Name: Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a investigar infecções urinárias recorrentes causadas por E. coli usando um modelo de camundongo. Este método demonstra como Gardnerella vaginalis desencadeia a emergência de UPEC a partir de reservatórios intracelulares na bexiga.

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Os autores agradecem a Lynne Foster pela assistência técnica em experimentos de infecção, James Fitzpatrick do Centro de Imagem de Porção de Adega (WUCCI) da Universidade de Washington pelo acesso ao SEM, Scott Hultgren pela cepaUTI89 kanR UPEC, e David Hunstad pela leitura crítica do manuscrito.
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), pelo Center for Women's Infectious Disease Research da Washington University School of Medicine (Prêmio de Pesquisa Piloto para NMG), pela American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) e #14POST20020011 (NMG), e pelos Institutos Nacionais de Saúde, NIAID: R01 AI114635 (ALL) e NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projeto II PI:ALL) e K01 DK110225-01A1 (NMG). Alguns dos estudos em animais foram realizados em uma instalação apoiada pela concessão NCRR C06 RR015502. O Centro de Imagem Celular da Universidade de Washington (WUCCI; onde o SEM foi realizado) e o MSJ foram apoiados pela Escola de Medicina da Universidade de Washington, pelo Instituto de Descoberta Infantil da Universidade de Washington e pelo Hospital Infantil de St. Louis (CDI-CORE-2015-505), pela Fundação para o Hospital Barnes-Judeu (3770) e pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS086741). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse relacionados a este estudo.

