Avaliação in vivo de liberação mucociliaria em camundongos

Nesta publicação, descrevemos protocolos para avaliação do desembaraço mucociliar das vias aéreas (MCC) em camundongos in vivo utilizando imagens de radionuclídeos de dupla modalidade. Este protocolo é projetado para uma tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e um protocolo de aquisição de tomografia computadorizada (CT) usando collimadores de corpo inteiro de rato (MWB) em um sistema SPECT/CT duplo.

Nosso protocolo permite a medição precisa da depuração mucociliar em um modelo animal usando radionuclídeos que são rastreados por meio de imagens de SPECT e TC de modalidade dupla para localizar e medir com precisão a desobstrução das vias aéreas. Esta técnica é um método reprodutível para medir o CCM que pode ser aplicado a diferentes modelos animais e de doenças devido à utilização de SPECT/CT duplo. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal, equipe o suporte com um cone nasal para manter a anestesia e suspenda o camundongo anestesiado pelos incisivos frontais em um suporte de intubação em um ângulo de 45 graus.

Conecta uma extremidade de um fio de fibra óptica de 50 mícrons a uma fonte de luz e enfia uma cânula de calibre 20 sobre o fio. Use uma pinça romba para puxar a língua e iluminar o fio-guia para visualizar as cordas vocais. Passe o fio-guia pelas cordas vocais de modo que o fio fique um pouco além das cordas vocais apoiadas na traqueia superior e deslize a cânula de uma polegada para frente ao longo do fio até que seja profundo o suficiente para que o cubo fique contra os incisivos do animal.

Remova o fio enquanto deixa a cânula no lugar e use um dedo para conectar brevemente a cânula para verificar se há alterações na respiração. Em seguida, adicione 10 microlitros de colóide de enxofre de tecnécio de 0,2 milicurie 99m recém-preparado à cânula e permita que o camundongo inale espontaneamente o radionuclídeo para os pulmões durante um período de um a dois minutos. Para imagens SPECT/CT, após remover a cânula, use fita adesiva para prender o camundongo a uma paleta de 25 milímetros com um cone nasal e prenda um tubo de PCR de 200 microlitros contendo um simulador radioativo de 0,05 milicurie sob o abdômen inferior do camundongo abaixo dos pulmões.

Coloque o mouse no sistema SPECT/CT. Selecione o fluxo de trabalho de imagem e clique em Configuração. Configure o posicionamento dos detectores no mouse e execute o fluxo de trabalho de imagem.

Após a conclusão do fluxo de trabalho, transfira o mouse para uma nova gaiola com monitoramento e acesso irrestrito a comida e água e adesivo de segurança contra radiação por seis horas entre as varreduras. Após a geração de imagens, histograme as imagens SPECT usando as configurações padrão de fábrica para colóide de enxofre de tecnécio de 99m e use um algoritmo MAP3D e reconstrução de função de propagação de pontos para reconstruir imagens de pilha 3D. Reconstrua as imagens de TC usando o algoritmo de Feldkamp e um filtro de Shepp-Logan e abra as imagens de TC e SPECT em FIJI.

Use a ferramenta reslice para gerar imagens de visualização coronal a partir das imagens axiais padrão e execute uma projeção de soma de pilha z na imagem SPECT para adicionar os dados de contagem de cada fatia. Gere uma única imagem para facilitar a análise. E usando o tubo Phantom Eppendorf como referência, redimensione e registre as imagens de TC e SPECT.

Use o limiar automático para binarizar a imagem da TC, inverter a pilha e realizar uma projeção de soma de pilha z para gerar um contorno dos pulmões para análise. Gire as imagens de TC e SPECT e use as ferramentas de canal para mesclá-las em uma imagem. Em seguida, desenhe uma região de interesse ao redor do pulmão direito para determinar a depuração mucociliar.

Após a aquisição e processamento da imagem, as imagens de TC e SPECT podem ser co-localizadas usando o tubo fantasma como ponto de referência. Máscaras dos pulmões podem ser geradas a partir da imagem de TC e usadas para desenhar regiões de interesse ao redor do pulmão para sua análise em diferentes pontos de tempo. Nesta análise, um total de oito camundongos foram escaneados duas vezes em dias diferentes sob condições experimentais idênticas para testar a reprodutibilidade do protocolo.

A análise do teste T pareado não mostrou diferença significativa entre as varreduras repetidas. Outros dois camundongos também foram escaneados três vezes em dias diferentes em condições experimentais idênticas. A análise ANOVA de uma via mostrou correspondência significativa entre as varreduras repetidas.

Aqui, imagens representativas de dois dos camundongos escaneados podem ser observadas. É essencial ser capaz de visualizar as vias aéreas. E para verificar se a intubação foi bem-sucedida, se necessário, remova a cânula e reintube para evitar intubação esofágica errônea.

Este protocolo pode ser aplicado a modelos de doenças para avaliar os efeitos de diferentes drogas nas desobstruções das vias aéreas e para auxiliar no desenvolvimento de novas terapias medicamentosas.