Name: Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a preparar extratos citoplasmáticos de ovos de Xenopus laevis para imagem em tempo real da dinâmica citoplasmática. Este método permite visualizar a auto-organização espacial e estruturas de microtúbulos em compartimentos celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) concedidas a James E. Ferrell, Jr.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Preparação de lâminas e folhas de cobertura
<ol><li>Aplique uma camada de fita adesiva de etileno propileno fluorado (FEP) em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Prepare as coberturas revestidas com fita FEP da mesma forma (Figura 1A).</li>
	<li>Aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP do slide. Deixe o forro protetor na parte superior descascado (Figura 1A). NOTA: As lâminas e as folhas de cobertura devem ser preparadas antes da experiência. Eles podem ser usados imediatamente ou armazenados em caixas para evitar o acúmulo de poeira nas superfícies. O poço no espaçador de imagem tem 120 μm de profundidade e um diâmetro de 9 mm.</li>
</ol>2. Preparação e imagem ao vivo de extratos de ovos presos entre fases
NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de Deming e Kornbluth19, Murray20 e Smythe e Newport25 com modificações. Todas as etapas devem ser executadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
<ol><li>Três a dez dias antes da coleta de ovos, injete rãs Xenopus laevis maduras por via subcutânea no saco linfático dorsal com 100 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG).</li>
	<li>Dezesseis a dezoito horas antes da coleta planejada de ovos, injete as rãs da etapa 2.1 com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Deixar as rãs a 18 °C em tampão de postura de ovos (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5 mM CaCl 2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, preparar como solução-mãe 20x a pH 7,4 e diluir com água limpa do tanque de rãs a 1x antes da utilização) até à recolha dos ovos.</li>
	<li>No dia do experimento, colete ovos em uma grande placa de Petri de vidro e avalie a qualidade dos ovos. Descarte todos os ovos que se pareçam com bolas brancas inchadas ou que apareçam em uma corda (Figura 1B). Examine os ovos sob um estereoscópio, mantenha os ovos com aparência normal (Figura 1C) e descarte aqueles com pigmento irregular ou manchado (Figura 1D). NOTA: Este protocolo funciona com ovos coletados de uma única rã, que normalmente põe 25 mL de ovos em 16 horas após a injeção de hCG. Normalmente, um total de 3 a 6 rãs são induzidas por hCG, e a rã com a mais alta qualidade de ovos é escolhida para o experimento de preparação do extrato.</li>
	<li>Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mL e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação.</li>
	<li>Incubar os ovos em 100 ml de solução desanimadora preparada na hora (L-cisteína a 2% p/v em água, ajustar para pH 8,0 com NaOH) e agitá-los suavemente periodicamente. Após cerca de 3 minutos, despeje a solução e adicione 100 mL de solução fresca de dejelling. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados (sem espaço entre os ovos), mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de 5 minutos.</li>
	<li>Remover o máximo possível da solução desanimadora por decantação e lavar os ovos em tampão MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparado como uma solução-mãe 10x, ajustado ao pH 7,8 com NaOH e diluído em água Milli-Q antes do uso) adicionando o tampão, girando os ovos e, em seguida, despejando o tampão. Repita algumas vezes até que um total de 1 L do tampão seja usado para as lavagens.</li>
