Name: Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a induzir hiperglicemia prolongada em zebrafish usando imersão alternada em glicose. Este protocolo não invasivo permite estudar complicações diabéticas e avaliar respostas inflamatórias retinianas em modelo animal.

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Gostaríamos de reconhecer vpc, CJR e PCM para o desenvolvimento deste protocolo. A EMM recebeu apoio financeiro do American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support para realizar esta pesquisa. Este trabalho também foi apoiado por um American University Faculty Mellon Award e financiamento através do American University College of Arts and Sciences (ambos para VPC).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Americana.
1. Preparando os tanques de solução
<ol><li>Obtenha seis tanques, dois para cada grupo experimental (glicose, manitol e água). Rotule um dos dois tanques de "tanque de carcaça" (ele abrigará o peixe) e rotule o outro 'tanque de solução' (ele vai segurar a solução). NOTA: O grupo de tratamento de manitol é o controle osmótico, e o grupo de tratamento de água é um controle de manuseio/estresse. É importante manter os tanques, companhias aéreas/pedras aéreas, tampas e materiais de limpeza separados para cada grupo de tratamento</li>
	<li>Use um tanque 2 L se o número total de peixes utilizados for inferior a 20. Use um tanque 4 L se o número total de peixes utilizados for superior a 20. NOTA: Use um N de 5-10 por grupo de tratamento por ponto de tempo amostral.</li>
	<li>Mantenha os tanques em banho-maria a 28-29 °C para manter a temperatura da água.</li>
	<li>No dia 1, coloque os peixes em suas respectivas soluções de tratamento (glicose, manitol, água) por 24 horas ('Água para Tratamento'). No dia 2, transfira os peixes de suas soluções de tratamento para a água por 24 horas ('Tratamento à Água'). No dia 3, transfira os peixes da água para soluções de tratamento ('Água para Tratamento'). Esta exposição alternada continua para o restante do experimento (Figura 1). Transfira os peixes de controle tratados com água diariamente para a água.</li>
	<li>Certifique-se de que os peixes são alimentados e transferidos dentro da mesma janela de 2 horas todos os dias durante toda a duração do experimento.</li>
</ol>2. Preparando o peixe
<ol><li>Use zebrafish adulto (4 meses – 1 ano)5.</li>
	<li>Alimente os peixes moídos tetramin flocos diariamente na chegada ao laboratório.</li>
	<li>Regissua o pH e a temperatura de todos os tanques e regise a condição geral dos peixes.</li>
</ol>3. Transferência de peixe
<ol><li>Transfira peixes em cada grupo de tratamento do tanque de habitação para o tanque de solução correspondente usando uma rede de peixe padrão.</li>
	<li>Coloque o tanque contendo o peixe de volta no banho de água, substitua a pedra de ar e a tampa do tanque. Este tanque é agora o "tanque de habitação" e o tanque que anteriormente segurava o peixe é agora o "tanque de solução".</li>
	<li>Descarte a solução antiga e limpe o tanque, juntamente com as tampas do tanque, companhias aéreas, pedras aéreas e redes para evitar o acúmulo de glicose e manitol. NOTA: Não lave os itens com sabão. Use água e uma escova/esponja dedicada para cada condição de tratamento para limpar adequadamente os tanques.</li>
	<li>Seque os recém-limpos "tanques de solução" com uma toalha de papel. Prepare as soluções para o dia seguinte usando este tanque. Certifique-se de que os outros itens são secos e separados por grupos de tratamento apropriados. NOTA: Mantenha um registro de quais soluções os peixes estão sendo transferidos para fora e para cada dia, bem como as soluções que estão preparadas para o dia seguinte. Por exemplo: Peixe transferido de glicose para H2O, nova solução de glicose de 1% preparada para amanhã.</li>
</ol>4. Preparação da solução pós-transferência
<ol><li>Preparando soluções de açúcar<ol>
<li>Encha cada tanque de solução com 2 L (ou 4 L) de água do sistema (a água do sistema é definida como água que foi tratada com a razão correta da solução de sal e está na mesma temperatura que os tanques de estoque e tratamento).</li>
		<li>Meça a quantidade correta de glicose e manitol (ver passo 5 abaixo) usando uma balança de carregamento superior e barcos de pesagem separados para cada produto químico.</li>
		<li>Adicione a glicose pesada ou aliquot mannitol ao tanque de solução limpo apropriado, que contém apenas água do sistema.</li>
		<li>Misture as soluções de glicose e manitol com hastes de vidro separadas até que os açúcares sejam completamente dissolvidos.</li>
		<li>Devolva os tanques de solução para o banho de água e cubra com as tampas correspondentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparando soluções de água<ol>
<li>Encha tanques experimentais (2 L ou 4 L) com água do sistema.</li>
		<li>Devolva esses "tanques de solução" ao banho de água e cubra com as tampas correspondentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Alterar percentuais
<ol><li>Mantenha o peixe em uma solução de 1% durante as primeiras 2 semanas de tratamento: 40 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.</li>
	<li>Mantenha o peixe em uma solução de 2% durante as semanas 3 e 4 de tratamento: 80 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.</li>
	<li>Mantenha o peixe em uma solução de 3% para as últimas 4 semanas de tratamento: 120 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.</li>
</ol>6. Medir os níveis de glicose no sangue e coletar tecido
<ol><li>Anesthetize peixe 2 de cada vez em uma solução tricaine 0,02%.</li>
	<li>Decapitar o peixe diretamente atrás das brânquias usando um razorblade.</li>
	<li>Meça o valor do açúcar no sangue. NOTA: Usamos um medidor de glicemia (por exemplo, Freestyle Lite) para medir a glicemia e colocar a tira de teste diretamente no coração exposto (amostra de sangue cardíaco).</li>
	<li>Dissecar o tecido desejado do peixe (cérebro, músculo, etc.).</li>
	<li>Armazene o tecido coletado por flash congelando em gelo seco e armazenando em um congelador de -80 °C, fixando em 4% de paraformaldeído ou colocando em uma solução tampão para uso imediato.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Diabetes é um problema nacional. Estudos mostram que até 2030, estima-se que 400 milhões de pessoas terão algum tipo de diabetes. Em modelos de roedores, o DM tipo 2 é estudado usando manipulação genética. Em ratos, os ratos gordurosos zucker diabéticos (ZDF), e os ratos gordurosos Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), estão fornecendo mais informações sobre os efeitos do Tipo 2 DM10. Além disso, dietas de alto teor de gordura têm sido usadas em roedores para induzir hiperglicemia. Isso espelha o p...

