Name: Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a rastrear a migração de células-tronco mesenquimais em direção ao órgão de Corti usando microscopia confocal em tempo real. Este método simplificado reduz custos e tempo experimental.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) da National Research Foundation (NRF) da Coreia e do Hallym University Research Fund.

Todos os protocolos de pesquisa envolvendo camundongos ICR foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade yonsei da Faculdade de Medicina wonju. Os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial. Neste protocolo, os camundongos gestantes de ICR foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12/12 horas com livre acesso a alimentos e água.
1. Dissecção de cochleae
<ol><li>Esterilize a capa de cultura de tecido de fluxo laminar ligando a luz ultravioleta por ~30 min, e pulverize todas as superfícies com 70% de etanol antes de usar. Deixe as superfícies secarem.</li>
	<li>Coloque instrumentos de dissecção em 70% de etanol por 10 minutos e seque antes de usar.</li>
	<li>Use uma lâmina de operação para decapitar ratos pós-natais de 3 a 4 dias de idade(Figura 2A).</li>
	<li>Coloque o crânio sob um estereótipo na capa de fluxo laminar, e mergulhe o tecido em 70% de etanol.</li>
	<li>Mergulhe rapidamente o tecido na solução de dissecção tecidual (1x Hank's Balanced Salt Solution, 1 mM HEPES) para remover o etanol.</li>
	<li>Corte a linha central do crânio com uma lâmina cirúrgica(Figura 2B,C).</li>
	<li>Exponha o crânio puxando a pele anteriormente e cortando o canal auditivo externo da orelha(Figura 2D).</li>
	<li>Corte da parte anterior para a parte posterior do crânio através da linha ocular(Figura 2E).</li>
	<li>Abra o crânio e remova o cérebro, o cerebelo e o tronco cerebral com fórceps contundentes(Figura 2F,G).</li>
	<li>Utilizando micro fórceps, separe a cóclea do osso temporal(Figura 2H).</li>
	<li>Transfira a cóclea para uma placa de Petri contendo solução de dissecção tecidual.</li>
	<li>Disseca cuidadosamente toda a cápsula ótica coclear, restando apenas o tecido mole coclear interno(Figura 2I,J).</li>
	<li>Segure o modiólus da cóclea com fórceps e o duto coclear com outro par de fórceps, e separe lentamente os dois tecidos(Figura 2K).</li>
	<li>Remova a estria vascularis e a membrana tectorial descascando-as suavemente(Figura 2L,M).</li>
	<li>Coloque uma tampa plástica esterilizada em nova solução de dissecção tecidual e, em seguida, coloque o órgão de Corti em uma tampa de 9 mm de diâmetro,certificando-sede que a membrana basilareada fica para baixo(Figura 2N-P ).</li>
	<li>Imobilize o tecido pressionando a membrana do Reissner e o tecido modiolus restante na tampa com fórceps(Figura 2N-P).</li>
	<li>Transfira a tampa com o tecido incorporado para o centro de uma antena confocal de 35 mm de diâmetro.</li>
	<li>Coloque o cilindro de clonagem de vidro no prato, com a explanta coclear posicionada no centro do prato, e adicione 100 μL de cultura de explanta (DMEM/F12, 10% de soro bovino fetal (FBS), suplemento 1% N2, ampicillina (10 μg/mL))10 dentro do cilindro(Figura 2Q).</li>
	<li>Placa 5 × 103 células de proteína fluorescente verde derivada da medula óssea do rato (GFP) marcadas MSCs em 2 mL de meio de cultura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, suplemento 1% N2, 10 μg/mL de ampicilina) fora do cilindro de vidro(Figura 2R).<ol>
<li>Quando os MSCs são 80-90% confluentes, passá-los desprendendo-os com ácido tetraácático de tripquitina-etilenodiamina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira cuidadosamente o prato confocal para uma incubadora umidificada e incubar durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire todo o meio dentro e fora do cilindro e, em seguida, remova o cilindro de vidro do prato confocal.</li>
