Síntese de pyrazole dependente de pH, Imidazol e Isoindolone Dipyrrinone Fluorophores usando uma Abordagem de Condensação Claisen-Schmidt

A reação de condensação de Claisen-Schmidt é uma reação antiga, sendo relatada pela primeira vez por Claisen e Schmidt simultaneamente em 1881. Envolve a adição de enoolado assistido por base de uma cetona ou aldeído, mostrado em azul, em um aldeído aromático, mostrado em vermelho. Inicialmente, a adição do enolate resulta na formação de um álcool, como mostrado nos suportes.

No entanto, uma desidratação subsequente produz um enone. Uma vez que o aro-aldeído não contém um hidrogênio alfa, ele não pode formar um enoolante. Como resultado, bases muitas vezes fracas, como hidróxido, podem ser usadas para gerar o enolate.

A condensação de Claisen-Schmidt tem sido usada para gerar uma série de compostos ao longo dos anos. No entanto, tem sido amplamente usado para se juntar aos sistemas de anéis aromáticos dos chalcones e flavanones, que são mostrados em vermelho e azul. A porção azul indica que derivada do enolato e do vermelho é da porção aromática.

Os chalcones e flavanones são essenciais para uma gama de moléculas biologicamente ativas que possuem uma gama de atividades, como antibacteriano, antifúngico, anti-inflamatório e anti-tumor, dependendo do padrão de substituição. Outra ampla classe de moléculas geradas a partir da reação de condensação de Claisen-Schmidt são os compostos de ponte de methine dos quais damos exemplos neste estudo. Nosso laboratório está interessado em constituintes fluorescentes da bilirrubina pigmentada, que é naturalmente produz um produto de degradação de heme.

A síntese da bilirrubina e muitos de seus constituintes gira em torno da condensação do tipo Claisen-Schmidt, que pode ser visualizada nas estruturas exibidas pelos componentes de enolato azul e os componentes de aldeído aromático vermelho. Tipicamente, constituintes diretos de bilirrubina, como dipironones, não são fluorescentes. No entanto, se uma ponte entre os dois grupos de nitrogênio com um grupo de metileno ou carbonil, as moléculas resultantes tornam-se altamente fluorescentes, como no caso de xanthoglows.

Normalmente, os dipironones absorvem UV ou luz azul, o que resulta em um processo de isomerização de Z a E. Como dipyrrinones não resumidos, os N em dipironones pontes também absorvem UV ou luz azul, mas diferem na medida em que relaxam em um estado animado via fluorescência. Descobrimos recentemente uma série de derivados de dipyrrinone que na verdade fluorescem sem uma ponte covalente ligando os dois grupos de nitrogênio.

Em vez disso, uma ligação de hidrogênio parece estar impedindo o processo de isomerização de Z a E, levando a um modo de fluorescência. Além disso, foi feita uma descoberta inesperada de que essas moléculas podem ser desprotosas em mídia básica, levando a espectros de emissão de absorção redshifted nos estados desprotosados. Consequentemente, essas moléculas podem ter valor como sondas de pH racionamento.

Os derivados fluorescentes dipyrrinone são usados, gerando uma leve adaptação na reação tradicional de condensação claisen-Schmidt. Este protocolo desvia-se da tradicional reação de condensação de Claisen-Schmidt na qual um enolato vinylogous derivado de uma pirrolinona ou isoindolone é a fonte nucleofílica. O enolato vinylogous adiciona a um pirázio ou aldeído imidazol para gerar uma pequena biblioteca de análogos dipirorinone.

O procedimento que é usado para criar esta biblioteca é ilustrado no vídeo. No entanto, passos análogos podem ser usados para realizar a tradicional reação de Claisen-Schmidt. Embora a reação de Claisen-Schmidt tenha sido e ainda seja uma reação sintética amplamente utilizada, esta é a primeira contagem de vídeo deste método, ao qual estamos cientes.

Para se preparar para a síntese de um análogo fluorescente dipirorinono através da condensação aldol, pese equivalentes iguais do nucleófilo e eletrofildo escolhido. Em seguida, adicione-os a um frasco de fundo redondo de 25 mililitros contendo uma barra de agitação magnética. Meça cinco mililitros de etanol usando um cilindro graduado.