O primeiro passo crítico neste modelo para identificar camundongos que não limparam a bacteriúria UPEC durante a fase primária da UTI. Esses camundongos devem ser removidos do experimento, pois de outra forma confundiriam as taxas de bacteriúria upec após a exposição g. vaginalis. Após a inoculação inicial da UPEC, a urina deve ser coletada semanalmente para monitorar a liberação bacteriana. Aproximadamente 65-80% dos camundongos C57BL/6 vão limpar uma infecçãopor UTI89 kanR dentro de 4 semanas. Outras cepas de camundongos de raça têm diferentes propensões para o desembaraço upec 42,43 e formação de reservatórios e, portanto, pode não ser adequado para este modelo. O segundo ponto crítico é que estudos empíricos determinaram que duas inoculações sequenciais de G. vaginalis (12 h ou 1 wk de distância) são necessárias para desencadear um surgimento significativo de reservatórios acima do surgimento espontâneo de fundo que ocorre em camundongos de controle expostos apenas à PBS. Outras durações de tempo entre as duas exposições sequenciais não foram testadas, mas podem produzir resultados semelhantes. É importante notar que a redução dos da bexiga upec só foi observada no modelo em que as exposições de G. vaginalis foram dadas 1 wk de distância39. Embora mais de duas exposições possam ser administradas, evidências empíricas sugerem que o cateterismo repetido sozinho aumenta o surgimento, o que pode confundir a interpretação dos resultados ou exigir um número maior de animais para distinguir diferenças entre grupos de exposição e controles. Finalmente, o método de fixação da bexiga in situ tem vários passos críticos. Alguma habilidade é necessária para garantir que o fixador permaneça dentro das bexigas presas. Bexigas deflacionadas serão mais difíceis de serem imagens pela SEM. Também é essencial ser muito gentil ao inocular o fixador na bexiga, pois raspar o urotélio com o cateter fixador pode induzir a esfoliação urotelial independente do que é desencadeado por G. vaginalis. Todas as concentrações mencionadas no coquetel fixador são concentrações finais. Proporções inadequadas destes podem resultar em fixação insuficiente e inchaço ou encolhimento das células. Fixações devem ser aquecidas a temperaturas fisiológicas para evitar choque de temperatura nas células e tecidos. O aquecimento também proporciona uma leve melhora na taxa de difusão de fixações através de membranas plasmáticas. Embora a coloração de ósmio possa ser frequentemente omitida para amostras preparadas para análise sem, é um passo essencial neste protocolo para estabilizar lipídios e evitar a quebra de membranas celulares durante a secagem de pontos críticos.
Este protocolo pode ser modificado para testar outras cepas de UPEC e/ou G. vaginalis para sua capacidade de formar reservatórios e desencadear seu surgimento, respectivamente. Outros fatores experimentais também podem ser adicionados, como a exposição a outras bactérias vaginais (por exemplo, Lactobacillus crispatus PVAS100) ou G. vaginalis, nenhuma das quais demonstram patologia neste modelo39. Ao selecionar outras cepas bacterianas para testar, é importante demonstrar um crescimento consistente de tal forma que uma concentração padrão de inóculo possa ser usada em todos os experimentos. O crescimento daRS JCP8151B foi otimizado em uma câmara anaeróbica. Esta cepa provavelmente poderia ser cultivada em um sistema gaspak anaeróbico, mas isso exigiria otimização para garantir um crescimento bacteriano robusto. Finalmente, pode ser possível modificar o tempo de certas etapas do modelo. Por exemplo, a urina pode ser coletada em momentos anteriores durante a fase de formação do reservatório upec para monitorar as respostas da UFC ou do host. Não foi observado um efeito adverso da coleta de amostras de urina em momentos iniciais (3, 6, 12 hpi) sobre a progressão da infecção ou estabelecimento de reservatórios neste modelo. O surgimento de reservatórios UPEC foi relatado para ocorrer após duas doses deRS JCP8151B dadas 12 h ou 1 wk, mas outros intervalos de tempo ainda não foram testados. Também pode ser possível reduzir o tempo total do modelo reduzindo a fase de formação do reservatório upec para 2 semanas (em vez de 4 semanas), já que muitos dos camundongos limpam bacteriúrias até agora. Estudos anteriores que examinaram o surgimento da UPEC após a exposição da bexiga a esfoliantes químicos utilizaram uma fase de formação de reservatóriosUPEC de 1 ou 2 wk 17,18. No entanto, a diminuição do tempo para a liberação de bacteriúrias da UPEC pode vir ao custo de exigir que mais animais sejam abatidos do experimento. Por fim, a análise SEM da bexiga pode ser realizada em pontos de tempo adicionais para observar a duração do efeito de G. vaginalis no urotélio.
Em relação à solução de problemas, existem algumas considerações importantes especificamente no que diz respeito à análise da SEM bexiga. Dependendo do fundo do camundongo utilizado e da quantidade de inflamação presente, algumas bexigas apresentarão paredes muito finas. Essas bexigas tendem a se enrolar mais durante a secagem de pontos críticos e podem resultar em uma forma de casca de vaca. Se isso ocorrer, o melhor método é cortar a bexiga em forma de concha ao meio ao longo da interface enrolada e, em seguida, uma segunda vez para remover a maior parte do tecido pendente. O corte funciona melhor com uma lâmina de barbear de dois gumes revestido de PTFE. O excesso de gordura às vezes pode solubilizar durante as etapas de coloração de ósmio. Isso pode resultar em gotículas de gordura insolúveis indesejadas que podem não ser lavadas durante as etapas de lavagem e desidratação e que podem se estabelecer na superfície da bexiga durante a secagem subsequente. Essas gotículas podem aparecer como pequenas esferas ou estruturas semelhantes a discos espalhadas pela amostra (Figura 4D). Isso pode ser mitigado, garantindo que o máximo possível de tecido adiposo seja removido ao redor da bexiga. A platina pode ser substituída por revestimento irídio, mas as espessuras devem ser mantidas ao mínimo para reduzir o mascaramento de detalhes estruturais finos. O uso de um estágio rotativo durante o revestimento é altamente recomendado.