	<li>Adicione 2 mL de cultura fresca ao prato confocal, e incubar o prato de cultura tecidual em uma incubadora umidificada até estar pronta para análise.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Figura 2. Dissecção de cóclea de rato e cocultura do órgão de Corti e MSCs. (A) Decapitação do camundongo, (B) e (C) dissecção sagital midline da cabeça, (D) e (E) dissecção coronal do cérebro, (F) e (G) remoção do cérebro e osso temporal, (H) a coclesina, (I) remoção da parede coclear óssea,(J) isolamento da cadeia,(K) separação do duto coclear do transó, (L) separação da estria vascularis (SV) e ligamento espiral (SL) do órgão de Corti, (M) remoção da membrana tectorial, (N-P) fixação da cóclea em um deslizamento de tampa plástica,(Q) localização de deslizamento de tampa e cilindro de vidro na prato confocal, (R) inoculação de MSCs. Barra de escala branca (A-E) = 1 cm; laranja(F, G, P) e barra de escala amarela(H,I) = 1 mm; barra de escala verde (J-O) = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">desta figura.</a>
2. Imagem de lapso de tempo
<ol><li>Para os experimentos aqui apresentados, use um sistema de microscopia confocal com um sistema de incubadora de topo de estágio.</li>
	<li>Ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador.</li>
	<li>Defina as condições da incubadora de topo de palco colocada no palco do microscópio confocal para 37 °C e 5% de atmosfera de CO2.</li>
	<li>Coloque o prato de amostra no recipiente de fixação do prato, cubra com a tampa de fixação do prato e feche a câmara com a tampa superior do aquecedor.</li>
	<li>Ajuste o zoom e o foco para localização do órgão de Corti e MSCs no campo de visão.</li>
	<li>Abra o software de processamento de imagens. Na opção localizar, selecione um objetivo plan-apochromat de 20x (abertura numérica 0,8) e uma área de cultivo de 0,5x.</li>
	<li>Em Aquisição,clique em configuração inteligente e selecione EGFP.</li>
	<li>Abra a guia do canal em Aquisição, e ajuste a potência laser para 0,2%, o pinhole para 44 μm, o ganho mestre para 750 V, e o ganho digital para 1.0.</li>
	<li>Clique em ESID em configuração de imageme defina o ganho do ESID para 4 e o ganho digital para 7,5.</li>
	<li>Clique em Telhas e estaca para produzir 210 telhas.</li>
	<li>Abra a estratégia do Focus e selecione o modo de foco.</li>
	<li>Em sériestemporência, defina a duração para 24h e o intervalo para 10 min.</li>
	<li>Em Aquisição,defina o tamanho do quadro para 512 x 512 pixels, a velocidade de varredura até 8, a direção para bidirecional,a média para 4x, e os bits por pixel para 16.</li>
	<li>Clique no experimento iniciar para iniciar o experimento.</li>
</ol>3. Modificação do arquivo de imagem
<ol><li>Em processamento,clique na costurae defina a sobreposição mínima para 5% e a mudança máxima para 10%.</li>
	<li>Clique na exportação defilme , definir descompactadoe definir a velocidade para 7.5.</li>
</ol>4. Imunostaining
<ol><li>Aspire o meio com cuidado e lave a amostra duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por 5 minutos.</li>
	<li>Fixar a amostra com 4% de formalina em PBS por 15 minutos e lavar a amostra 3 vezes com PBS por 5 min.</li>
	<li>Permeabilize a amostra em 0,1% Triton X-100 em PBS por 10 minutos, e lave 3 vezes com PBS por 5 min.</li>
	<li>Adicione 250 μL de reagente de falo-iFluor 647 (diluição de 1:1000 em PBS), e incubar a amostra por 1h à temperatura ambiente no shaker.</li>
	<li>Lave a amostra 3 vezes com PBS por 5 minutos.</li>
	<li>Transfira a tampa para o escorregador de vidro e adicione 2 gotas de solução de montagem.</li>
	<li>Coloque uma mancha de cobertura no slide suavemente.</li>
	<li>Sele a tampa com esmalte claro e guarde a 4 °C no escuro até que as células sejam observadas.</li>
	<li>Imagem do slide usando um microscópio confocal com um filtro apropriado na excitação/emissão (Ex/Em)=650/665 nm para phalloidina e em Ex/Em=488/507 nm para EGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O transplante de MSCs em locais danificados para promover a regeneração de células danificadas tem sido extensivamente estudado, e o efeito terapêutico é evidente. O transplante e a subsequente diferenciação dos MSCs foram relatados para restaurar a audição em ratos com perda auditiva induzida por ácido 3-nitropropídico13. Embora Lee et al. aplicassem MSCs aos seres humanos transvenosamente, eles não alcançaram qualquer melhora significativa na audição14. Até recentemente, ...

