Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas
11 de novembro de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo para usar uma ferramenta de software MATLAB baseada em curvas baseada em curvas, de código aberto para quantificar a organização de colágeno fibrilar na matriz extracelular de tecidos normais e doentes. Esta ferramenta pode ser aplicada a imagens com fibras de colágeno ou outros tipos de estruturas semelhantes a linhas.
Esta ferramenta ajuda a quantificar as alterações na organização do colágeno fibrilar na matriz extracelular relacionadas a muitas doenças em uma região global de interesse e com base em fibras individuais. Essa ferramenta usa a transformação de curva, um método ideal de representação de imagem direcional em várias escalas para remover ruídos de imagem e melhorar as bordas da fibra. Módulos abrangentes e fáceis de usar permitem uma quantificação eficiente.
Para extração de fibra individual, siga o protocolo para abrir o CT-FIRE e clique em abrir files para selecionar uma ou mais imagens de interesse. No painel de parâmetros, clique em atualizar e ajuste o limite de plano de fundo e o raio de pesquisa de nucleação. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, clique em executar.
Após a conclusão da análise, clique em qualquer elemento na tabela de saída para visualizar os resultados e verifique a subpasta ctFIREout para os arquivos de saída. Para analisar uma região de interesse, clique em abrir arquivos para carregar uma ou mais imagens e selecione a imagem a ser anotada. No painel de opções de execução, selecione o gerenciador de região de interesse no menu suspenso e clique em executar para iniciar o módulo do gerenciador de região de interesse.
Em seguida, clique no menu suspenso D do menu da região de interesse e desenhe as regiões de interesse. Se a análise CT-FIRE de imagem completa tiver sido realizada e os resultados forem salvos no diretório padrão, clique em uma ou mais regiões de interesse na lista de região de interesse e clique em Analisador de região de interesse CT-FIRE para iniciar o módulo de análise pós-região de interesse. Se a análise CT-FIRE de imagem completa não tiver sido realizada, clique em uma ou mais das regiões de interesse na lista de regiões de interesse e clique em aplicar CT-FIRE no ROI para aplicar diretamente a análise CT-FIRE às regiões de interesse selecionadas.
Para pós-processamento avançado, marque a caixa de seleção out. adv e clique em pós-processamento para iniciar a interface gráfica de pós-processamento avançado. No módulo de análise, clique em selecionar arquivo e visualize as fibras para permitir que o número da fibra seja inserido com base nas etiquetas na guia fibras originais.
Clique em confirmar atualização para ir para a operação de limite e marque a caixa de limite para habilitar as configurações de limite. Selecione uma das quatro opções de limite no menu suspenso e insira os limites desejados no painel de limites para uma ou mais propriedades de fibra. Em seguida, clique em limite agora para aplicar as condições de limite acima e verifique a figura de prompt com o nome terminando com visualização de métricas para ver as fibras selecionadas sobrepostas nas imagens originais com os mapas de cores personalizados.
Quando o limite tiver sido definido, clique em salvar fibras para salvar as informações de fibra selecionadas e clique em gerar estatísticas e clique em OK para gerar as estatísticas resumidas. Para combinar resultados de várias imagens, verifique o modo de lote e selecione várias imagens a serem analisadas antes de gerar as estatísticas resumidas, conforme demonstrado. Para extrair recursos de fibra baseados em TC, siga o protocolo para abrir o software CurveAlign e clique em obter imagens na interface gráfica principal do usuário e selecione uma ou mais imagens ou pilhas de imagens na janela de prompt.
Insira a fração de coeficientes a serem mantidos no valor, a fração dos maiores coeficientes de CT que serão usados na análise de fibra e clique em executar. Repita para definir um limite desejável. Quando o processo estiver concluído, algumas estatísticas resumidas de cada imagem serão exibidas em uma tabela de saída e todos os arquivos de saída serão salvos automaticamente em uma subpasta chamada CA_out no diretório das imagens originais.
