Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica
6 de junho de 2021
Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .
Este método é adequado para imagens vivas da dinâmica citoplasmática utilizando extratos de ovos de rã, possibilitando o estudo de informações de padrões espaciais no citoplasma. As amostras podem ser moldadas em uma camada com uma espessura uniforme e ajustável e fotografadas em um campo 2D ou volume 3D. Este método é rentável e fácil de implementar.
Comece aplicando uma camada de fita adesiva FEP em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, prepare os deslizamentos de tampa revestidos com fita FEP da mesma maneira.
Em seguida, aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP da lâmina, deixando o revestimento protetor descascado. Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mililitros e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação. Em seguida, incube os ovos em 100 mililitros de solução desanimadora recém-preparada e agite-os suavemente.
Após cerca de três minutos, despeje a solução e adicione 100 mililitros de solução fresca de desânimo. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados, mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de cinco minutos. Após a incubação, retire a solução desanimadora o máximo possível e lave os ovos em tampão MMR 0,25x.
Gire os ovos e, em seguida, despeje o tampão. Repita algumas vezes até que um total de um litro do tampão seja usado para as lavagens. Em seguida, lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mililitros de tampão de lise do ovo, removendo ovos anormais entre as lavagens.
Em seguida, use uma pipeta de transferência com uma ponta de corte larga para transferir os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mililitros contendo um mililitro de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 g por 15 segundos para embalar os ovos. Em seguida, remova o máximo possível do tampão de lise do ovo usando uma pipeta Pasteur.
Determinar o volume aproximado dos ovos embalados. em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro cada de aprotinina, leupeptina e citocalasina B e 50 microgramas por mililitro de ciclohexamida diretamente em cima dos ovos embalados. Esmague os ovos centrifundindo o tubo por 15 minutos a 12.000 g e quatro graus Celsius em um rotor de balde oscilante.
Em seguida, coloque uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima puncione o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente. Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo.
Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência. Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada e deposite aproximadamente sete microlitros de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço e proceder rapidamente à imagem.
Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas em intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência. Um experimento de lapso de tempo usando extratos de ovos de xenopus laevis para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase é mostrado aqui.
Após cerca de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, áreas esgotadas de componentes citoplasmáticos de dispersão de luz foram visíveis tanto no campo brilhante quanto nos canais mitocondriais. Por cerca de 60 minutos à temperatura ambiente, um padrão espacial que consiste em compartimentos semelhantes a células deve ser bem estabelecido com microtúbulos formando uma estrutura oca semelhante a uma coroa de flores e mitocôndrias claramente divididas em cada compartimento. Uma comparação do desempenho do extrato em câmaras de imagem com e sem fitas FEP em vidro é mostrada aqui.
Na câmara feita com vidro FEP colado o extrato auto-organizado em padrões normais de célula como eles. Na câmara onde as superfícies de vidro não estavam cobertas pela fita FEP, o extrato mostrou padrões anormais de campo brilhante e microtúbulos que se tornaram cada vez mais interrompidos ao longo do tempo. Não foram observadas diferenças significativas na importação nuclear da proteína GST-mCherry-NLS.
As coisas importantes a lembrar são passivar as superfícies de vidro com fita FEP e remover todos os ovos ruins durante a preparação do extrato. Com este sistema, podemos controlar facilmente a espessura da amostra de extrato, abrindo caminho para padrões citoplasmáticos de imagem em 3D, usando microscopia de folha de luz.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método simplificado para preparar e obter imagens em tempo real de extratos citoplasmáticos não diluídos provenientes de ovos de Xenopus laevis. A técnica permite a análise da dinâmica citoplasmática e do desenvolvimento de padrões espaciais no interior do citoplasma, facilitando o entendimento da organização celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Microscopia
- Biologia do desenvolvimento
Antecedentes
- A dinâmica citoplasmática é fundamental para compreender a organização celular.
- Extratos de ovos de rã oferecem um sistema relevante para estudar esses processos.
- Técnicas de imagem em tempo real aprimoram a exploração do padrão espacial no citoplasma.