Os zebrafish (Danio rerio) estão rapidamente se tornando um modelo animal amplamente utilizado para estudar tanto a doença quanto a cognição1. A facilidade da manipulação genética e da transparência embrionária através dos estágios iniciais do desenvolvimento, fazem deles um dos principais candidatos a estudar doenças humanas com uma base genética conhecida. Por exemplo, os zebrafish têm sido usados para estudar síndrome de Holt-Oram, cardiomiopatias, doença renal glomerulocástica, distrofia muscular e diabetes mellitus (DM) entre outras doenças1. Além disso, o modelo de zebrafish é ideal por causa do pequeno tamanho da espécie, facilidade de manutenção e alta fecundidade2,3.
O pâncreas de zebrafish é anatomicamente e funcionalmente semelhante ao pâncreasmamífero 4. Assim, as características únicas de tamanho, alta fecundidade e estruturas endócrinas semelhantes fazem do zebrafish um candidato adequado para estudar complicações relacionadas ao DM. No zebrafish, existem dois métodos experimentais usados para induzir a hiperglicemia prolongada que é característica do DM: um influxo de glicose (modelagem Tipo 2) e cessação da secreção de insulina (modelagem Tipo 1)5,6. Experimentalmente, para parar a secreção de insulina, as células β pancreáticas podem ser quimicamente destruídas usando injeções de Estreptozotocina (STZ) ou Alloxan. A STZ tem sido utilizada com sucesso em roedores e zebrafish, resultando em complicações associadas à retinopatia7,8,9, prejuízos cognitivos10e regeneração de membros11. No entanto, em zebrafish, β células se regeneram após o tratamento, fazendo com que "injeções de reforço" de STZ sejam necessárias para manter as condições diabéticas12. Alternativamente, o pâncreas do zebrafish pode ser removido6. Estes são procedimentos altamente invasivos, devido às múltiplas injeções, e tempo de recuperação extensiva.
Por outro lado, a hiperglicemia pode ser induzida não invasivamente através da exposição à glicose exógena. Neste protocolo, os peixes ficam submersos em uma solução de glicose altamente concentrada por 24 horas5,13 ou continuamente durante 2 semanas14,15,16. A glicose exógena é tomada transdermicamente, por ingestão, e/ou através das brânquias, resultando em níveis elevados de açúcar no sangue. Uma vez que esta técnica não invasiva não manipula diretamente os níveis de insulina, não pode alegar induzir DM tipo 2. No entanto, pode ser usado para examinar complicações induzidas pela hiperglicemia, que é um dos principais sintomas do DM tipo 2.
Recentemente, o mutante de zebrafish pdx1-/- foi desenvolvido manipulando o gene homeobox 1 pancreático e duodenal, um gene ligado à causa genética do DM tipo 2 em humanos. Usando este mutante, os pesquisadores conseguiram replicar a interrupção do desenvolvimento pancreático, o alto açúcar no sangue e estudar a retinopatia diabética induzida pela hiperglicemia17,18.
Neste artigo, descrevemos um método de indução de hiperglicemia não invasiva que usa um protocolo de imersão alternada. Este protocolo mantém condições hiperglicêmicas por até 8 semanas com complicações subsequentes observadas. Em suma, os zebrafish adultos são colocados em uma solução de açúcar por 24 horas e, em seguida, uma solução de água por 24 horas. Ao contrário da imersão contínua em soluções externas de glicose, alternar dias entre açúcar e água imita o aumento e a queda do açúcar no sangue no diabetes. Um protocolo de glicose alternado também permite que a hiperglicemia seja induzida por períodos mais longos de tempo, já que os zebrafish não são tão capazes de compensar as altas condições de glicose externa. Como prova de princípio, fornecemos dados mostrando que a hiperglicemia induzida por este protocolo altera a química da retina e a fisiologia.

