Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Os experimentos de grampo de remendo e imagem de cálcio são trabalhosos, demorados e desafiadores. Este protocolo fornece um método conveniente para isolar cardiomiócitos atriais e ventriculares murinos de alta qualidade, adequado para experimentos de patch clamp e imagens de cálcio realizadas simultaneamente. A principal vantagem deste protocolo é que podemos obter cardiomiócitos atriais e ventriculares do mesmo animal.

O isolamento de cardiomiócitos atriais murinos é especialmente desafiador e tem sido um fator limitante para experimentos anteriores. Comece pré-enchendo o aparelho de Langendorff com tampão de perfusão e garantindo que esteja livre de ar. Fixe uma cânula aórtica sob o microscópio de dissecção e conecte-a com uma seringa de um mililitro cheia de tampão de perfusão.

Depois de remover o coração do camundongo sacrificado, coloque o coração em tampão de perfusão em temperatura ambiente e canule a aorta com uma agulha cega sob o microscópio o mais rápido possível. Amarre firmemente o coração à agulha com um pedaço de seda de sutura e desconecte a seringa. Após a canulação da aorta, conecte imediatamente o coração canulado ao aparelho de Langendorff, evitando a entrada de ar no sistema.

Perfunda o coração com tampão de perfusão por um minuto a exatamente 37 graus Celsius e uma taxa de perfusão de quatro mililitros por minuto. Mude da perfusão para o tampão de digestão e perfunda por exatamente nove minutos a uma temperatura de 37 graus Celsius e uma taxa de perfusão de quatro mililitros por minuto. Quando terminar, transfira o coração digerido para uma placa de Petri com tampão de digestão suficiente para mantê-lo totalmente coberto.

Em seguida, disseque cuidadosamente os átrios e ventrículos ao microscópio. Transfira os átrios para uma placa de Petri com 1,5 mililitros de tampão de digestão e os ventrículos para outra placa de Petri com três mililitros de tampão de digestão. Com cuidado, mas rapidamente, separe os átrios em pedaços minúsculos usando uma pinça romba.

Dissolva o tecido pipetando cuidadosamente para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 1000 microlitros que foi previamente cortada para alargar a abertura da ponta. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione uma quantidade equivalente de tampão de parada pipetando pela lateral do tubo. Passe todos os três mililitros da solução por uma malha de náilon de 200 micrômetros para remover os pedaços de tecido maiores restantes que não foram totalmente digeridos.

Para realizar a dissecção ventricular, corte o tecido ventricular em pedaços minúsculos usando uma tesoura de dissecção ou fórceps e pipete para cima e para baixo com outra ponta de pipeta de 1000 microlitros para dissolver. Transfira a solução de célula e tecido para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione uma quantidade equivalente de tampão de parada pipetando-o cuidadosamente na lateral do tubo para encerrar a reação. Passe todos os seis mililitros de solução de células e tecidos por uma malha de náilon de 200 micrômetros para remover pedaços maiores que não foram totalmente digeridos.

Deixe as suspensões de células atriais e ventriculares no banco em temperatura ambiente por seis minutos para assentar. Em seguida, centrifugue os tubos a 5G por dois minutos. Descarte os sobrenadantes usando uma pipeta de plástico Pasteur e ressuspenda cuidadosamente os grânulos celulares em 10 mililitros de solução de Tyrode sem cálcio.

Deixe as células atriais e ventriculares por oito minutos para sedimentação. Centrifugue as células atriais em 5G por um minuto. Em seguida, descarte os sobrenadantes de ambas as amostras de células e ressuspenda cuidadosamente os pellets em 10 mililitros de solução de Tyrode com cálcio 100 micromolar.

Deixe as células por oito minutos para sedimentação e, em seguida, repita a centrifugação das células atriais. Rejeitar os sobrenadantes e ressuspender cuidadosamente os sedimentos celulares em 10 mililitros de solução de Tyrode com cálcio 400 micromolar. Repita esse processo mais uma vez, ressuspendendo as células na solução de Tyrode com um cálcio milimolar.

Todas as células atriais são pequenas, com capacitâncias celulares variando de aproximadamente 35 a 100 picofarad. Uma célula típica do miocárdio atrial é mostrada aqui. Os miócitos ventriculares são mais em forma de bastonete e maiores, com capacitâncias celulares variando de 100 a cerca de 400 picofarads.

Exemplos de medições de corrente de cálcio do tipo L com transientes citosólicos simultâneos de cálcio de um miócito atrial e um miócito ventricular são mostrados aqui. Antes de tentar esta técnica, certifique-se de praticar a extração de órgãos. É crucial que a etapa seja realizada rapidamente e todos os cortes de tecido sejam feitos nos locais corretos.

Quando a extração de órgãos é realizada com qualidade reprodutível, reserve algum tempo para aperfeiçoar a canulação. As células isoladas com este protocolo são adequadas para medições de patch clamp. Além disso, eles podem ser carregados com corantes fluorescentes, permitindo uma ampla gama de experimentos de imagem.