Name: Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a transfecção reversa de adipócitos 3T3-L1 com siRNA e micro-RNA para estudar expressão proteica e sinalização metabólica. Este método eficiente permite investigar doenças metabólicas em modelos celulares.

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Este trabalho contou com o apoio do INSERM, da Université Côte d'Azur e da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) por meio do programa Investimentos para o futuro Laboratório de Excelência (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelência (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. é apoiado por subsídios da Société Francophone du Diabète (SFD), da Associação Francesaise d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), do Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e da Fondation Benjamin-Delessert. J.G. é suportado pelo ANR-18-CE14-0035-01. A J-F.T. é apoiada pela anr grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e uma subvenção da Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).

NOTA: Use técnicas estéreis para executar todas as etapas do protocolo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos.
1. Diferenciação de fibroblastos murine 3T3-L1 em adipócitos
<ol><li>Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 mm em cultura média-DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1A). Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos (7% CO2 e 37 °C).</li>
	<li>Dois dias após a confluência, mude o meio de cultura, substituindo-o por DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro fetal de 10% (FCS) e 1% de penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 0,25 mM 3-Isobutil-1-metilxanthine (IBMX), 0,25 μM dexametasona, 5 μg/mL de insulina e 10 μM rosiglitazone. NOTA: Leva 5 dias para atingir a confluência quando as células são semeadas a 300.000 células por prato de 100 mm.</li>
	<li>Dois dias depois, substitua o meio de cultura por DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 5 μg/mL e rosiglitazone de 10 μM e incubar por 2 dias. Em seguida, alimente as células a cada 2 dias com DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1B).</li>
	<li>Transfeito os adipócitos 3T3-L1 7-8 dias após o início do protocolo de diferenciação. NOTA: É importante atingir um alto nível de diferenciação (>80%) antes da transfecção para evitar a proliferação dos fibroblastos restantes após a transfecção, o que levaria a uma população mista de células que poderiam influenciar os resultados.</li>
</ol>2. Preparação de placas pré-revestidas
<ol><li>No dia anterior ou poucas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 μg/mL em 30% de etanol a partir de uma solução de estoque a 1 mg/mL. Adicione 250 μL de colágeno por poço de uma placa de 12 poços e 125 μL por poço de uma placa de 24 poços, e espalhe a solução sobre a superfície do poço.</li>
	<li>Deixe a placa sem a tampa sob o capô da cultura até que o colágeno seque. Lave duas vezes com o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco (D-PBS). NOTA: As placas pré-revestidas estão disponíveis para compra.</li>
</ol>3. Preparação da mistura de transfecção
NOTA: A concentração final de siRNA é entre 1 e 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por poço de uma placa de 12 poços). A concentração final da mímica miR é de 10 nM (10 pmol/bem). Determine a melhor concentração de cada siRNA, miR mimic ou outro oligonucleotídeo antes de iniciar o experimento para evitar efeitos fora do alvo. Realizar experimentos de transfesão em triplicado para facilitar a análise estatística dos resultados. Prepare todos os reagentes em excesso para explicar a perda normal durante a pipetação.
<ol><li>Misture por pipetação (volume/volume) o siRNA (ou outros oligonucleotídeos) com um meio essencial mínimo melhorado(Tabela 1). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione o reagente de transfecção e o meio mínimo essencial melhorado ao siRNA e a pipeta para misturar(Tabela 1). Incubar por 20 min em temperatura ambiente (durante este tempo, proceda à seção 4). Adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.</li>
</ol>4. Preparação dos adipócitos 3T3-L1
<ol><li>Lave as células na placa de Petri de 100 mm duas vezes com D-PBS. Adicione 5x trypsin às células (1 mL por prato de 100 mm), certificando-se de cobrir toda a superfície com o trypsin. Aguarde por 30 s e remova cuidadosamente o trippsin.</li>
	<li>Incubar a placa de Petri por 5-10 min a 37 °C na incubadora. Toque na antena de 100 mm para desprender as células.</li>
	<li>Adicione 10 ml de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% DE FCS e 1% penicilina e estreptomicina para neutralizar a trippsina. Tubo cuidadosamente o meio para cima e para baixo para desacopr as células e homogeneizar a suspensão celular.</li>
	<li>Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador celular automatizado, e ajuste a concentração das células para 6,25 x 105 células/mL de médio. Semente 800 μL da suspensão/poço da célula de uma placa de 12 poços (5 x 105 células) ou 400 μl da suspensão/poço da célula de uma placa de 24 poços (2,5 x 105 células) contendo a mistura de transfecção. NOTA: Uma placa de Petri de 100 mm de adipócitos permitirá a preparação de uma placa de 12 poços ou uma placa de 24 poços. Um prato de 100 mm geralmente contém 6-7 x 106 adipócitos, que correspondem a 5 x 105 adipócitos por poço de uma placa de 12 poços.</li>
	<li>Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular (7% CO2 e 37 °C), e não perturbe as células por 24 h. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o supernaente por DMEM fresco sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina. NOTA: Também é possível semear as células em placas de 48 e 96 poços revestidas de colágeno, mas tomar mais precauções ao substituir a mídia para evitar o descolamento dos adipócitos.</li>
</ol>5. Análise funcional de adipócitos 3T3-L1 transfeinados
<ol><li>Meta de estudo knockdown 24-48 h e 48-96 h após siRNA ou miR imitam a entrega para mRNA e proteína, respectivamente.</li>
	<li>Realizar análises funcionais de adipócitos transfectados para estudar sinalização de insulina, captação de glicose, secreção de adipokine, lipólise e lipogênese.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a diferenciação e transfecção de adipócitos maduros. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos como, mas não se limitando a, siRNAs, imitações de micro-RNA e anti-micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, que é uma das linhas celulares mais difíceis de transfeito. Este método tem algumas limitações que precisam ser consideradas. Este protocolo não é eficiente para transfecção com DNA plasmídeo, o que l...