<table><tbody><tr><td>Tubulação de linha aérea</td><td>petsmart</td><td>5291863</td><td>Isso pode ser usado no tanque para circular ar</td></tr><tr><td>Airpump</td><td>petsmart</td><td>5094984</td><td>Isso pode ser usado no tanque para circular ar</td></tr><tr><td>Airstones</td><td>petsmart</td><td>5149683</td><td>Isso pode ser usado no tanque para circular ar</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270-5KG</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>AC125340050</tr><tr><td>Freestyle Lite Meter</td><td>Amazon</td><td>B01LMOMLTU</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite Tiras</td><td>Amazon</td><td>B074ZN3H2Z</td><td></td></tr><tr><td>Net</td><td>petsmart</td><td>5175115</td><td></td></tr><tr><td>Tanques</td><td>Amazon</td><td>B0002APZO4</td><td></td></tr></tbody></table>

imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

O zebrafish (Danio rerio) é um excelente modelo para investigar os efeitos da hiperglicemia crônica, uma marca registrada do Diabetes Mellitus tipo II (T2DM). Este protocolo de imersão alternativo é um método não invasivo e passo-a-passo de induzir hiperglicemia por até oito semanas. Os zebrafish adultos são alternadamente expostos ao açúcar (glicose) e água por 24 horas cada. Os zebrafish começam o tratamento em uma solução de glicose de 1% por 2 semanas, depois uma solução de 2% por 2 semanas, e finalmente uma solução de 3% para as 4 semanas restantes. Em comparação com os controles tratados com água (estresse) e tratados com manitol (osmóticos), os zebrafish tratados com glicose têm níveis significativamente mais elevados de açúcar no sangue. Os zebrafish tratados com glicose apresentam níveis de açúcar no sangue de 3 vezes mais do que os controles, sugerindo que após quatro e oito semanas a hiperglicemia pode ser alcançada. A hiperglicemia sustentada esteve associada ao aumento da Proteína Ácida Fibrilar (GFAP) e ao aumento dos níveis de kappa B (NF-kB) na retina e diminuição das respostas fisiológicas, bem como déficits cognitivos sugerindo que este protocolo pode ser usado para modelar complicações da doença.