Para extrair recursos de fibra baseados em CT-FIRE, clique no menu suspenso do método de análise de fibra e selecione Fibras CT-FIRE para usar o ponto central da fibra e o ângulo da fibra para representar a fibra. Para análise de alinhamento relativo do limite do tumor, selecione a condição de limite TIFF. Abra o software CurveAlign e clique em obter imagens na interface gráfica principal do usuário e selecione uma ou mais imagens ou pilhas de imagens na janela de prompt.
No painel de parâmetros primários, insira a distância do limite mais próximo para avaliar apenas as fibras dentro dessa faixa de distância. No painel de opções de saída, marque a caixa de associação de limite para permitir a visualização do ponto no limite que está associado a uma fibra, segmento de fibra ou curvelet e clique em executar e, em seguida, clique na tabela de saída para visualizar os resultados. Se uma análise CurveAlign de imagem completa tiver sido realizada e os resultados forem salvos no diretório padrão, clique em uma ou mais regiões de interesse na lista de região de interesse e clique em Analisador de região de interesse CurveAlign para executar uma análise pós-região de interesse.
Se uma análise CurveAlign de imagem completa não tiver sido realizada, clique em uma ou mais regiões de interesse na lista de regiões de interesse e clique em aplicar CurveAlign na região de interesse para aplicar diretamente a análise CurveAlign às regiões de interesse selecionadas. Nesta imagem, uma imagem de sobreposição de um núcleo de microarray de tecido pode ser observada. Na magnificação, as fibras paralelas e perpendiculares ao limite do tumor dentro da região de interesse podem ser observadas.
A imagem de sobreposição de saída do CurveAlign mostra os limites do tumor e os locais e orientações representativos da fibra. Este método pode ser usado para quantificar não apenas as fibras de colágeno, mas também outras estruturas semelhantes a linhas, como a elastina, e pode potencialmente facilitar o diagnóstico precoce e a análise prognóstica do câncer.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para quantificar a organização do colágeno fibrilar na matriz extracelular utilizando uma ferramenta baseada na transformada em curvas no MATLAB. A ferramenta é aplicável a tecidos normais e doentes, melhorando a análise das fibras de colágeno.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Análise da Matriz Extracelular
Contexto
- O colágeno fibrilar é essencial para a estrutura e função dos tecidos.
- Alterações na organização do colágeno estão associadas a diversas doenças.
- A quantificação da organização do colágeno auxilia na compreensão dos mecanismos das doenças.
- A transformada em curvelet é um método eficaz para representação de imagens.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma ferramenta fácil de usar para quantificar a organização do colágeno.
- Facilitar a análise do colágeno em diferentes estados teciduais.
- Aprimorar a compreensão do papel do colágeno na doença.
Métodos Utilizados
- Utilização da transformada curvelet para processamento de imagens.
- Protocolo para extração de fibras individuais utilizando o software CT-FIRE.
- Ajuste de parâmetros para análise de imagens otimizada.
- Métodos de quantificação de fibras globais e individuais.
Resultados Principais
- A ferramenta quantifica efetivamente a organização do colágeno.
- Elabora a detecção das bordas das fibras e reduz o ruído.
- Módulos abrangentes apoiam uma análise eficiente.
- Aplicável a vários tipos de estruturas semelhantes a linhas em imagens.
Conclusões
- A ferramenta de transformada em curvalet é valiosa para a pesquisa de colágeno.
- Ela fornece informações sobre a matriz extracelular na saúde e na doença.
- Aplicações futuras podem se estender a outras análises estruturais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da organização do colágeno fibrilar fornece informações essenciais sobre a remodelação da matriz extracelular, uma característica marcante da progressão do câncer e de outras doenças fibróticas. A plataforma baseada na transformada em curvaletas permite análise de alto conteúdo, reprodutível, da morfologia e alinhamento das fibras, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas pré-clínicas de oncologia e fibrose. Ao fornecer características quantitativas e específicas de localização das fibras, a ferramenta aumenta a confiança preditiva em sistemas relevantes para doenças e orienta decisões de avançar/não avançar nos estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da arquitetura das fibras de colágeno como parâmetro funcional das interações estroma-tumor em modelos de câncer.