A obesidade é considerada um dos principais fatores de risco para inúmeras doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina (IR), Diabetes Tipo 2 (T2D) e doenças cardiovasculares1. As terapias atuais não conseguiram parar o constante aumento da prevalência dessas doenças, e o manejo do IR de pacientes obesos e diabéticos continua sendo uma questão clínica importante. O tecido adiposo desempenha um papel crucial no controle da homeostase energética, e sua expansão patológica durante a obesidade contribui para o desenvolvimento de IR e T2D2,3. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. Muitos estudos têm investigado o papel das RNAs de codificação de proteínas na fisiologia adipócito e sua associação com a obesidade.
Mais recentemente, a descoberta de RNAs não codificadas (NCRNAs), especialmente micro-RNAs (miRs), forjou novos conceitos relacionados ao mecanismo de regulação de programas de expressão genética. Estudos têm demonstrado que as NCRNAs são importantes reguladores da função adipócito, e que sua desregulação desempenha um papel importante nas doenças metabólicas4. Assim, a manipulação de proteínas e ncRNAs em adipócitos é crucial para decifrar seus papéis na função adipócito e seu impacto em patologias como o T2D. No entanto, manipular a expressão de proteínas e ncRNAs in vivo, bem como em adipócitos primários permanece altamente desafiador, favorecendo o uso de modelos in vitro adipócitos.
Os fibroblastos murine 3T3-L1 se diferenciam facilmente em adipócitos maduros, funcionais e responsivos à insulina, que são uma linha celular bem caracterizada usada para estudar a função adipócito (por exemplo, sinalização de insulina, captação de glicose, lipólise e secreção de adipokines)5,6,7,8,9,10. Essas propriedades tornam os adipócitos 3T3-L1 um modelo atraente para modular a expressão de codificação de proteínas e nc-RNAs para decifrar seu papel na função adipócite e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade. Infelizmente, enquanto os fibroblastos 3T3-L1 são fáceis de transfetar usando reagentes disponíveis comercialmente, adipócitos 3T3-L1 diferenciados são uma das linhas celulares mais difíceis de transfectar. É por isso que inúmeros estudos que manipulam a expressão genética em células 3T3-L1 têm focado na diferenciação de adipócitos em vez da função adipócito.
Por muito tempo, a única técnica eficiente para transfetálces foi a eletroporação5, que é tediosa, cara, e pode causar danos celulares. Este artigo relata uma técnica de transfecção reversa usando um reagente de transfecção comum, que reduz o tempo prático para transfecção, não tem efeito sobre a viabilidade celular, e é muito menos caro do que a eletroporação. Este protocolo é perfeitamente adequado para a transfecção de siRNA e outros oligonucleotídeos, como mímicas micro-RNA (miR mimics) e anti-miRs. O princípio do protocolo de transfecção reversa é incubar o reagente de transfecção e os oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular e, em seguida, semear os adipócitos maduros nos poços. Em seguida, os adipócitos se recolocarão à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Essa metodologia simples, eficiente e barata permite o estudo do papel das RNAs e miRs de codificação proteica na função adipócito e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2,5% de tripsina (10x)</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>diluída a 5x com D-PBS</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Piscina sem direcionamento</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo I da pele de bezerro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Meio de Eagles Modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4,5 g/L D-Glicose; L-Glutamina; sem piruvato</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr> Controle <tr><td>negativo marcado com FAM si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de glicerol livre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Solução padrão de glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Diluição: 0,5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo Melhorado (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, Recombinante Humano</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>micro-RNA miRIDIAN imita</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT</td><td>Kit Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Ensaios Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Ensaios Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Soro de bezerro recém-nascido</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Descoberta</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Perilipina-1</td><td>Sinalização celular</td><td>3470</td><td>Diluição: 1/1000</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo PKB</td><td>Sinalização celular</td><td>9272</td><td>Diluição: 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Phospho Thr308 anticorpo</td><td>Célula Sinalização</td><td>9275</td><td>Diluição: 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulina</td><td>anticorpo Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Diluição: 0,5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>anticorpo Vamp2</td><td>R& D Sistemas</td><td>MAB5136</td><td>Diluição: 0,1 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-rna na função adipócito