Utilizando este protocolo (Figura 1), os valores de açúcar no sangue são significativamente elevados após 4 semanas e 8 semanas de tratamento(Figura 2A),com hiperglicemia definida como 3x as médias de controle tanto de grupos tratados com água quanto tratados com manitol. Os controles tratados com água são transferidos diariamente para dentro e para fora da água, proporcionando um controle de estresse/manuseio. O mannitol serve como um controle osmótico em estud...

Este protocolo invasivamente induz hiperglicemia em zebrafish por até 8 semanas. Usando este protocolo, um estudo aprofundado dos efeitos adversos da hiperglicemia pode ser feito.

Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Este protocolo induz a hiperglicemia em peixes zebras em um padrão de ascensão e queda que imita a hiperglicemia que é vista no diabetes tipo dois. A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica não invasiva que torna possível garantir que a hiperglicemia seja a causa de quaisquer alterações observadas no peixe hiperglicímico. Este protocolo poderia potencialmente ser usado para explorar vias terapêuticas ou fármacos que visam complicações da hiperglicemia.Este protocolo tem um monte de etapas, mas quando os passos são seguidos corretamente e com cuidado, ele deve rapidamente se tornar segunda natureza. Lembre-se, no entanto, para sempre tratar os animais de forma suave e humana durante todo o protocolo. Comece montando seis tanques, dois para cada grupo experimental.Utilize dois tanques de litro, se o número total de peixes for inferior a 20 e quatro litros se o número total de peixes for superior a 20. Rotule um dos dois tanques, tanque de habitação e o outro tanque de solução. Mantenha os tanques em um banho de água a 28 a 29 graus Celsius para manter a temperatura da água.No primeiro dia, coloque os peixes em suas respectivas soluções de tratamento por 24 horas. No segundo dia, transfira os peixes de suas soluções de tratamento para a água por 24 horas. No terceiro dia, transfira os peixes da água para soluções de tratamento.Continue esta exposição alternada para o restante do experimento. Transferência de água tratada controle peixe de água para água diariamente. Certifique-se de que os peixes são alimentados e transferidos dentro da mesma janela de duas horas por dia durante toda a duração do experimento.Transfira peixes em cada grupo de tratamento do tanque de habitação para o tanque de solução correspondente usando uma rede de peixe padrão. Coloque o tanque contendo o peixe de volta no banho de água e substitua a pedra de ar e a tampa do tanque. Este tanque é agora o tanque de habitação e o tanque que anteriormente segurava o peixe é agora o tanque de solução.Descarte a solução antiga e limpe o tanque junto com as tampas do tanque, linhas de ar, pedras de ar e redes para evitar o acúmulo de glicose e manitol. Use água e uma esponja dedicada para cada condição de tratamento para limpar adequadamente os tanques. Seque os tanques de solução recém-limpos com uma toalha de papel e prepare as soluções para o dia seguinte usando este tanque.Certifique-se de que os outros itens são secos e separados por grupos de tratamento apropriados. Para preparar as soluções de açúcar, encha cada tanque de solução com dois ou quatro litros de água do sistema. Meça a quantidade correta de glicose e manitol usando uma balança de carregamento superior e barcos de pesagem separados para cada produto químico.Adicione a glicose ponderada ou aliquot mannitol ao tanque de solução limpa apropriado. Mexa as soluções com hastes de mexidas de vidro separadas até que os açúcares estejam completamente dissolvidos. Em seguida, devolva os tanques de solução para o banho de água e cubra-os com suas tampas correspondentes.Para preparar a solução de água, encha os tanques experimentais com água do sistema Devolva esses tanques de solução para o banho de água e cubra-os com suas tampas correspondentes. Os valores de açúcar no sangue foram significativamente elevados após os tratamentos de glicemia de quatro semanas e oito semanas. Com hiperglicemia definida como três vezes a média de controle tanto de grupos tratados com água quanto de manitol.Tecido retiniano coletado após quatro semanas de hiperglicemia teve um aumento nos níveis de proteína ácida fibrilar gliana ou GFAP. A expressão GFAP é observada em células gliais de Mueller na retina, que são alteradas na retinopatia diabética. Esse aumento da GFAP esteve associado ao aumento dos níveis de kappaB de fator nuclear.Sugerindo que a hiperglicemia induzida desencadeia uma resposta inflamatória e gliose reativa. As gravações de ERG após quatro semanas de tratamento identificaram uma diminuição da resposta nas retinas tratadas com glicose em comparação com os controles tratados com manitol. Amplitudes de componentes fotorreceptor e células bipolares foram diminuídas em peixes hiperglicêmicos.Este procedimento pode ser complementado por outros testes de hiperglicemia. Por exemplo, um ensaio de memória pode ser usado para olhar para déficits cognitivos ou registrar respostas visuais, como a resposta optomotor para avaliar complicações baseadas na visão. Uma vez estabelecida essa técnica, nosso laboratório foi capaz de usá-la para estudar complicações induzidas por hiperglicemia no modelo de peixe-zebra.Observamos essas complicações relativamente rapidamente, após quatro semanas de tratamento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

