Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Estudos moleculares tradicionais do cerebelo foram feitos em extratos cerebelares inteiros, o que pode mascarar quaisquer distinções entre regiões cerebelares específicas. Este protocolo permite avaliar regiões distintas do cerebelo separadamente e permite a exploração de mecanismos moleculares que podem estar subjacentes às suas contribuições únicas para uma variedade de comportamentos e progressão da doença. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a dissecção rápida e reprodutível de quatro regiões cerebelares, os núcleos cerebelares profundos, o córtex cerebelar anterior e posterior do Vermis e o córtex cerebelar dos hemisférios.

Depois de decapitar o camundongo sacrificado, faça uma incisão com uma lâmina de barbear ao longo da linha sagital medial da cabeça, começando no nariz e continuando até o fim. Separe a pele e use a lâmina de barbear para cortar o músculo de cada lado, cortando os canais auditivos. Usando uma tesoura de dissecação, apare muitas regiões da medula espinhal até onde o tronco cerebral encontra o cerebelo, tomando cuidado para não danificar o cerebelo.

Insira uma das lâminas da tesoura vascular no espaço entre o tronco encefálico e a coluna vertebral e corte em direção ao canal auditivo, levantando para cima enquanto corta para limitar os danos ao tecido. Continue a cortar ao longo da borda do crânio em direção aos bulbos olfatórios. Usando a pinça romba, retire suavemente a parte de trás deste crânio para descobrir a região posterior do cérebro e do cerebelo.

Posicione a pinça romba ao longo da borda cortada do crânio e descasque o crânio para cima e sobre o cérebro. Apare o resto do crânio com a tesoura vascular e uma pinça romba, limpando a maior parte da parte superior do cérebro. Levante levemente o cérebro com a microespátula para remover os bulbos olfatórios do crânio restante e desconecte as fibras do trato óptico.

O cérebro deve se libertar facilmente neste momento. Coloque o cérebro na placa de Petri, sentado no gelo e remova qualquer crânio restante ou outros detritos. Coloque suavemente o cérebro na matriz cerebral com o lado dorsal para cima.

Certifique-se de que esteja nivelado na matriz e que a linha média esteja no centro. Coloque uma lâmina de barbear ao longo da linha média sagital, certificando-se de que a lâmina empurre todo o caminho até o fundo da matriz. Coloque outra lâmina de barbear um milímetro ao lado da primeira lâmina.

Coloque mais duas lâminas, resultando em três lâminas colocadas em um lado do cérebro, todas com um milímetro de distância. Repita isso do outro lado. Pegue cuidadosamente a extremidade frontal e traseira das lâminas de barbear e levante-as para fora da matriz.

Descarte o lenço do lado de fora das lâminas de barbear. Lentamente, separe uma lâmina de barbear de cada vez das outras, tomando cuidado para não danificar as seções de tecido. Deslize a seção de tecido para fora da lâmina de barbear e para a lâmina de vidro com a micro espátula.

Seis seções cerebrais sagitais devem ser coletadas. As seções laterais mais avançadas terão DCN visível. Para isolar o DCN, segure uma ponta de pipeta de 200 microlitros perpendicularmente sobre o DCN e empurre para baixo através do tecido balançando firmemente em todas as direções.

Levante a pipeta e confirme visualmente a presença do tecido na ponta. Coloque um dedo na parte superior da ponta e empurre para baixo, fazendo com que o tecido fique saliente. Insira a ponta em um tubo de microficha corretamente rotulado e certifique-se de que o punção de tecido seja colocado no fundo do tubo.

Repita isso para as três seções restantes, colocando os punções DCN no mesmo tubo. Congele rapidamente o tubo em nitrogênio líquido. Afaste o resto do tecido cerebral ao redor do cerebelo nas seções onde o DCN foi extraído.