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

A alteração da função adipócito contribui para a patogênese de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. A modulação da expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos continua sendo altamente desafiadora. Este artigo descreve um protocolo para diferenciar os fibroblastos murinos em adipócitos maduros e modular a expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos maduros através de transfecção reversa usando RNA de pequena interferência (siRNA) e micro-RNA imitando (miR imitar) oligonucleotídeos. Este protocolo de transfecção reversa envolve a incubação do reagente transfeccionado e dos oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular à qual os adipócitos maduros são adicionados. Os adipócitos são então autorizados a recolocar à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Análises funcionais como o estudo da sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise podem ser realizadas nos adipócitos maduros 3T3-L1 transfetípidos para estudar o impacto da manipulação de proteínas ou micro-RNA na função adipócito.

Utilizando-se o procedimento de transfecção reversa descrito aqui para modular a expressão de proteínas ou micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, os adipócitos têm mostrado preservar sua morfologia após a transfecção (Figura 1B,C). De fato, 2 dias após a transfecção, os adipócitos foram bem espalhados e ligados à placa e apresentaram gotículas lipídicas multiloculares que são uma característica de adipócitos 3T3-L1 maduros. O teor lipíduo não foi d...

Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.

Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Este protocolo permite manipular proteínas, ou expressão microRNA, em adipócitos diferenciados para estudar seu papel na função adipócitos. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos em adipócitos de rato 3T3-L1. Este método também pode ser aplicado a preadipócitos humanos diferenciados em adipócitos.Demonstrando o procedimento estará Melanie Gaudfrin, técnica do nosso laboratório. Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 milímetros em DMEM sem piruvato, glicose de 25 milialares, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina. Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono.Dois dias após a confluência, mude o meio de cultura, substituindo-o por DMEM sem piruvato, 25 milimolas de glicose, 10% FCS, e um por cento de penicilina e estreptomicina suplementada com 0,25 milimólar IBMX, 0,25 micromolar dexametasona, cinco microgramas por insulina mililitro e 10 micromolar rosmoiona. Incubar os pratos por dois dias. Dois dias depois, substitua o meio de cultura por DMEM sem piruvato, 25 milimomalares de glicose, 10% FCS e um por cento de penicilina e estreptomicina suplementada com cinco microgramas por insulina mililitro e 10 rosiglitazone micromolar e incubar por mais dois dias.Alimente as células a cada dois dias com DMEM sem piruvato, 25 milimães de glicose, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina e mantenha as células na incubadora. Um dia ou algumas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 microgramas por mililitro em 30% de etanol a partir de uma solução de estoque a um miligrama por mililitro. Adicione 250 microliters de colágeno por poço de uma placa de 12 poços ou 125 microliters por poço de uma placa de 24 poços e espalhe a solução sobre a superfície do poço.Deixe a placa sem a tampa sob o capô da cultura até que o colágeno seque. Em seguida, lave-o duas vezes com D-PBS. Pipeta o siRNA com meio essencial mínimo