A perda auditiva pode ocorrer congênitamente ou pode ser causada progressivamente por vários fatores, incluindo envelhecimento, drogas e ruído. A perda auditiva é muitas vezes difícil de tratar porque é muito desafiador restaurar a função prejudicada uma vez que as células ciliadas responsáveis pela audição são danificadas1. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que 461 milhões de pessoas em todo o mundo tenham perda auditiva, o que representa 6,1% da população mundial. Dos que têm perda auditiva, 93% são adultos e 7% são crianças.
Várias abordagens foram tentadas para tratar a perda auditiva; notavelmente, uma abordagem de regeneração usando MSCs emergiu como um tratamento promissor. Quando o tecido é danificado, os MSCs são naturalmente liberados para o sistema circulatório e migram para o local da lesão onde secretam várias moléculas para formar um microambiente que promove a regeneração2. Por isso, é importante desenvolver um método para tratar tecidos danificados através da migração de MSCs implantados externamente para órgãos alvo e sua subsequente secreção de moléculas que causam regulação imunológica potente, angiogênese e anti-apoptose para melhorar a restauração da função celular danificada3,4,5.
O processo de homing no qual os MSCs migram para tecidos danificados pode ser o obstáculo mais importante a ser superado. Os MSCs possuem um mecanismo de vagem sistêmica com etapas sequenciais de amarração/rolagem, ativação, prisão, transmigração/diápedese e migração6,7,8. Atualmente, estão em andamento esforços para identificar formas de melhorar essas etapas. Várias estratégias, incluindo modificação genética, engenharia de superfície celular, escoramento in vitro e orientação magnética, foram testadas6,7. Além disso, várias tentativas foram feitas para promover a proteção e regeneração de células ciliadas auditivas, lançando MSCs para o local da cóclea danificada. No entanto, o rastreamento de MSCs in vivo é demorado e trabalhoso e requer habilidades altamente especializadas9.
Para resolver esse problema, foi desenvolvido um método para observar o homing de MSCs na cóclea através de microscopia confocal de lapso de tempo que fotografa a migração de células ao longo de várias horas(Figura 1). Foi desenvolvido no início do séculoXX e recentemente tornou-se uma poderosa ferramenta para estudar a migração de células específicas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 1: Resumo gráfico. (A) Depois que o órgão dissecado de Corti é aderido a um deslizamento de tampas de plástico usando fórceps, o deslizamento de tampa é colocado em um prato microscópico de 35 mm com fundo de vidro, e(B)o cilindro de vidro é posicionado. (C) Depois de encher o interior do cilindro de vidro com MSCs médios,(D)com etiqueta GFP com meio são adicionados cuidadosamente fora do cilindro. (E) Após a incubação durante a noite,(F) o cilindro de vidro é removido, e as imagens são tiradas com um microscópio confocal. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs = células-tronco mesenquimais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalina</td><td>T & I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&nbsp;</td><td>Antena confocal A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>lamínula</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild com DAPI</td><td>sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>suplemento N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reagente</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Superior de Estágio</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Cepa C57BL/6 células-tronco messenquimais de camundongo com GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de corti

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Para estudar os efeitos das células-tronco mesenquimais (MSCs) na regeneração e tratamento celular, este método acompanha a migração do MSC e as alterações morfológicas após a cocultura com epitélio coclear. O órgão de Corti foi imobilizado em uma mancha de plástico pressionando uma porção da membrana do Reissner gerada durante a dissecação. MSCs confinados por um cilindro de vidro migraram em direção ao epitélio coclear quando o cilindro foi removido. Sua localização predominante foi observada no modiol do órgão de Corti, alinhado em uma direção semelhante à das fibras nervosas. No entanto, alguns MSCs foram localizados na área do limbus e apresentaram uma forma horizontalmente alongada. Além disso, a migração para a área da célula ciliada foi aumentada, e a morfologia dos MSCs mudou para várias formas após o tratamento da kanamicina. Concluindo, os resultados deste estudo indicam que a cocultura de MSCs com epitélio coclear será útil para o desenvolvimento da terapêutica via transplante celular e para estudos de regeneração celular que possam examinar várias condições e fatores.

