Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Este protocolo nos permite gerar formigas geneticamente modificadas para entender a função dos genes na comunicação e no comportamento em um ambiente social. Manipular o sistema genético de insetos eussociais é um desafio, já que muitas espécies não acasalam e se reproduzem em ambientes de laboratório. A impressionante plasticidade fenotípica no assoalho celular hipernasal das formigas nos permite estabelecer linhas mutantes mediadas por CRISPR.

Demonstrando o procedimento estará Kayli Sieber, uma estudante de pós-graduação de um laboratório. Mantenha colônias selvagens de H.saltator em caixas de plástico transparente em uma sala de criação de formigas a 22 a 25 graus Celsius e um cronograma de iluminação clara de 12 horas e 12 horas de iluminação escura. Use caixas pequenas para criar trabalhadores individuais ou pequenas colônias e caixas médias ou grandes para criar colônias maiores.

Para criar caixas de ninho, use gesso para fazer os pisos. Como o gesso molhado está secando nas caixas médias e grandes, pressione um bloco de espuma no gesso a alguns centímetros de profundidade e a poucos centímetros da parte de trás da caixa para designar uma região inferior do ninho. Uma vez que o gesso tenha secado, cubra a região designada do ninho com um pedaço quadrado de vidro.

Alimente as colônias com grilos vivos duas vezes por semana e aplique água regularmente no piso da caixa de ninho de plástico usando uma garrafa de lavagem. Sempre que ocorrer a alimentação, remova o lixo e os indivíduos mortos. Congele todos os resíduos e formigas mortas durante a noite a menos 30 graus Celsius antes de descartar esses materiais como lixo comum.

Adicione periodicamente uma pitada de serragem seca às colônias para ajudar as larvas à medida que passam por pupação e para ajudar os trabalhadores a manter a caixa do ninho limpa. Use um extrator de micropipeta para puxar agulhas de microinjeção de vidro. Certifique-se de que o vidro que está sendo usado foi armazenado em um ambiente limpo e livre de poeira.

Use um processo de duas etapas para puxar agulhas de microinjeção. Para a primeira etapa, defina o calor para 575, o filamento para 3, a velocidade para 35, o atraso para 145 e a tração para 75. Para a segunda etapa, defina o calor para 425, o filamento para 0, a velocidade para 15, o atraso para 128 e a tração para 200.

Certifique-se de que a agulha resultante tenha uma conicidade de 2 milímetros e uma ponta de 0,5 micrômetros. Depois de puxar as agulhas, mantenha-as em um ambiente livre de poeira e limpo até o uso. Preparar a mistura de microinjeção de proteínas de caseína e pequenos RNAs guia sintetizados in vitro.

Mantenha a mistura no gelo até a hora de carregar uma agulha de microinjeção. Quando não estiver em uso, armazene a mistura de microinjeção a menos 80 graus Celsius. Ajuste os parâmetros de injeção para uma pressão de injeção de 140 hectopascal, uma pressão constante de 70 hectopascal, e um tempo de 0,4 segundos.

Ajuste a pressão constante de tal forma que o material flua apenas em uma direção e ajuste a pressão e o tempo de injeção somente se nenhum material estiver fluindo da agulha para o embrião. Carregue uma agulha de microinjeção com dois microlitros da mistura usando pontas de pipeta de microcarregador. Faça isso lentamente para garantir que nenhuma bolha seja formada na mistura.

Quebre apenas a ponta da agulha ao longo da borda da fita, de modo que uma conicidade estreita ainda seja mantida. Certifique-se de que a agulha esteja quebrada apenas o suficiente para que a ponta seja aberta, mas não tanto que a conicidade seja quebrada. Em seguida, monte a agulha no micromanipulador.

Selecione embriões para microinjeção a partir do estágio sincicial, que é quando os núcleos se dividem sem citocinese. Forre os embriões em uma placa de fita dupla face presa a uma lâmina de microscópio de vidro, certificando-se de que eles estejam bem presos à fita para evitar o movimento durante a injeção. Coloque os embriões em uma orientação vertical de tal forma que o lado lateral de cada embrião esteja na borda da fita.

Coloque a lâmina e os embriões revestidos no palco do microscópio em uma estação de trabalho de microinjeção designada. Alinhar a agulha com o primeiro embrião a ser injetado usando o micromanipulador e puncionar lateralmente o primeiro embrião ao longo de seu eixo dorsal ou ventral sob um microscópio. Injete a mistura de microinjeção e procure um leve movimento do embrião, indicando um aumento na pressão interna devido ao líquido injetado.

Além disso, observe a formação de uma pequena gota contendo vestígios visíveis de tecido ou lipídio na membrana externa do embrião. Remova suavemente a agulha do embrião e prossiga para o próximo embrião, ajustando a posição da lâmina do microscópio. Repetir até que todos os embriões tenham sido injetados.

Uma vez que todos os embriões na lâmina tenham sido injetados com sucesso, transfira a lâmina para uma caixa úmida por uma hora para dar aos embriões tempo para se recuperarem antes de serem removidos da lâmina. Após a incubação, lave a lâmina com etanol, remova suavemente os embriões injetados da fita usando pinça de peso de penas e transfira-os para um tubo cheio com uma pequena quantidade de etanol a 70%. Inverta o tubo várias vezes.

Usando um pincel pequeno e macio, transfira todos os embriões injetados para placas de ágar a 1% com antimicótico antibiótico a 2%. Incubar as placas a 25 graus Celsius por aproximadamente quatro semanas, verificando regularmente a eclosão. Uma vez que o primeiro embrião tenha eclodido em uma larva, devolva todos os embriões e larvas a uma caixa de ninho com alguns jovens trabalhadores de enfermagem para cuidar dos filhotes.

Manter a colônia seguindo os métodos demonstrados anteriormente. Este protocolo foi usado para realizar com sucesso a edição do genoma em embriões saltadores de Harpegnathos. Os resultados foram validados via clonagem por PCR e pGEM de DNA extraído de embriões injetados, seguido de sequenciamento de DNA.

A eficiência da mutagênese somática usando este protocolo atingiu aproximadamente 40%F1 machos mutantes foram acasalados com fêmeas do tipo selvagem para produzir fêmeas heterozigotas F2 que, se não acasaladas, produziram machos F3. Machos F3 mutantes foram acasalados com fêmeas heterozigotas para produzir fêmeas mutantes homozigotas F4. Como resultado da mutagênese bem-sucedida, foram observados comportamentos incomuns que se correlacionaram com a perda do gene alvo.

A perda de Orco está associada a uma perda de detecção de feromônios, incapacidade de detectar presas, fecundidade prejudicada e vagar da colônia. Ao realizar este protocolo, o dano embrionário durante a injeção precisa ser minimizado. Isso pode ser feito garantindo que a ponta da agulha não seja aberta muito larga e movendo a agulha lentamente ao injetar.

Técnicas semelhantes podem ser usadas para gerar e manter formigas transgênicas, o que fornecerá ferramentas mais sofisticadas para sondar a atividade e o comportamento neuronal. A neurogênese mediada por CRISPR tem sido usada em outras espécies de insetos eussociais, como abelhas, formigas invasoras clonais e formigas de fogo. Modificações genéticas facilitarão os estudos funcionais sobre desenvolvimento, fisiologia e comportamento social em insetos eussociais.