Uma limitação deste modelo é que ele requer um grande número de ratos. Apenas 65-80% dos camundongos C57BL/6 limparão suas bacteriúrias UPEC e serão adequados para a subsequente inoculação G. vaginalis ou PBS (ver Figura 2C). Para obter 10-12 camundongos por grupo (G. vaginalis inoculação vs. PBS), ~30 camundongos devem ser inicialmente infectados com UPEC. Além disso, vários experimentos são provavelmente necessários para alcançar as réplicas biológicas necessárias para detectar significância estatística. Quando as exposições foram dadas 1 wk de distância, o surgimento da UPEC ocorreu em 14% dos camundongos expostos à PBS (Figura 3B). Assim, detectar um aumento significativo no UPEC rUTI em G. vaginalis expostos em relação aos controles pbs (alimentados em 0,8; alfa=0,05 [um lado]) requer testar um total acumulado de pelo menos 40 ratos para cada grupo de exposição. Uma consideração adicional é que esses experimentos são caros e intensivos em mão-de-obra. Os camundongos devem ser monitorados semanalmente para liberação da UPEC e o curso de tempo experimental é de 4-5 wk, dependendo se g. vaginalis é dado duas vezes em um período de 12 horas ou duas vezes 1 wk de distância. O SEM é intensivo em mão-de-obra e pode ser caro, dependendo da disponibilidade de microscópio e das taxas de serviço. Preparar toda a bexiga para SEM fornece material abundante para análise, mas a desvantagem é que analisar cada bexiga pode ser demorado. Assim, é provável que apenas um número limitado de bexigas possa ser analisado pela SEM em comparação com os maiores números de animais usados para urina e tetas de tecido. Além disso, a obtenção de imagens de alta qualidade das superfícies curvas dos "copos" da bexiga requer habilidade devido a sombras que podem impedir a visibilidade. Embora a bexiga SEM seja uma ferramenta útil para visualizar a esfoliação urotelial, este método é em grande parte qualitativo. Como a amostra é fixada em forma redonda, e devido ao uso de glutaraldeído no fixador, não é possível a triagem para bactérias fluorescentes expressas através de microscopia leve. Imunostaining e corantes químicos são incompatíveis com este processo devido ao uso de glutaraldeído que vai interligar a maioria dos antígenos e osmium e que irá mascarar locais de antígeno e escurecer o tecido. Dito isto, a técnica SEM é útil para parâmetros que podem ser avaliados quantitativamente sem o uso de sondas adicionais, como tamanhocelular 48,49.
Este modelo oferece várias vantagens além dos métodos descritos anteriormente. Permite o exame de mecanismos de UPEC rUTI causados pelo surgimento de reservatórios de bexiga, em vez de reintrodução na bexiga a partir de uma fonte externa. Outros modelos de rUTI devido ao surgimento de reservatórios de bexiga utilizam agentes químicos (sulfato de protamina ou quitosan) para causar esfoliação urotelial 17,18, o que não seriam gatilhos de rUTI em mulheres. G. vaginalis é uma bactéria urogenital prevalente que foi detectada na urina coletada diretamente da bexiga através de cateterismo ou aspiração suprapúbica em algumas mulheres23,26. Este fato, juntamente com a associação conhecida entre o BV (no qual g. vaginalis cresce demais na vagina) e UTI, sugere que g. vaginalis é um gatilho clinicamente plausível de rUTI. Finalmente, o método de fixação da bexiga in situ preserva a ultraestrutura da bexiga e limita os danos, garantindo que as camadas da bexiga não se separem umas das outras. Métodos anteriores para visualizar o urotélio tradicionalmente têm o usuário asepticamente colher, bissecto, esticar e fixar a bexiga em uma bandeja de dissecção antes de submergir a bexiga esticada emfixação 48. Este método resulta em uma amostra muito plana, mas não garante o alongamento uniforme ou natural do tecido e pode resultar em áreas que estão mais e sob esticadas (resultando em tecido altamente enrugado) e podem causar separação da camada da bexiga. Além disso, essas manipulações físicas da bexiga para esticar e fixar o tecido podem causar danos, incluindo esfoliação urotelial. Outro método é submergir bexigas intactas em fixação antes de incorporar em parafina e adquirir seções finas com um microtome. Seções finas são inestimáveis para experimentos de imunohistoquímica para examinar bactérias e localização de proteínas hospedeiras, mas uma seção fina não permite a visualização da superfície urotelial. Este método SEM permite que a superfície de toda a bexiga seja examinada de uma só vez.
Como descrito, aplicações futuras deste modelo incluem testar outras cepas da UPEC para determinar se formam reservatórios intracelulares e testar outras cepas de G. vaginalis para avaliar se elas provocam esfoliação e emergência da UPEC para causar rUTI. Outras cepas de camundongos além de camundongos C57BL/6 também podem ser testadas, embora camundongos com alta propensão para o desenvolvimento de cistite crônica (como ratos no fundo C3H) não sejam recomendados, já que muitos ratos precisariam ser eliminados do experimento. Uma vantagem adicional dos camundongos C57BL/6 é que muitas cepas genéticas de nocaute estão disponíveis comercialmente. Tais cepas fornecem uma oportunidade para interrogar os fatores hospedeiros envolvidos na formação e/ou emergência dos reservatórios.

