPCs.
- Realizar observações por microscopia confocal para análise.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de NPCs utilizando o protocolo proposto.
- Redução no tempo de preparação experimental e no uso de recursos.
- Viabilidade do uso do chip MOE para microscopia.
- Aplicações potenciais em estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem simplificada para a diferenciação de NPCs.
- A estimulação com corrente contínua é eficaz no controle do destino celular.
- Os sistemas microfluídicos aumentam a eficiência experimental na neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma microfluídica permite um controle preciso da diferenciação de células precursoras neurais por meio da estimulação com pulsos de corrente contínua, oferecendo um modelo escalonável e eficiente em recursos para a validação de alvos na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Ao reduzir a complexidade experimental e o consumo de reagentes, ela apóia a desmistificação mecanicista em estágios iniciais e aumenta a confiança preditiva nas estratégias de modulação do destino celular. A compatibilidade do sistema com estimulação de longo prazo e imagem automatizada o posiciona para integração em fluxos de trabalho de descoberta voltados para terapêuticas do sistema nervoso.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar sinais elétricos como reguladores do destino de células precursoras neurais, apoiando testes de hipóteses-alvo em vias de desenvolvimento neural.
- Valor Operacional: Reduz volumes de amostras e reagentes por meio de confinamento microfluídico, diminuindo custos em campanhas iniciais de triagem de alvos.
- Valor Preditivo: Fornece leituras quantitativas da diferenciação neuronal, astrocítica e oligodendrocítica, permitindo decisões baseadas em dados sobre alvos modulatórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera saídas padronizadas e reprodutíveis de diferenciação sob parâmetros controlados de campo elétrico, adequadas para a otimização de ensaios.
- Valor Operacional: Facilita testes multiplexados de condições por meio de desenhos baseados em canais, aumentando a produtividade na avaliação de compostos ou estímulos.
- Prontidão para Ensaios: Permite cultivo de longo prazo e imagens com lapso de tempo, possibilitando o perfil cinético da dinâmica de diferenciação para validação de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Utiliza células precursoras neurais de camundongo em um microambiente definido, aumentando a relevância para os processos de diferenciação neural in vivo.
- Modelagem Pré-clínica: Permite a geração de linhagens gliais e neuronais a partir de um progenitor comum, sendo útil para modelar distúrbios do sistema nervoso.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação do viés de diferenciação sob estimulação, contribuindo para o perfil mecanicista de segurança e eficácia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial do descobrimento, especialmente nas etapas de validação de alvos e identificação de compostos iniciais, nas quais o entendimento mecanicista dos reguladores do destino celular é essencial. Ele auxilia campanhas de triagem ao fornecer um sistema controlado e quantificável para avaliar a atividade biológica de moduladores elétricos ou farmacológicos. A saída da plataforma — métricas de diferenciação específicas para cada linhagem — alimenta pipelines analíticos utilizados para priorizar alvos com confiança preditiva em mecanismos de reparação neural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses em vias de sinalização bioelétrica em células precursoras neurais, reduzindo a ambiguidade no mecanismo-alvo.
- Triagem: Permite ensaios reprodutíveis e quantitativos de diferenciação sob estímulo elétrico definido, melhorando a confiabilidade do ensaio.
- Análise: Fornece pontos finais mensuráveis (por exemplo, % de neurônios, astrócitos, oligodendrócitos) para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Modela a dinâmica de diferenciação relevante para distúrbios do sistema nervoso, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Projetado para uso repetido em múltiplas condições experimentais, promovendo padronização e consistência entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao isolar a estimulação elétrica como uma variável definida na determinação do destino celular.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de diferenciação por meio da precisão microfluídica, melhorando a reprodutibilidade entre diferentes locais e equipes.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer leituras precoces e mecanicistas sobre o comprometimento da linhagem, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos que modulam a diferenciação neural, melhorando a eficiência do capital em portfólios de neurociência.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em montagem de dispositivos microfluídicos, eletrofisiologia e cultivo de células-tronco neurais.
- Depende do acesso a ferramentas de fabricação a laser, aquecedores de ITO, multiplexadores de CE e sistemas de microscopia invertida.
- Necessita padronização dos parâmetros elétricos (largura do pulso, frequência, amplitude) entre experimentos para resultados reprodutíveis.
- A adaptação a células precursoras neurais derivadas de humanos pode exigir otimização dos parâmetros de estimulação e das condições de cultivo.
- A estabilidade prolongada dos eletrodos e o bioenfoucamento em estudos de estimulação crônica representam limitações práticas a serem consideradas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