melhorado para misturar e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.Adicione o reagente de transfecção e o meio essencial mínimo melhorado ao siRNA e pipeta para misturar. Incuba-o por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.Lave as células na placa de Petri de 100 milímetros duas vezes com D-PBS. Adicione 5x trypsin às células, certificando-se de cobrir toda a superfície com a trippsina. Aguarde 30 segundos e remova cuidadosamente a trippsina.Incubar a placa de Petri por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius na incubadora. Em seguida, toque no prato para desprender as células, evitando danos celulares. Adicione 10 mililitros de DMEM sem piruvato, 25 milimões de glicose, 10% FCS e um por cento de penicilina e estreptomicina para neutralizar a trippsina.Pipete cuidadosamente o meio para cima e para baixo para desacopr as células e homogeneizar a suspensão celular. Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador celular automatizado e ajuste a concentração das células para 0,625 milhões de células por mililitro de médio. Sementes 800 microliters da suspensão celular por poço de uma placa de 12 poços ou 400 microliters da suspensão celular por poço de uma placa de 24 poços contendo a mistura de transfecção.Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular e não perturbá-las por 24 horas. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o supernaente por DMEM fresco sem piruvato, glicose de 25 milialares, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina e devolva as células à incubadora. Os pontos de tempo típicos para detectar knockdown de destino após a entrega de siRNA ou miR são de 24 a 48 horas para mRNA e de 48 a 96 horas para proteína.Experimentos funcionais podem ser realizados em adipócitos transfectados, incluindo sinalização de insulina, captação de glicose, secreção de adipokine, lipólise e lipogênese. Os adipócitos foram mostrados para preservar sua morfologia após a transfecção. Dois dias após a transfecção, os adipócitos apresentaram gotículas lipídicas multiloculares com teor lipíduo não diferente entre os adipócitos transfectados e não transfectados.A expressão mRNA de vários marcadores de diferenciação foi inalterada em células transfeinadas em comparação com a dos adipócitos não transfectados. O protocolo de transfecção reversa é eficiente, pois mais de 70% dos adipócitos foram transfeccionados. Três dias após a transfecção com siRNA contra Perilipin-1, o nível de mRNA de Perilipin-1 diminuiu em 70% e o nível de proteína em 63% a expressão perilipin-1 também foi analisada por microscopia de fluorescência quatro dias após a transfecção e foi constatado que diminuiu em 92% em comparação com sua expressão no controle de adipócitos.A transfecção reversa de adipócitos com microRNA imitando oligonucleotídeos para aumentar a expressão do miR-34a é mostrada aqui. A superexpressão do miR-34a levou à diminuição da expressão proteica VAMP2 em 50%O knockdown de Perilipin-1 em adipócitos 3T3-L1 levou a um aumento na lipólise basal, enquanto a expressão excessiva do miR-34a levou à inibição da proteína induzida pela insulina quinase B e absorção de glicose. É importante alcançar um alto nível de diferenciação de adipócitos para realizar a transfecção em adipócitos recém-diferenciados e monitorar cuidadosamente o tratamento de adipócitos com trippsina.Após a transfecção, é possível realizar experimentos funcionais nos adipócitos para estudar o impacto de proteínas ou manipulação de microRNA na sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise.

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