As infecções do trato urinário (ITU) impõem uma carga significativa de cuidados de saúde em todo o mundo, impactando a qualidade de vida de milhões de pessoas a cada ano, especialmente as mulheres1. A Escherichia coli uropatogênica (UPEC) é a causa mais frequente da UTI1. Muitos pacientes (aproximadamente 20-30%) que desenvolvem UTI experimentarão uma UTI recorrente (rUTI) dentro de 6 meses, apesar da liberação mediada por antibióticos da infecção inicial2. Infelizmente, cerca de 5% das mulheres na pré-menopausa sofrem de 3 ou mais rUTI a cada ano 3,4. Os episódios sequenciais de rUTI podem ser causados pela persistência da mesma cepa da UPEC do caso do índice 5,6,7,8. Dados de amostras humanas e modelos de camundongos sugerem que a mesma cepa rUTI pode ser causada pela UPEC residente dentro de reservatórios quiescentes na bexiga. Em humanos, a UPEC foi detectada em células epiteliais e biópsias da bexiga de pacientes com UTI 9,10,11,12,13. Estudos em camundongos C57BL/6 demonstraram que algumas cepas de UPEC podem estabelecer reservatórios intracelulares quiescentes na bexiga, detectados pela microscopia de fluorescência e pela homogeneização e cultura do tecido da bexiga, que são mantidos por meses após a resolução da bacteriúria 14,15,16. Tratamento da bexiga com agentes que induzem a esfoliação do epitélio da bexiga (urotélio), por exemplo, sulfato de protamina17 ou quitosan18, desencadear o surgimento da UPEC dos reservatórios para causar rUTI. Esses dados sugerem que em mulheres que abrigam reservatórios de UPEC de bexiga de uma infecção anterior, exposições de bexiga que levam à esfoliação urotelial podem desencadear rUTI.
Há evidências crescentes de que a microbiota vaginal contribui para a infecção do trato urinário19,20. Gardnerella vaginalis é um membro frequente da microbiota vaginal e urinária 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Na vagina, a presença de altos níveis de G. vaginalis está associada a uma disbiose microbiana conhecida como vaginose bacteriana (VUL), que afeta ~30% das mulheres 30,31,32. Mulheres com IV têm maior risco de experimentar UTI em comparação com mulheres com uma comunidade vaginal dominada por Lactobacillus 33,34,35,36,37. Em modelos de camundongos, G. vaginalis causa esfoliação epitelial tanto na vagina38 quanto na bexiga39. Em C57BL/6 camundongos que abrigam reservatórios de bexiga da UPEC, duas exposições sequenciais de bexiga à G. vaginalis - mas não à PBS - resultam em ressurgimento da UPEC dos reservatórios para causar rUTI upec. O surgimento é evidenciado pelo aparecimento de tetas upec na urina de camundongos que haviam resolvido anteriormente bacteriúria upec e uma subsequente diminuição nos títulos homogeneizados da bexiga UPEC em sacrifício em comparação com animais de controle expostos à PBS39. Curiosamente, não há uma colonização duradoura por G. vaginalis na bexiga. Na grande maioria dos casos, duas exposições curtas, cada uma com menos de 12 (h) de G. vaginalis viáveis na urina, são suficientes para provocar a esfoliação urotelial e promover a rUTI.
Este protocolo descreve um modelo de camundongo de rUTI causado pela UPEC residente em reservatórios intracelulares de bexiga, usando a inoculação da bexiga G. vaginalis para desencadear a recorrência. O avanço alcançado por este modelo é que a G. vaginalis é um gatilho biológico clinicamente relevante da rUTI em comparação com os agentes químicos usados anteriormente. Além disso, a sobrevida relativamente curta de G. vaginalis no trato urinário do camundongo permite o exame do impacto das exposições microbianas transitórias no urotélio, como pode ocorrer após a atividade sexual. Além de delinear o modelo rUTI, este protocolo também descreve métodos de citologia urinária e fixação in situ bexiga e imagem do urotélio por meio da varredura de microscopia eletrônica (SEM).
Este protocolo de UTI UPEC recorrente induzida por vaginalis usa a cepa UPEC UTI89 com um de resistência à kanamicina (UTI89kanR)40. Nem todas as cepas de UPEC testadas foram capazes de formar comunidades bacterianas intracelulares durante o estágio de infecção aguda em camundongos41 e ainda não se sabe se todas as cepas de UPEC têm a capacidade de formar reservatórios intracelulares latentes. A formação do reservatório deve ser confirmada antes do uso de outras cepas upec no modelo. Este protocolo utiliza um isolado G. vaginalis resistente à estreptomicina espontânea, JCP8151BSmR38. Indução de rUTI por JCP8151BSmR requer duas inoculações sequenciais de G. vaginalis , dadas 12 h ou 7 dias (d) separadas39. Se outras cepas G. vaginalis induzem ou não a esfoliação e/ou UPEC rUTI permanece a ser determinada com este modelo. É essencial usar cepas de UPEC e G. vaginalis com resistência a antibióticos conhecidos (como kanamycin ou espectinicina para UPEC e estreptomicina para G. vaginalis) porque antibióticos podem ser adicionados a placas de ágar para evitar o crescimento de microbiota de camundongos endógenos que poderiam interferir com unidades de formação de colônias enumeradas (CFU) para monitorar a infecção. Isso é especialmente importante para cultivar amostras de urina, porque a urina do rato frequentemente contém outras bactérias que podem crescer demais em placas de cultura sem antibióticos. A origem dessas bactérias endógenas na urina de camundongos é desconhecida, mas provavelmente reflete bactérias periuretrais e urogenitais captadas durante a coleta de urina.
G. vaginalis é uma bactéria anaeróbica facultativa e, portanto, este protocolo descreve o crescimento G. vaginalis JCP8151BSmR em uma câmara anaeróbica. Se uma câmara anaeróbica não estiver disponível, outros métodos para manter condições de crescimento anaeróbicos (como uma bolsa GasPak em um recipiente hermético) podem ser utilizados. Alternativamente, algumas cepas de G. vaginalis (incluindo JCP8151BSmR) crescerão em uma incubadora padrão de cultura tecidual (5% CO2). Assim como o uso de cepas de G. vaginalis que não sejam JCP8151BSmR requer testes para garantir que as bactérias se comportem de forma semelhante neste modelo, mudar as condições de crescimento requer determinação empírica de durações ideais para cultura (em placas e em líquido) e densidade óptica (OD)600 equivalentes para alcançar concentrações inóculos viáveis desejadas. Além disso, não se sabe se as condições de crescimento influenciam a patobiologia de G. vaginalis.
Finalmente, ao considerar se utilizar esse modelo, os pesquisadores devem estar cientes de que ele pode exigir um número maior de animais por grupo do que os modelos típicos de mouses UTI. Isso ocorre em parte porque a indução do rUTI requer que os camundongos resolvam a bacteriúria UPEC causada pela infecção inicial da bexiga. Assim, qualquer camundongo que não consiga limpar bacteriúria (um fenótipo geralmente indicativo de infecção renal contínua) não está incluído na fase rUTI do protocolo. O número de camundongos necessários para alimentar esses estudos também é influenciado pela taxa de emergência "espontânea" da UPEC na urina (12-14% em média). Finalmente, diferentes cepas de camundongos têm diferentes propensões para o desenvolvimento de bacteriúria crônica versus formação de reservatório intracelular42,43. Se usar cepas de camundongos diferentes de C57BL/6 neste modelo, deve-se confirmar que os animais desenvolvem reservatórios intracelulares quiescentes da UPEC.