Em seguida, adicione o etanol ao frasco fundo redondo. Meça 2,4 mililitros de hidróxido de potássio de 10 molar previamente preparado usando um cilindro graduado. Em seguida, adicione o hidróxido de potássio ao frasco.

Para ajustar o frasco até o refluxo, aplique uma quantidade suficiente de graxa de vácuo na articulação de vidro moída de um condensador de reação para evitar a apreensão das articulações de vidro moída. Conecte o condensador a um suprimento de água fria e, em seguida, conecte a junta untada do condensador ao frasco fundo redondo. Em seguida, coloque o frasco em um banho de óleo ou em um bloco de aquecimento de alumínio que pode manter uma temperatura constante via casal térmico com um agitador de placa quente.

Aqueça até a temperatura do refluxo, permitindo que a reação se mexa. A mistura de reação deve ser monitorada por cromatografia de camada fina em uma, três, seis, 12 e 24 horas para medir a taxa de reação e verificar o consumo completo dos materiais iniciais. Deixe o frasco esfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, evaporar o solvente de etanol usando um evaporador rotativo.

Coloque o frasco em um banho de gelo e deixe o frasco equilibrar à temperatura do banho de gelo ao longo de cinco minutos. Neutralize qualquer hidróxido de potássio restante no frasco adicionando 1,7 mililitros de ácido acético em uma única porção. Se a formação de cristais ocorreu após a neutralização, siga o procedimento de purificação da filtragem do vácuo.

Se não foi observada formação de cristais, siga o procedimento de purificação da cromatografia da coluna flash. Coloque um pedaço redondo de papel filtro em cima do funil e molhe levemente o papel usando água deionizada para aderir ao funil. Para se preparar para a filtragem a vácuo de cristais, coloque um funil Hirsch ou Buchner em um frasco de braço lateral usando um adaptador de borracha instalado.

Para evitar entupimento do papel filtro que pode impedir a filtragem, usamos um funil Hirsch ou Buchner maior do que é típico para processos de filtragem de escala semelhantes. Despeje o conteúdo do frasco fundo redondo sobre o papel do filtro e deixe a mistura filtrar. Enxágüe os cristais durante o processo de filtragem usando 10 mililitros de água deionizada gelada.

Após a filtragem, transfira os cristais para um frasco de fundo redondo de 25 mililitros. Aplique uma camada leve de graxa de vácuo em um adaptador de vidro de linha de vácuo de alta potência e, em seguida, conecte o adaptador ao frasco fundo redondo. Segure a junta de vidro com um clipe keck.

Para preparar o vácuo de alta potência para secar os cristais de qualquer solvente residual, esfrie adequadamente a armadilha de vácuo de vidro com uma mistura de gelo seco e acetona. Conecte uma linha de vácuo de alta potência ao adaptador de vidro ligado ao frasco traseiro redondo. Ligue a bomba de vácuo de alta potência e deixe os cristais secarem por pelo menos uma hora.

Uma vez que os cristais tenham sido suficientemente secos sob o vácuo, desligue a bomba de vácuo e solte o selo de vácuo para remover o frasco de fundo redondo. Pesar os cristais secos para relatar o rendimento percentual de reação. Para se preparar para a purificação através da cromatografia da coluna flash, adicione a mistura tratada com ácido que não formou cristais do procedimento de síntese a um funil separador.

Meça 10 mililitros de diclorometano usando um cilindro graduado e use-o para diluir a mistura tratada com ácido no funil separador. Feche e agite suavemente o funil separador, certificando-se de ventar com frequência. Após isso, duas camadas separadas devem ser visíveis no funil separador.

Extrair a camada aquosa usando cinco mililitros adicionais de diclorometano. Complete esta etapa mais duas vezes. Combine todas as frações orgânicas e adicione uma quantidade suficiente de sulfato de sódio anidro para secar as frações orgânicas.

