Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

Os métodos in vitro existentes para investigar a migração de MSCs incluem Transwell ou protocolos de cicatrização de feridas. O método descrito aqui pode ser usado para rastrear a migração de MSCs para explante em tempo real. Em termos de cultura de explante, a vantagem deste método em relação a outros é que ele consegue uma redução de tempo e custo, bem como uma simplificação das etapas experimentais.

Essa técnica pode ser usada para observar o homing de células-tronco ao alvo em tempo real, levando ao desenvolvimento de modelos com eficiência de homing otimizada. A remoção da membrana tectória é difícil para pesquisadores inexperientes. Dependendo do estágio de desenvolvimento, entender o momento certo para remover a membrana tectória é importante para o sucesso deste protocolo.

Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Jeong-Eun Park e Dr.Su Hoon Lee, professores pesquisadores do meu laboratório. Comece esterilizando a capa de cultura de tecidos de fluxo laminar ligando a luz ultravioleta por aproximadamente 30 minutos. Pulverize todas as superfícies com etanol 70% antes de usar e deixe-as secar.

Coloque os instrumentos de dissecção em etanol a 70% por 10 minutos e seque-os antes de usar. Depois de decapitar um camundongo de três a quatro dias de idade, mergulhe o proa em etanol a 70% e coloque-o sob um microscópio serial na capela de fluxo laminar. Mergulhe rapidamente o tecido em solução de dissecção de tecido para remover o etanol.

Corte a linha central do crânio com a lâmina cirúrgica e, em seguida, exponha o crânio puxando a pele para baixo anteriormente e cortando o canal auditivo externo da orelha. Corte da parte anterior para a posterior do crânio através da linha dos olhos, depois abra o crânio e remova o prosencéfalo, o cerebelo e o tronco encefálico com uma pinça romba. Usando micropinças, separe a cóclea do osso temporal e transfira-a para uma placa de Petri contendo solução de dissecção de tecido.

Disseque cuidadosamente toda a cápsula ótica coclear, deixando apenas o tecido mole coclear interno. Segure o modíolo da cóclea com uma pinça e o ducto coclear com outro par de pinças e, em seguida, separe lentamente os dois tecidos. Remova a estria vascular e a membrana tectória retirando-as suavemente.

Coloque uma lamínula de plástico esterilizada em uma nova solução de dissecção de tecido e, em seguida, coloque o órgão de Corti na lamínula, certificando-se de que a membrana basilar esteja voltada para baixo. Imobilize o tecido pressionando a membrana de Reissner e o tecido modíolo restante na lamínula com uma pinça. Transfira a lamínula com o tecido embutido para o centro de uma placa confocal de 35 milímetros.

Coloque o cilindro de clonagem de vidro no prato com o explante coclear posicionado no centro do prato e adicione 100 microlitros de meio de cultura de explante no cilindro. Coloque 5.000 células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea ou MSCs marcadas com GFP em dois mililitros de meio de cultura fora do cilindro de vidro e coloque o prato na incubadora. Depois de cultivar as células conforme descrito no manuscrito do texto, aspire todo o meio dentro e fora do cilindro e remova o cilindro de vidro da placa confocal.

Adicione dois mililitros de meio de cultura fresco ao prato. Coloque-o em uma incubadora umidificada até que esteja pronto para análise. Use um sistema de microscopia confocal com uma incubadora de palco.

Ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador. Defina as condições da incubadora superior do palco para 37 graus Celsius e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Coloque o sample prato no recipiente de fixação do prato, cubra-o com a tampa de fixação do prato e feche a câmara com a tampa superior do aquecedor.

Ajuste o zoom e o foco para localizar o órgão de Corti e MSCs no campo de visão. Abra o software de processamento de imagem. Na opção localizar, selecione uma objetiva apocromática plana de 20X ou uma abertura numérica de 0,8 e uma área de corte de 0,5X.

Em aquisição, clique em configuração inteligente e selecione EGFP. Abra a guia do canal em aquisição e defina a potência do laser para 0,2% o orifício para 44 micrômetros, o ganho mestre para 750 volts e o ganho digital para 1,0. Clique em ESID em configuração de imagem e defina o ganho ESID para quatro e o ganho digital para 7.5.

Clique nas peças e estaca para produzir 210 peças. Abra a estratégia de foco e selecione o modo de foco. Em série temporal, defina a duração como 24 horas e o intervalo como 10 minutos.

Em aquisição, defina o tamanho do quadro como 512 por 512 pixels, a velocidade de varredura como oito, a direção como bidirecional, a média como 4X e os bits por pixel como 16. Clique em iniciar experimento para iniciar o experimento. O caminho bidimensional das células-tronco mesenquimais ou MSCs foi rastreado em um método de cicatrização de feridas usando um cilindro de vidro como barreira entre as MSCs e o órgão de Corti.

Quando o órgão de Corti foi cultivado, os fibroblastos cresceram muito rapidamente para fora das células ciliadas externas na camada mais externa. A maioria das MSCs marcadas com GFP foi empurrada para fora por fibroblastos de crescimento rápido. No entanto, alguns penetraram na camada de fibroblastos e migraram com sucesso para o órgão de Corti.

Os resultados de 72 horas de incubação mostraram que as CTMs migraram para o órgão de Corti e foram localizadas principalmente no modíolo e na área com as fibras nervosas cocleares separadas do modíolo. A morfologia das CTMs foi alterada para uma forma radial semelhante à das fibras nervosas. As células foram transformadas em uma forma linear ao longo da linha do limbo, em vez da área da célula ciliada.

As MSCs foram capazes de migrar e crescer na área de coleta de fibras nervosas, penetrando nas várias camadas celulares e barreiras físicas. Quando o dano às células ciliadas foi induzido por um tratamento de 16 horas com canamicina e as células foram cultivadas por mais 72 horas após a remoção da canamicina, as MSCs foram localizadas não apenas no modíolo, mas também nas células ciliadas externas. A imobilização do tecido é um passo importante neste protocolo onde o órgão de Corti está anexado.

Não cai facilmente. Esta é uma dica trivial, mas útil para uma cultura de explante bem-sucedida. Este método pode ser adaptado para estudar a eficácia dos exossomos secretados pelas MSCs.