<table><tbody><tr><td>30G x 1/2 agulhas</td><td>BD</td><td>305106</td><td>para cateteres</td></tr><tr><td>5 1/2" pinça reta hemostato</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ fixação da bexiga</td></tr><tr><td>ACE 600 Revestidor por pulverização catódica</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>de alumínio SEM</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>Processamento de amostras SEM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ fixação da bexiga</td></tr><tr><td>aba adesiva de carbono condutora&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>Tinta prateada condutora</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>Processamento de amostras SEM</td></tr><tr><td>CPD 300 Secador de Ponto Crítico</td><td>Leica</td><td></td><td>Processamento de amostras SEM</td></tr><tr><td>Clipe de metal citofunil</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>urinálise citospun</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>Glicose& nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>para NYCIII G. vaginalis meio</td></tr><tr><td>de crescimento glutaraldeído</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ fixação da bexiga</td></tr><tr><td>Kit de coloração Hema 3</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>urinálise citospun</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>para NYCIII G. vaginalis meio de crescimento</td></tr><tr><td>irídio</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>isofluorano</td><td></td><td></td><td>anestésico</td></tr><tr><td>de camundongo canamicina</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>adicionar às placas seletivas UPEC LB (50 ug / mL)</td></tr> <tr><td>Ágar Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>placas de crescimento</td></tr> <tr><td>UPECCaldo Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC meio de crescimento</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscópio eletrônico de varredura</td></tr><tr><td>Purificador de Água</td><td>Milli-Q Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>para NYCIII G. vaginalis meios de crescimento</td></tr><tr><td>Microscópio Olympus Vanox AHBT3</td><td>Olympus</td><td></td><td>citospun urinálise</td></tr><tr><td>tetróxido de ósmio</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM processamento de amostras</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ fixação da bexiga</td></tr><tr><td>tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>para cateteres</td></tr><tr><td>Peptona de Proteose #3&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF-122-17-4</td><td>para NYCIII G. vaginalis mídia de crescimento</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de dupla borda revestida com PTFE</td><td>Ems</td><td>72000</td><td>bexigas de corte para SEM</td></tr><tr><td>Shandon Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>cytospun urinálise</td></tr><tr><td>Shandon cytospun filtro de funil de citofunil</td><td>Simport</td><td>M965FWDV</td><td>cytospun urinálise</td></tr><tr><td>Shandon Double cytofunnel</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>citospun urinálise</td></tr><tr><td>Shandon duplo cytoslides (revestido)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>citospun urinálise</td></tr><tr><td>trihidratado de cálcio de sódio</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ espectrofotômetro de fixação da bexiga</td></tr><tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td> medindo a estreptomicina <td>bacteriana OD600</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>adicionar a G. vaginalis NYCIII placas seletivas (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>seringa de ponta deslizante de tuberculina</td><td>BD</td><td>309659</td><td>para cateteres</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>para meios de crescimento NYCIII G. vaginalis</td></tr></tbody></table>