	<li>Lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mL de tampão de lise do ovo (250 mM de sacarose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, feito fresco e ajustado ao pH 7,7 com KOH). Remova os ovos com aparência anormal usando uma pipeta Pasteur entre as lavagens. NOTA: Ovos com aparência anormal referem-se àqueles que se parecem com bolas brancas inchadas (Figura 1B), têm pigmentação manchada (Figura 1D), estão se deteriorando com uma região branca crescente (Figura 1E) ou mostram área pigmentada escurecida e contraída no hemisfério animal (Figura 1F).</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência com a ponta bem aberta, transfira os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mL contendo 1 mL de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 x g por 15 segundos para embalar os ovos.</li>
	<li>Remova o máximo possível do tampão de lise do ovo do topo dos ovos embalados usando uma pipeta Pasteur. NOTA: É importante remover o máximo de tampão possível dos ovos embalados, a fim de minimizar a diluição do extrato de ovo. Às vezes, é necessário remover alguns ovos soltos junto com o tampão residual para conseguir isso.</li>
	<li>Determine o volume aproximado dos ovos embalados e, em seguida, adicione 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina, 5 μg/mL de citocalasina B e 50 μg/mL de cicloheximida diretamente sobre os ovos embalados. NOTA: A aprotinina e a leupeptina são inibidores da protease. A citocalasina B inibe a polimerização da actina, impedindo a contração e gelificação do extrato26. A cicloheximida inibe a síntese de proteínas, mantendo assim o extrato na interfase do ciclo celular.</li>
	<li>Esmagar os ovos centrifugando o tubo a 12.000 x g, 4 °C, durante 15 minutos, num rotor de balde oscilante. NOTA: Ao final da centrifugação, os ovos devem ter se rompido e o lisado separado em três camadas principais: uma camada lipídica amarela no topo, o extrato citoplasmático (também chamado de extrato bruto) no meio e uma camada densa escura contendo os grânulos de pigmento na parte inferior (Figura 1G).</li>
	<li>Ligue uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima, perfure o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente. NOTA: Desenhe o extrato citoplasmático lentamente para evitar a inclusão de conteúdo contaminante da camada lipídica amarela.</li>
	<li>Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo. Use o extrato dentro de 1 hora.</li>
	<li>Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência. NOTA: As sondas de imagem de fluorescência rotulam estruturas citoplasmáticas específicas para que possam ser visualizadas por um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada na etapa 1.2 e deposite aproximadamente 7 μL de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço. Prossiga rapidamente para a geração de imagens (Figura 1H,I).</li>
	<li>Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas e nos intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência. Observação : normalmente, um objetivo de 5x é usado para geração de imagens. O estágio motorizado permite a aquisição automatizada de imagens em várias posições espaciais definidas. A microscopia de campo brilhante visualiza estruturas citoplasmáticas com diferentes graus de transparência. A microscopia de fluorescência visualiza as estruturas citoplasmáticas especificamente marcadas pelas sondas de imagem de fluorescência adicionadas na etapa 2.14. A câmera registra imagens de lapso de tempo dessas estruturas, capturando assim a dinâmica da organização citoplasmática.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os extratos de ovos de Xenopus laevis emergiram como um poderoso sistema modelo para estudos baseados em imagens de várias estruturas subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organização citoplasmática em um todo<sup class="...