Métodos Utilizados
- Preparação de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis.
- Uso de fita FEP para estabilidade da amostra durante a aquisição de imagens.
- Imagem em tempo real utilizando marcadores fluorescentes e microscopia de campo claro.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da auto-organização em extratos citoplasmáticos ao longo do tempo.
- Estabelecimento de compartimentos semelhantes a células com estruturas definidas de microtúbulos.
- A comparação do desempenho de imageamento com base nos tratamentos de superfície indicou efeitos significativos na organização do extrato.
Conclusões
- O estudo descreve um método prático para a obtenção de imagens de estruturas e dinâmicas citoplasmáticas.
- Os resultados aprimoram nossa compreensão dos processos celulares e destacam a importância das técnicas de preparação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a imagem em tempo real da dinâmica citoplasmática em extratos de óvulos de Xenopus laevis, fornecendo um sistema escalável e de baixo custo para o estudo da formação de padrões espaciais e processos de auto-organização relevantes para a organização celular. Ao eliminar a necessidade de tratamentos químicos superficiais e utilizar consumíveis produzidos em massa, o método possibilita a visualização reprodutível e de alta resolução da organização de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em um ambiente in vitro controlado. A abordagem aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas do comportamento citoplasmático, apoiando a validação precoce de alvos e o desenvolvimento de ensaios em fluxos de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a mecanismos de autoorganização citoplasmática e padrões espaciais.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao visualizar a organização citoplasmática dinâmica em um sistema de extrato fisiologicamente relevante.
- Biomarcador Traducional: Facilita a identificação de características citoplasmáticas dinâmicas que podem correlacionar-se com estados celulares funcionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Padronização do Ensaio: Fornece uma plataforma reprodutível para preparar extratos com espessura e estabilidade uniformes utilizando a passivação com fita FEP.
- Resultados Quantitativos: Permite a medição da dinâmica citoplasmática e da organização espacial por meio de imagens de campo claro e de fluorescência em lapso de tempo.
- Prontidão para Triagem: Oferece um sistema escalável e de baixo custo, compatível com microscopia de campo amplo e confocal, para avaliação de efeitos de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Atua como um modelo mecanicista para o estudo de processos citoplasmáticos conservados relacionados à divisão e organização celular.
- Confiabilidade Preditiva: Contribui para a redução de riscos de alvos envolvidos na regulação do citoesqueleto e no padrão espacial por meio da visualização direta da auto-organização do extrato.
- Continuidade Tradutiva: Conecta observações de descoberta com validação pré-clínica ao estabelecer um modelo citoplasmático consistente e pronto para imageamento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses sobre alvos até o desenvolvimento de ensaios e validação pré-clínica, especialmente para alvos que influenciam a dinâmica do citoesqueleto e a organização subcelular.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a visualização direta da dinâmica de microtúbulos e mitocôndrias em extratos em intérfase.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da padronização na preparação de extratos e condições estáveis de imagem, sem tratamentos químicos da superfície.
- Análise: Gera dados quantitativos espaciais e temporais sobre a organização citoplasmática, permitindo análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao fornecer um modelo consistente para o estudo de processos conservados de organização celular.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável e de baixo custo, adaptável a múltiplos alvos e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos de organização citoplasmática.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio da padronização da preparação de extratos e da passivação de superfícies com fita FEP.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir a visualização precoce dos efeitos fenotípicos sobre a dinâmica citoplasmática.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer insights mecanicistas sobre compostos que afetam a organização celular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de ovos de Xenopus, preparação de extratos e técnicas de microscopia ao vivo.
- Depende do acesso a centrífugas, sistemas de microscopia (campo amplo/confocal) e fita adesiva FEP e espaçadores para imagem.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de lavagem de ovos, remoção da camada de jeléia e recuperação de extratos.
- A adaptação à imagem tridimensional pode exigir integração com microscopia de folha de luz e otimização do controle da espessura da amostra.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade à qualidade dos ovos e a necessidade de remover ovos anormais durante o preparo para garantir a consistência do extrato.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