infecção recorrente do trato urinário de escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Infecções recorrentes do trato urinário (rUTI) causadas pela Escherichia coli uropatgênica (UPEC) são comuns e caras. Artigos anteriores descrevendo modelos de UTI em camundongos machos e femininos ilustraram os procedimentos para inoculação bacteriana e enumeração na urina e tecidos. Durante uma infecção inicial da bexiga em camundongos C57BL/6, a UPEC estabelece reservatórios latentes dentro de células epiteliais da bexiga que persistem após a liberação da bacteriúria UPEC. Este modelo baseia-se nesses estudos para examinar o rUTI causado pelo surgimento da UPEC dentro de reservatórios latentes de bexiga. A bactéria urogenital Gardnerella vaginalis é usada como gatilho do rUTI neste modelo porque está frequentemente presente nos tratos urogenitais das mulheres, especialmente no contexto da disbiose vaginal que tem sido associada à UTI. Além disso, também é descrito um método de fixação in situ da bexiga seguido de análise de microscopia eletrônica (SEM) de escaneamento do tecido da bexiga, com potencial aplicação a outros estudos envolvendo a bexiga.

Após a inoculação, os títulos UPEC são detectáveis na urina (Figura 2B). A não colocação de amostras de urina em meios seletivos contendo kanamicina provavelmente resultará em crescimento excessivo de microbiota de camundongos endógenos contaminando a urina. O nível de bacteriúria upec provavelmente será alto no dia 1 e pode aumentar durante a primeira semana antes de diminuir em momentos posteriores (Figura 2C). Aproximadamente 65-80% dos camundongos não terão UPEC detectável na urina por 28 dpi (Figura 2C, círculo verde). Estes camundongos podem ser usados nas etapas subsequentes do modelo. Os camundongos que permanecem bacteriúricos (Figura 2C, elipse vermelha) devem ser eliminados do experimento.
Duas exposições sequenciais de G. vaginalis dadas a 12 h (Figura 3A) ou 1 wk de distância (Figura 3B) resultam no surgimento da UPEC de reservatórios intracelulares para causar bacteriurias recorrentes. Tanto o nível de bacteriúria UPEC (teste mann-whitney) quanto a fração de camundongos que exibem upec rUTI (teste exato de Fisher) são significativamente mais elevados em camundongos expostos a G. vaginalis em comparação com o grupo controle pbs. A análise de citologia urinária detecta PMNs na urina de camundongos expostos a G. vaginalis que apresentaram emergência UPEC (Figura 3C). No modelo com duas exposições dadas a 1 wk de distância, os UPEC no tecido da bexiga são menores em camundongos expostos a G. vaginalis em comparação com a PBS (Figura 3D), presumivelmente devido ao surgimento da UPEC dos reservatórios e posterior desembaraço.
A visualização do tecido da bexiga in situ-fixo pela SEM revela grandes células urtelial superficiais que revestem a superfície da bexiga em camundongos de controle expostos apenas à PBS (Figura 4A). A esfoliação urotelial é evidenciada pela perda de células superfênricas do guarda-chuva, revelando células epiteliais transitórias menores subjacentes em camundongos expostos a G. vaginalis (Figura 4B). Logo após a inoculação da UPEC durante o estabelecimento de reservatórios intracelulares, a UPEC é visível no urotélio e filamentos de células esfoliantes (Figura 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figura 2. Monitoramento de tetas UPEC na urina durante a Fase 1 (formação do reservatório). (A) Esquema de revestimento de unidades formadoras de colônias (UFC). (B) Imagem representativa dos títulos UPEC na urina em LB+kanamycin. Círculos negros indicam manchas de amostra de urina que devem ser contadas para calcular CFU/mL. (C) Curso de tempo de bacteriúria UPEC em camundongos C57BL/6. Cada linha representa um mouse individual, traçando os títulos de urina UPEC ao longo do tempo. A linha pontilhada indica o limite de detecção (1000 UFC/mL). A elipse vermelha indica quatro camundongos (de 20) que não conseguiram resolver a bacteriúria upec e, portanto, não seriam usados para o modelo rUTI induzido por vaginalis. Por outro lado, o círculo verde indica camundongos que resolveram bacteriúrias UPEC e passaram para fases subsequentes. (D) Tabela de dados utilizados para gerar gráfico no painel C. CFU amarela e detectável; verde, sem CFU. (E) Randomização de camundongos em grupos de exposição com base no ponto de tempo em que a UFC UPEC não foi mais detectada na urina ("Dia resolvido"). Os números do mouse na coluna esquerda do painel D são os mesmos números do mouse dados no painel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figura 3. G. vaginalis aciona UPEC rUTI. Upec titers na urina após duas exposições sequenciais do trato urinário para PBS (círculos) ou G. vaginalis (Gvag; quadrados) dado 12 h (A) ou 1 wk (B) de distância. Cada símbolo representa um rato individual. A UPEC de CFU/mL mais alta detectada de cada mouse entre 1-3 d após a segunda exposição são plotadas. Camundongos sem bacteriúria detectável são plotados no limite de detecção (linha pontilhada). (C) Análise de citologia urinária mostrando células UPEC (pontas de flecha) e polimorfonuclear (PMN) (setas). Barra de escala = 20 μm. (D) Os UPEC nos tecidos da bexiga coletados 3 d após duas exposições sequenciais do trato urinário dado 1 wk de distância. Cada símbolo representa um mouse diferente e zeros são plotados no limite de detecção (linha pontilhada). Em A, B e D, as caixas estão no primeiro e terceiro quartil com a mediana marcada e os bigodes de min a max. Mann-Whitney U testes * P &lt; 0,05; ** P &lt; 0,01; P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figura 4. Análise SEM de bexigas fixadas in situ. As bexigas foram coletadas em camundongos 3h após duas exposições (12 h de distância) a PBS (A) ou G. vaginalis (C). Linhas pontilhadas ilustram uma única célula epitelial urinária, que é menor em bexigas expostas por G. vaginalis porque as grandes células superficiais esfoliaram revelando o epitélio transitório subjacente. (B) A bexiga coletada 6h após a inoculação inicial com UPEC, durante a Fase 1 do modelo, mostrando esfoliação urotelial e UPEC extracelular. (D) Exemplo de gotículas de gordura insolúveis presentes na superfície da bexiga. As barras de escala são de 20 μm nas imagens principais e 2 μm no inset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um modelo de camundongos de uropatogenic E. coli (UPEC) inoculação transuretral para estabelecer reservatórios de bexiga intracelular latente e subsequente exposição à bexiga a G. vaginalis para induzir a UTI UPEC recorrente é demonstrado. Também são demonstradas a enumeração de bactérias, citologia urinária, e fixação e processamento in situ bexiga para a varredura de microscopia eletrônica.