O citoplasma constitui o volume principal de uma célula e tem uma organização distinta. Os ingredientes do citoplasma eucariótico podem se auto-montar em uma ampla gama de estruturas espaciais, como as ásteres de microtúbulos e o aparelho de Golgi, que por sua vez são dinamicamente dispostos e transformados dependendo da identidade da célula e do estado fisiológico. Compreender a organização espacial do citoplasma e sua ligação com as funções celulares é, portanto, importante para entender como a célula funciona. Os extratos de ovos de Xenopus laevis têm sido tradicionalmente utilizados para ensaios bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, mas trabalhos recentes os estabelecem como um poderoso sistema de imagem viva para estudos mecanicistas de estruturas citoplasmáticas e suas funções celulares 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Esses extratos não diluídos preservam muitas estruturas e funções do citoplasma, ao mesmo tempo em que permitem manipulações diretas de conteúdo citoplasmático não alcançáveis em modelos convencionais baseados em células19,20. Isso os torna ideais para caracterizar fenômenos citoplasmáticos e dissecar seus fundamentos mecanicistas.
Os métodos existentes para extratos de imagem requerem modificações químicas de superfície ou fabricação de dispositivos microfluídicos. Um método baseado em deslizamento de cobertura requer a passivação de polietilenoglicol (PEG) de coberturas de vidro21. Um método baseado em microemulsão requer a deposição de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em superfícies de vidro22,23. Os sistemas de base microfluídica permitem o controle preciso do volume, geometria e composição das gotículas de extrato, mas requerem instalações especializadas de microfabricação 11,12,24.
Aqui apresentamos um método alternativo para a imagem de extratos de ovos que é fácil de implementar e utiliza materiais prontamente disponíveis e de baixo custo. Isso inclui a preparação de uma câmara de imagem com uma lâmina e uma folha de cobertura revestida com fita fluorada de etileno propileno (FEP). A câmara pode ser usada para extratos de imagem com uma variedade de sistemas de microscopia, incluindo estereoscópios e microscópios verticais e invertidos. Este método não requer tratamento químico de superfícies, ao mesmo tempo em que alcança clareza óptica semelhante obtida com os métodos existentes à base de vidro discutidos acima. Ele é projetado para criar imagens de uma camada de extratos com uma espessura uniforme em um campo 2D e pode ser facilmente estendido para visualizar um volume 3D de extratos. É bem adequado para imagens de lapso de tempo do comportamento citoplasmático coletivo em um grande campo de visão.
Usamos extratos de ovos presos entre fases para demonstrar nosso método de imagem. A preparação do extrato segue o protocolo de Deming e Kornbluth19. Resumidamente, os ovos naturalmente presos na metáfase da meiose II são esmagados por um giro de baixa velocidade. Este spin libera o citoplasma da parada meiótica e permite que o extrato prossiga para a interfase. Normalmente, a citocalasina B é adicionada antes do spin de esmagamento para inibir a formação de F-actina. No entanto, pode ser omitido se a F-actina for desejada. A cicloheximida também é adicionada antes do spin de esmagamento para evitar que o extrato interfásico entre na próxima mitose. Os extratos são posteriormente colocados nas câmaras de imagem acima mencionadas e colocados em um microscópio. Finalmente, as imagens são gravadas ao longo do tempo em intervalos definidos por uma câmera conectada ao microscópio, produzindo séries de imagens de lapso de tempo que capturam o comportamento dinâmico da extração em um campo 2D.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 17 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm quadrado #1 vidro de cobertura</td><td>Corning</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>MilliporeSigma</td><td>10236624001</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MilliporeSigma</td><td>01810</td><td>Inibidor da síntese de proteínas</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>MilliporeSigma</td><td>C6762</td><td>Actina inibidor de polimerização</td></tr><tr><td>Fêmea Xenopus laevis rãs</td><td>Nasco</td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente HiLyte 488 proteína tubulina marcada</td><td>Citoesqueleto, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>Para visualizar o citoesqueleto de microtúbulos</td></tr><tr><td>Fluorescent HiLyte 647 rotulado com proteína tubulina</td><td>Citoesqueleto, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>Para visualizar o citoesqueleto de microtúbulos</td></tr><tr><td>Fita opticamente transparente de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>CS Hyde company</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana (hCG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Espaçador de imagem</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>MilliporeSigma</td><td>11017101001</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>MilliporeSigma</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7512</td><td>Para visualizar mitocôndrias</td></tr><tr><td>Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG)</td><td>Aplicador</td><td>de rolo RP1782725000</td><td></td>BioVendor</tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B07HMBJSP8</td><td>Para aplicar a fita FEP nas lâminas de vidro e lamínulas</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de um gume</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Para remover fita FEP excessiva</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Tradicionalmente usados para ensaios bioquímicos a granel, os extratos de ovos de Xenopus laevis surgiram como uma poderosa ferramenta baseada em imagens para estudar fenômenos citoplasmáticos, como citocinese, formação de fuso mitótico e montagem do núcleo. Com base nos primeiros métodos que visualizavam extratos fixos amostrados em pontos de tempo esparsos, abordagens recentes de extratos ao vivo de imagem usando microscopia de lapso de tempo, revelando características mais dinâmicas com resolução temporal aprimorada. Esses métodos geralmente requerem tratamentos de superfície sofisticados do vaso de imagem. Aqui apresentamos um método alternativo para imagens vivas de extratos de ovos que não requerem tratamento químico de superfície. É simples de implementar e utiliza consumíveis de laboratório produzidos em massa para imagens. Descrevemos um sistema que pode ser usado tanto para microscopia de campo amplo quanto para microscopia confocal. Ele é projetado para extratos de imagem em um campo 2-dimensional (2D), mas pode ser facilmente estendido para imagens em 3D. É bem adequado para estudar a formação de padrões espaciais dentro do citoplasma. Com dados representativos, demonstramos a organização dinâmica típica de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em extratos interfásicos preparados usando este método. Esses dados de imagem podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica citoplasmática e a organização espacial.