Transfira as frações orgânicas secas para um frasco de fundo redondo e remova o diclorometano usando um evaporador rotativo. Diluir o resíduo restante com mais cinco mililitros de diclorometano. Prepare uma coluna usando aproximadamente 75 gramas de gel de sílica e use-a para realizar cromatografia de coluna flash na amostra, usando 10% de metanol em diclorometano como eluente.

Evaporar o eluente das frações coletadas usando um evaporador rotativo. Prepare a bomba de vácuo de alta potência e a armadilha do solvente de vidro, como descrito anteriormente no procedimento de purificação da filtragem de vácuo, e permita que o sólido coletado seque sob alto vácuo por pelo menos uma hora. Uma vez que os cristais tenham sido suficientemente secos sob o vácuo, pese os cristais secos para relatar o rendimento percentual de reação.

Para confirmar a estrutura de cada um dos análogos dipirorinono na biblioteca, vários métodos espectroscópicos foram utilizados em combinação, incluindo espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectroscopia infravermelha e espectrometria de massa de alta resolução. UV-Vis e espectroscopia fluorescente foram utilizados na caracterização fotofísica dos análogos fluorescentes dipyrrinone. Usando a reação de condensação de Claisen-Schmidt, fomos capazes de sintetizar uma pequena biblioteca de 10 compostos, incluindo o de um composto de controle que não pode se envolver em ligações de hidrogênio intermolecular.

Os rendimentos dos análogos de dipyrrinone variaram de cerca de 40% a quase quantitativos e estão listados abaixo de cada molécula. Os compostos com os maiores rendimentos quânticos, tanto nos formulários protoados quanto desprotosados, foram derivados de 2 formylimidazol e são exibidos em caixas rosadas. O composto de controle, que não fluoresce, está em uma caixa de ciano.

Os derivados de dipyrrinone sob uma lâmpada de comprimento de onda longa padrão de 365 nanômetros dão a fluorescência observada. Pode-se observar visualmente a fluorescência mudada que resulta da desprotonação. Através da cor dos frascos, eles transitam de azul para ciano na cor.

Para dados mais quantitativos sobre as propriedades fotofísicas e outras propriedades físicas dos derivados de dipyrrinone, direcionamos os espectadores para a tabela dois na parte escrita do manuscrito. No geral, a reação de condensação de Claisen-Schmidt fornece acesso a uma gama de compostos aromáticos bicíclicos ligados à methine. No entanto, existem algumas limitações.

A reação depende do uso de um nucleófilo enolizável e de um eletrofildo aldeído não enolizável, como um aro-aldeído, a fim de sofrer condensação bem sucedida. Ao não atender a esse requisito básico, as tentativas de realizar essa reação provavelmente resultarão na incapacidade de unir os sistemas de anéis e/ou a geração de produtos paralelos concorrentes. Outra consideração é que as condições básicas são utilizadas para a geração do nucleófilo enolate que pode criar incompatibilidades com grupos funcionais suscetíveis a reações com hidróxido.

Nesses casos, é possível substituir hidróxido por bases nitrogenadas ou carbonato que tenha sido realizado com DBU, trietilamina, piperidina, base de Hunig e carbonato de sódio. Nós simplesmente optamos por usar hidróxido de potássio devido à sua disponibilidade e despesas relativas. Apesar dessas limitações, o método descrito no protocolo pode fornecer um meio de acoplamento de anéis aromáticos para numerosos sistemas através de uma reação de passo único processualmente simples e econômica.

No caso dos análogos de dipyrrinone que sintetizamos, a condensação claisen-Schmidt permitiu uma das rotas mais acessíveis para fluoroforos dependentes de pH descritos até hoje. No entanto, projetos futuros de análogos de dipyrrinone serão desenvolvidos usando o procedimento delineado, a fim de gerar compostos fluorescentes com maior capacidade de ligação de hidrogênio intermolecular e valores mais baixos de pKa. Antecipar que essas sondas aprimoradas dependentes de pH possuam maiores rendimentos quânticos, permitindo a visualização de flutuações de pH para uma gama mais ampla de eventos intracelulares.