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Infecções recorrentes do trato urinário são um sério problema de saúde. Este protocolo nos ajudará a entender como exposições de curta duração a bactérias urogenitais resultam em danos à bexiga e desencadeiam ITU recorrente de E.Coli. Uma vantagem desse modelo é que a esfoliação da bexiga e a ITU recorrente são desencadeadas pela bactéria urogenital Gardnerella vaginalis, que geralmente é abundante em mulheres que apresentam ITU recorrente.Comece alternando a cepa G.vaginalis de um freezer de 80 graus Celsius negativos para uma câmara anaeróbica. Listre as bactérias em um prato NYCIII sem antibióticos. Incubar a placa a 37 graus Celsius anaerobicamente durante 24 horas.Na câmara anaeróbica, inocular cinco mililitros de meio anaeróbico NYCIII com uma alça de um microlitro cheia de células da placa NYCIII e incubar a cultura estaticamente a 37 graus Celsius em condições anaeróbicas por 18 horas. Não inclua antibióticos no meio de cultivo. Determinar o OD600 da cultura utilizando um espectrofotómetro.Em seguida, centrifugue a 9.600 vezes G por um minuto e aspire o meio. Ressuspenda o pellet bacteriano em PBS até a concentração desejada e dilua e plaquee o inóculo em série. Adicione 10 microlitros de urina a 90 microlitros de PBS em um cassete de citofunil com um filtro acoplado.Colocar os na citocentrífuga com uma lâmina e centrifugá-los a 600 a 800 vezes G durante seis minutos com elevada aceleração. Depois de remover as lâminas e deixá-las secar durante a noite, corar as lâminas com um kit de coloração hematológica e analisá-las por microscopia de luz quanto à presença de PMNs e células epiteliais. Uma vez que a seringa de ponta deslizante de tuberculina com fixador, fixe um cateter na extremidade, chanfro voltado para o lado oposto às marcações da seringa.Corte o excesso de tubo de um a dois milímetros da ponta da agulha, tomando cuidado para não expor a ponta da agulha. Agite a seringa para remover as bolhas e empurre o êmbolo para esvaziar o ar. Em seguida, encha o cateter com fixador sobre um tubo de microcentrífuga Depois de anestesiar e sacrificar o camundongo, uma vez que as pernas estejam presas, abra a área pélvica do camundongo com uma pinça e uma tesoura cirúrgica para expor a bexiga.Empurre cuidadosamente a gordura adjacente, mas deixe a bexiga no lugar. Segure a seringa com a mão dominante com a agulha apontando para baixo. Mergulhe a ponta do cateter em lubrificante estéril e posicione a ponta do cateter na abertura uretral, segurando o corpo da seringa em um ângulo de 30 a 45 graus sobre o corpo do mouse.Aplique pressão para baixo com um leve movimento no sentido horário e insira suavemente o cateter na uretra À medida que a ponta do cateter entra, dobre a seringa em direção à cauda do camundongo enquanto continua a deslizar o cateter ainda mais para dentro da uretra até que o corpo da seringa fique paralelo à superfície de trabalho. Toda a haste da agulha do cateter deve entrar no mouse, posicionando a ponta do cateter dentro do lúmen da bexiga. Entregue lentamente 50 a 80 microlitros de fixador, fazendo com que a bexiga infle como um balão.Mantenha o cateter no lugar e levante ligeiramente a seringa, inclinando a ponta para cima. Com a outra mão, abra um hemostático e deslize um pino sob a agulha do cateter na interseção da uretra. Feche parcialmente o hemostático até que ele entre em contato com a agulha.Deslize suavemente a agulha do cateter para fora da bexiga enquanto aperta e trava completamente o hemostático para evitar a perda do fixador. Segure o hemostático de forma que fique paralelo à superfície de trabalho com a bexiga apoiada no topo. Levante suavemente e corte cuidadosamente sob o hemostático para remover a bexiga com o hemostático ainda conectado.Coloque a bexiga e o hemostático conectado em um tubo Falcon contendo fixador aquecido. Certifique-se de que a bexiga esteja totalmente submersa no fluido e não pressionada contra as paredes do tubo. Para obter imagens da bexiga por microscopia eletrônica de varredura, bissetriz sagitalmente com uma lâmina de barbear ou bisturi limpo de dupla face e faça um segundo corte tangencial ao hemostático para liberar a bexiga.Isso resulta em duas xícaras de meia bexiga. Se houver alguma almofada de gordura restante na parte externa da bexiga, remova-a com cuidado. Enxágue as metades da bexiga três vezes em tampão de cacodilato de sódio.Manchar o tecido com tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato 0,15 molar por uma hora em temperatura ambiente. Execute esta etapa com o recipiente de coloração embrulhado em papel alumínio para manter um ambiente escuro. Após a coloração, enxágue as metades da bexiga três vezes em água ultrapura.Se o óleo osmicado for visto na superfície da água, aspire-o ou absorva-o para evitar contaminação durante as etapas de secagem. Depois de desidratar o tecido, bisesct as metades da bexiga com uma lâmina limpa de dupla face para gerar quatro peças no total. Após a inoculação, os títulos de UPEC são detectáveis na urina.O nível de bacteriúria UPEC é alto no primeiro dia e pode aumentar durante a primeira semana antes de diminuir em momentos posteriores. Aproximadamente 65 a 80% dos camundongos não terão UPEC detectável na urina até 28 dias após a inoculação. Esses mouses podem ser usados nas etapas subsequentes do modelo.Os camundongos que permanecem bacteriúricos devem ser eliminados do experimento. Duas exposições sequenciais a G. vaginalis, administradas com 12 horas ou uma semana de intervalo, resultam no surgimento de UPEC de reservatórios intracelulares para causar bacteriúria recorrente. A análise citológica da urina pode ser usada para detectar células polimorfonucleares na urina de camundongos expostos a G.Vaginalis com emergência de UPEC exibida.No modelo com duas exposições administradas com uma semana de intervalo, os títulos de UPEC no tecido da bexiga são mais baixos em camundongos expostos a G. vaginalis em comparação com PBS, presumivelmente devido ao surgimento de UPEC de reservatórios e subsequente depuração. A visualização do tecido da bexiga fixa in situ por MEV revela células uroteliais grandes e superficiais que revestem a superfície da bexiga em camundongos controle expostos apenas ao PBS. A esfoliação urotelial é evidenciada por uma perda de células guarda-chuva superficiais, revelando um epitélio transicional subjacente menor em camundongos expostos a G. vaginalis.Logo após a inoculação com UPEC, durante o estabelecimento de reservatórios intracelulares, as células bacterianas são visíveis no urotélio e se filamentam das células esfoliantes. Os métodos descritos aqui abrem caminho para estudos futuros para investigar o efeito de cepas adicionais de Gardnerella ou outras espécies urogenitais na E.coli rUTI.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Indução transuretral de rato infecção urinária