Extratos de ovos de Xenopus laevis podem ser usados para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase. A Figura 2A mostra os resultados de um experimento bem-sucedido. Suplementamos extratos interfaseados com núcleos de espermatozoides desembranados de Xenopus laevis 19 na concentração de 27 núcleos/μL e 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteína de fusão c...

Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Este método é adequado para imagens vivas da dinâmica citoplasmática utilizando extratos de ovos de rã, possibilitando o estudo de informações de padrões espaciais no citoplasma. As amostras podem ser moldadas em uma camada com uma espessura uniforme e ajustável e fotografadas em um campo 2D ou volume 3D. Este método é rentável e fácil de implementar.Comece aplicando uma camada de fita adesiva FEP em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, prepare os deslizamentos de tampa revestidos com fita FEP da mesma maneira.Em seguida, aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP da lâmina, deixando o revestimento protetor descascado. Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mililitros e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação. Em seguida, incube os ovos em 100 mililitros de solução desanimadora recém-preparada e agite-os suavemente.Após cerca de três minutos, despeje a solução e adicione 100 mililitros de solução fresca de desânimo. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados, mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de cinco minutos. Após a incubação, retire a solução desanimadora o máximo possível e lave os ovos em tampão MMR 0,25x.Gire os ovos e, em seguida, despeje o tampão. Repita algumas vezes até que um total de um litro do tampão seja usado para as lavagens. Em seguida, lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mililitros de tampão de lise do ovo, removendo ovos anormais entre as lavagens.Em seguida, use uma pipeta de transferência com uma ponta de corte larga para transferir os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mililitros contendo um mililitro de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 g por 15 segundos para embalar os ovos. Em seguida, remova o máximo possível do tampão de lise do ovo usando uma pipeta Pasteur.Determinar o volume aproximado dos ovos embalados. em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro cada de aprotinina, leupeptina e citocalasina B e 50 microgramas por mililitro de ciclohexamida diretamente em cima dos ovos embalados. Esmague os ovos centrifundindo o tubo por 15 minutos a 12.000 g e quatro graus Celsius em um rotor de balde oscilante.Em seguida, coloque uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima puncione o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente. Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo.Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência. Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada e deposite aproximadamente sete microlitros de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço e proceder rapidamente à imagem.Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas em intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência. Um experimento de lapso de tempo usando extratos de ovos de xenopus laevis para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase é mostrado aqui.Após cerca de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, áreas esgotadas de componentes citoplasmáticos de dispersão de luz foram visíveis tanto no campo brilhante quanto nos canais mitocondriais. Por cerca de 60 minutos à temperatura ambiente, um padrão espacial que consiste em compartimentos semelhantes a células deve ser bem estabelecido com microtúbulos formando uma estrutura oca semelhante a uma coroa de flores e mitocôndrias claramente divididas em cada compartimento. Uma comparação do desempenho do extrato em câmaras de imagem com e sem fitas FEP em vidro é mostrada aqui.Na câmara feita com vidro FEP colado o extrato auto-organizado em padrões normais de célula como eles. Na câmara onde as superfícies de vidro não estavam cobertas pela fita FEP, o extrato mostrou padrões anormais de campo brilhante e microtúbulos que se tornaram cada vez mais interrompidos ao longo do tempo. Não foram observadas diferenças significativas na importação nuclear da proteína GST-mCherry-NLS.As coisas importantes a lembrar são passivar as superfícies de vidro com fita FEP e remover todos os ovos ruins durante a preparação do extrato. Com este sistema, podemos controlar facilmente a espessura da amostra de extrato, abrindo caminho para padrões citoplasmáticos de imagem em 3D, usando microscopia de folha de luz.

xenopus-laevis-egg-extract-preparation-live-imaging-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Extratos de ovo cru e fracionado Xenopus pode ser usado para fornecer ingredientes para reconstituir processos celulares para análise morfológica e bioquímica. Lise de ovo e centrifugação diferencial são usados ​​para preparar o extrato bruto que, por sua vez, usado para preparar extratos fracionados e preparações de membrana de luz.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

Um protocolo para geração de imagens ao vivo das proteínas GFP-tagged ou estruturas autofluorescente no...

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

Os mecanismos de escalonamento celular e intracelular permanecem indescritíveis. O uso de extratos de embriões de Xenopus tem se tornado cada vez mais comum para elucidar mecanismos de regulação do tamanho das organelas. Este método descreve a preparação do extrato de embrião e um novo ensaio de escala nuclear através do qual os mecanismos de regulação do tamanho nuclear podem ser identificados.

Um ensaio-Free Cell Usando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Descrevemos um protocolo simples para desenvolver organoides epiteliais mucociliais a partir de células ectoderm profundas isoladas dos embriões Xenopus laevis. Os progenitores multipotentes regeneram precursores de células de cálice epitelial e permitem o acompanhamento ao vivo da iniciação e progressão das transições celulares na superfície dos organoides.

Organoides epiteliais mucociliais de células embrionárias xenopus: geração, cultura e imagem ao vivo de alta resolução

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aprenda a preparar extratos citoplasmáticos de ovos de Xenopus laevis para imagem em tempo real da dinâmica citoplasmática. Este método permite visualizar a auto-organização espacial e estruturas de microtúbulos em compartimentos celulares.

Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Explorar mais vídeos