- Valor Operacional: Fornece métricas quantitativas das fibras, como comprimento, ângulo, largura e grau de retilineidade, para apoiar a verificação de hipóteses sobre alvos estromais.
- Valor Tradutível: Facilita a redução de riscos biológicos ao associar alterações na matriz extracelular a fenótipos da doença nos contextos de câncer de mama, ovário, rim e pâncreas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera dados padronizados e resistentes a ruídos de detecção de bordas e orientação de fibras para quantificação reprodutível de colágeno em grandes conjuntos de imagens.
- Escalabilidade: Permite o processamento em lote de centenas ou milhares de imagens, possibilitando triagem em alto rendimento de compostos que modulam a MEC.
- Saída Quantitativa: Fornece até trinta características de fibras, incluindo densidade, alinhamento e orientação associada às bordas, para normalização do ensaio e seleção de hits.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Mede diretamente a reorganização do colágeno associada à invasão da borda tumoral em cortes de microarranjos teciduais.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da retilineidade e do alinhamento das fibras como biomarcadores farmacodinâmicos em estudos de intervenção terapêutica.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento ao quantificar os efeitos de agentes anti-fibróticos ou moduladores da matriz sobre a integridade da rede de colágeno.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A plataforma integra-se a fluxos de trabalho de descoberta desde a validação inicial de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, oferecendo uma capacidade reutilizável para fenotipagem da MEC em indicações oncológicas e de fibrose.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao quantificar a organização das fibras de colágeno como uma saída funcional da modulação da via estromal.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios com extração automatizada de fibras e definição de limiares para triagem de compostos em culturas tridimensionais ou seções de tecido.
- Análises: Fornece saídas estatísticas, como o ângulo da fibra em relação aos limites do tumor e métricas de retilineidade, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta alterações do ECM na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio do rastreamento de características de fibras específicas de regiões de interesse (ROI).
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e de fácil uso, implantável entre equipes, para quantificação consistente de colágeno em diversos modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista no direcionamento estromal ao fornecer leituras diretas e quantitativas da organização das fibras de colágeno.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da redução automatizada de ruído e realce de bordas via transformada em curvelets, minimizando a variabilidade dependente do usuário.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a identificação precoce de agentes moduladores da matriz ineficazes por meio de fenotipagem quantitativa da MEC.
- Impacto na Carteira: Orienta a priorização ajustada ao risco ao associar alterações no alinhamento do colágeno à resposta terapêutica em modelos pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Exige familiaridade com modelos baseados em imagens de fibrose ou oncologia e formatos básicos de imagens de microscopia.
- Depende do ambiente de execução MATLAB para a execução dos módulos CT-FIRE e CurveAlign.
- Necessita padronização dos parâmetros de aquisição de imagem (resolução, coloração, contraste) para comparabilidade entre estudos.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a estruturas lineares não colágenas, como elastina ou fibras neuronais.
- Limitado pela necessidade de definição manual de regiões de interesse (ROI) em análises associadas a bordas, embora existam opções de automação por meio do gerenciador de regiões de interesse.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
CT-FIRE Fiber Extraction and Region of Interest (ROI) Analysis
2:34
Advanced CT-FIRE Post-Processing
4:09
CurveAlign Fiber Analysis: CT Mode Without Boundary
5:03
CurveAlign Fiber Analysis: CT-FIRE Mode with Boundary
6:14
CurveAlign Region of Interest (ROI) Analysis
6:56
Results: Representative Tumor-Associated Human Breast Cancer Tissue Microarray (TMA) Collagen Signatures
7:26
Conclusion