Use uma pinça romba para pegar suavemente essas seções do córtex cerebelar do hemisfério e colocá-las nos respectivos tubos de microfichas e, em seguida, congele-as rapidamente. Nas duas últimas seções vermais, afaste o tecido cerebral circundante para deixar apenas o cerebelo. Usando uma lâmina de barbear, faça um corte separando os labiais anteriores dos labiais posteriores.

Certifique-se de que o corte seja logo após a formação do labial seis e não inclua o labial 10. Usando uma pinça romba, coloque cuidadosamente as seções do córtex cerebelar anterior e do córtex cerebelar posterior em seus respectivos tubos de microficha e congele-os rapidamente, deixando os tubos em nitrogênio líquido por cinco minutos. Coloque os tubos de microficha no gelo para evitar que o tecido descongele muito rapidamente e aplique 150 microlitros de solução de isolamento de RNA frio no tubo de microficha e, em seguida, homogeneize com um pilão esterilizado.

Uma vez que o tecido é homogeneizado, pipete a solução para cima e para baixo para garantir que não haja tecido intacto restante. Além disso, quebre todos os pequenos pedaços de tecido puxando-os para uma seringa de insulina algumas vezes. Adicione mais 350 microlitros do reagente, pipete para cima e para baixo para misturar bem e deixe descansar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Adicione 150 microlitros de clorofórmio ao tubo e agite-o vigorosamente, depois deixe descansar por dois a três minutos. Centrifugue a 12.000 vezes G a 15 graus Celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga e ajuste a temperatura da centrífuga para quatro graus Celsius.

Transferir apenas a fase aquosa límpida para um novo tubo, tendo o cuidado de não perturbar a interfase opaca. Guarde ou descarte a solução restante nos tubos. Adicione álcool isopropílico 100% na proporção de um para dois e misture bem pipetando para cima e para baixo.

Deixe a amostra descansar em temperatura ambiente por 10 minutos para precipitar o RNA da solução. Centrifugue a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos, colocando todos os tubos na mesma orientação para facilitar a visualização do pellet. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos e remova o sobrenadante com a pipeta, certificando-se de não interromper o pellet.

O pellet é semelhante a um gel e difícil de ver, então estime onde ele está com base na orientação dos tubos na centrífuga. Depois de remover todo o sobrenadante, adicione 500 microlitros de etanol a 75%, vortex brevemente e centrifugue a 7.500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Remover o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o sedimento.

Deixe as tampas abertas para secar a amostra por cinco a 10 minutos. Depois de seco, ressuspenda o pellet na água livre do DNA a 20 microlitros para as amostras para DCN e 30 microlitros para todos os outros. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada.

Este protocolo foi usado para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo e explorar as diferenças regionais na expressão gênica. Os níveis de expressão de Aldolase C, parvalbumina e KCNG4 foram avaliados por PCR quantitativo em tempo real. A aldolase C é mais altamente expressa no vermis cerebelar posterior.

Mas menor no DCN e na região anterior do vermis quando comparado à dissecção cerebelar em massa. A parvalbumina está igualmente presente no vermis anterior do DCN, no vermis posterior e nos córtices cerebelares do hemisfério, quando comparada aos extratos cerebelares a granel. O KCNG4 é significativamente enriquecido no DCN e no vermis interior, mas não no vérmis posterior ou nos hemisférios quando comparado à extração em massa.

Para comparar diretamente a expressão da aldolase C no córtex cerebelar, os níveis de expressão foram comparados com o vermis anterior. O nível de expressão da aldolase C foi significativamente maior no Vermis posterior e tendendo a ser maior nos hemisférios cerebelares. O RNA extraído dessas regiões também pode ser usado em experimentos de sequenciamento de RNA.

A sequência de RNA comparando-os para regiões cerebelares forneceria informações mais detalhadas sobre os mecanismos moleculares, subjacentes às funções discretas dessas regiões. Bem como diferenças potenciais em sua vulnerabilidade na doença.