Este vídeo descreve a técnica de criação de um modelo de peixe-zebra para diabetes mellitus tipo 1 com a ajuda do medicamento Streptozocin, para estudar a fisiopatologia das complicações diabéticas e a memória metabólica.

Tratamento com estreptozocina: um modelo de peixe-zebra de diabetes mellitus tipo 1

Memória metabólica é o fenômeno pelo qual complicações diabéticas persistir e progredir sem obstáculos, mesmo depois de euglicemia é alcançado farmacêutico. Descrevemos aqui um modelo de diabetes mellitus do peixe-zebra que é único na medida em que permite que o exame dos componentes mitoticamente transmissíveis epigenéticos de memória...

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O peixe-zebra é um importante organismo modelo para o estudo da homeostase energética.  Ao utilizar um indicador redox sensível ao NADH2, alamar Blue, desenvolvemos um ensaio que mede a taxa metabólica de larvas de peixe-zebra em um formato de placa de 96 poços e pode ser aplicado à descoberta de medicamentos ou genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Este trabalho descreve métodos para estabelecer modelos de hiperglicemia aguda e crônica no peixe-zebra. O objetivo é investigar o impacto da hiperglicemia em processos fisiológicos, como a neurogênese constitutiva e induzida por lesão. O trabalho também destaca o uso de peixe zebra para seguir moléculas radiomarcadas (aqui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.

Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas

Aqui, vamos discutir um protocolo do método que permite uma análise fácil da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida em configurações de longo prazo patologias vasculares relacionadas a neoangiogênese e mudanças estruturais.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Apresentamos uma câmara comportamental projetada para avaliar o desempenho cognitivo. Fornecemos dados mostrando que uma vez adquiridos, zebrafish se lembram da tarefa 8 semanas depois. Também mostramos que os zebrafish hiperglicêmicos alteraram o desempenho cognitivo, indicando que esse paradigma é aplicável a estudos que avaliam a cognição e a memória.

A Tarefa Comportamental de Escolha de Três Câmaras usando zebrafish como um sistema modelo

Paradigma do condicionamento clássico medo foi adaptado para participantes humanos em um ambiente totalmente imersiva realidade virtual. Usando um paradigma de discriminação, medo condicionado de sinalização, e retenção da memória de contexto, e extinção foi medido com a resposta da pele a condutância dinâmica cobras e aranhas virtuais (os estímulos condicionados) em dois contextos distintos virtual.

O condicionamento do medo humano Realizado em total imersão Realidade Virtual 3-Dimensional

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Aprenda a induzir hiperglicemia prolongada em zebrafish usando imersão alternada em glicose. Este protocolo não invasivo permite estudar complicações diabéticas e avaliar respostas inflamatórias retinianas em modelo animal.

Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish

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