A migração in vitro de MSCs no modo tridimensional foi avaliada por um sistema Transwell ou pelo método tradicional de cicatrização de feridas para observar a migração no modo bidimensional (2D)11. O órgão de Corti é uma estrutura complexa composta por várias células como células Boettcher, células de Cláudio, células de Deiters, células pilares, células de Hensen, células ciliar externas, células ciliar internas, fibras nervosas, membrana manjericão e lamina retic...

Neste estudo, apresentamos um método de imagem em tempo real utilizando microscopia confocal para observar células que se movem em direção ao tecido danificado pela incubação ex vivo com o epitélio coclear contendo o órgão de Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Os métodos in vitro existentes para investigar a migração de MSCs incluem Transwell ou protocolos de cicatrização de feridas. O método descrito aqui pode ser usado para rastrear a migração de MSCs para explante em tempo real. Em termos de cultura de explante, a vantagem deste método em relação a outros é que ele consegue uma redução de tempo e custo, bem como uma simplificação das etapas experimentais.Essa técnica pode ser usada para observar o homing de células-tronco ao alvo em tempo real, levando ao desenvolvimento de modelos com eficiência de homing otimizada. A remoção da membrana tectória é difícil para pesquisadores inexperientes. Dependendo do estágio de desenvolvimento, entender o momento certo para remover a membrana tectória é importante para o sucesso deste protocolo.Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Jeong-Eun Park e Dr.Su Hoon Lee, professores pesquisadores do meu laboratório. Comece esterilizando a capa de cultura de tecidos de fluxo laminar ligando a luz ultravioleta por aproximadamente 30 minutos. Pulverize todas as superfícies com etanol 70% antes de usar e deixe-as secar.Coloque os instrumentos de dissecção em etanol a 70% por 10 minutos e seque-os antes de usar. Depois de decapitar um camundongo de três a quatro dias de idade, mergulhe o proa em etanol a 70% e coloque-o sob um microscópio serial na capela de fluxo laminar. Mergulhe rapidamente o tecido em solução de dissecção de tecido para remover o etanol.Corte a linha central do crânio com a lâmina cirúrgica e, em seguida, exponha o crânio puxando a pele para baixo anteriormente e cortando o canal auditivo externo da orelha. Corte da parte anterior para a posterior do crânio através da linha dos olhos, depois abra o crânio e remova o prosencéfalo, o cerebelo e o tronco encefálico com uma pinça romba. Usando micropinças, separe a cóclea do osso temporal e transfira-a para uma placa de Petri contendo solução de dissecção de tecido.Disseque cuidadosamente toda a cápsula ótica coclear, deixando apenas o tecido mole coclear interno. Segure o modíolo da cóclea com uma pinça e o ducto coclear com outro par de pinças e, em seguida, separe lentamente os dois tecidos. Remova a estria vascular e a membrana tectória retirando-as suavemente.Coloque uma lamínula de plástico esterilizada em uma nova solução de dissecção de tecido e, em seguida, coloque o órgão de Corti na lamínula, certificando-se de que a membrana basilar esteja voltada para baixo. Imobilize o tecido pressionando a membrana de Reissner e o tecido modíolo restante na lamínula com uma pinça. Transfira a lamínula com o tecido embutido para o centro de uma placa confocal de 35 milímetros.Coloque o cilindro de clonagem de vidro no prato com o explante coclear posicionado no centro do prato e adicione 100 microlitros de meio de cultura de explante no cilindro. Coloque 5.000 células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea ou MSCs marcadas com GFP em dois mililitros de meio de cultura fora do cilindro de vidro e coloque o prato na incubadora. Depois de cultivar as células conforme descrito no manuscrito do texto, aspire todo o meio dentro e fora do cilindro e remova o cilindro de vidro da placa confocal.Adicione dois mililitros de meio de cultura fresco ao prato. Coloque-o em uma incubadora umidificada até que esteja pronto para análise. Use um sistema de microscopia confocal com uma incubadora de palco.Ligue o microscópio confocal, a luz fluorescente e o computador. Defina as condições da incubadora superior do palco para 37 graus Celsius e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Coloque o sample prato no recipiente de fixação do prato, cubra-o com a tampa de fixação do prato e feche a câmara com a tampa superior do aquecedor.Ajuste o zoom e o foco para localizar o órgão de Corti e MSCs no campo de visão. Abra o software de processamento de imagem. Na opção localizar, selecione uma objetiva apocromática plana de 20X ou uma abertura numérica de 0,8 e uma área de corte de 0,5X.Em aquisição, clique em configuração inteligente e selecione EGFP. Abra a guia do canal em aquisição e defina a potência do laser para 0,2% o orifício para 44 micrômetros, o ganho mestre para 750 volts e o ganho digital para 1,0. Clique em ESID em configuração de imagem e defina o ganho ESID para quatro e o ganho digital para 7.5.Clique nas peças e estaca para produzir 210 peças. Abra a estratégia de foco e selecione o modo de foco. Em série temporal, defina a duração como 24 horas e o intervalo como 10 minutos.Em aquisição, defina o tamanho do quadro como 512 por 512 pixels, a velocidade de varredura como oito, a direção como bidirecional, a média como 4X e os bits por pixel como 16. Clique em iniciar experimento para iniciar o experimento. O caminho bidimensional das células-tronco mesenquimais ou MSCs foi rastreado em um método de cicatrização de feridas usando um cilindro de vidro como barreira entre as MSCs e o órgão de Corti.Quando o órgão de Corti foi cultivado, os fibroblastos cresceram muito rapidamente para fora das células ciliadas externas na camada mais externa. A maioria das MSCs marcadas com GFP foi empurrada para fora por fibroblastos de crescimento rápido. No entanto, alguns penetraram na camada de fibroblastos e migraram com sucesso para o órgão de Corti.Os resultados de 72 horas de incubação mostraram que as CTMs migraram para o órgão de Corti e foram localizadas principalmente no modíolo e na área com as fibras nervosas cocleares separadas do modíolo. A morfologia das CTMs foi alterada para uma forma radial semelhante à das fibras nervosas. As células foram transformadas em uma forma linear ao longo da linha do limbo, em vez da área da célula ciliada.As MSCs foram capazes de migrar e crescer na área de coleta de fibras nervosas, penetrando nas várias camadas celulares e barreiras físicas. Quando o dano às células ciliadas foi induzido por um tratamento de 16 horas com canamicina e as células foram cultivadas por mais 72 horas após a remoção da canamicina, as MSCs foram localizadas não apenas no modíolo, mas também nas células ciliadas externas. A imobilização do tecido é um passo importante neste protocolo onde o órgão de Corti está anexado.Não cai facilmente. Esta é uma dica trivial, mas útil para uma cultura de explante bem-sucedida. Este método pode ser adaptado para estudar a eficácia dos exossomos secretados pelas MSCs.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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