Fonte: O'Brien, V. P., et. al., Infecção Urinária Recorrente de Escherichia coli Desencadeada pela Exposição à Bexiga Vaginalis por Gardnerella vaginalis em Camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o uso da microscopia eletrônica de varredura para visualizar a colonização bacteriana e as interações hospedeiro-patógeno no epitélio urinário de um modelo de camundongo pré-infectado.

Preparação de Tecido da Bexiga de Camundongo para Visualização de Infecção Bacteriana

Fonte: O'Brien, V.P. et al. Infecção urinária recorrente de Escherichia coli desencadeada pela exposição à bexiga de Gardnerella vaginalis em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a preparação de um inóculo de Gardnerella vaginalis para estabelecer um modelo murino de infecção urinária recorrente.

Preparação do inóculo de Gardnerella vaginalis para modelar infecções urinárias recorrentes em camundongos

Fonte: Conover, M. S., et al., J. Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um modelo de camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para montar e implantar um cateter transuretral em uma camundonga, seguido pela inoculação bacteriana para estabelecer infecção urinária associada ao cateter e investigar interações hospedeiro-patógeno mediadas por biofilme.

Infecção do Trato Urinário Associada a Cateter em um Modelo de Camundongo

Fonte: Conover, M. S. et al., Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um Modelo de Camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) em tecido bexiga de camundongos infectados com Escherichia coli que expressa β-galactosidase. Após fixação tecidual, permeabilização e coloração com X-gal, os IBCs aparecem como pontos azuis sob um microscópio dissecante, confirmando a invasão bacteriana durante infecção urinária.

Visualizando Comunidades Bacterianas Intracelulares em uma Bexiga de Camundongo Infectada

Neste vídeo, descrevemos a técnica de administração intravesical de bactérias uropatogênicas para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos. Este modelo pode ser usado para entender a disseminação da infecção bacteriana uropatogênica no sistema urinário e os mecanismos que determinam a suscetibilidade à ITU.

Modelo de Geração de Infecção do Trato Urinário: Uma Técnica para Administrar Bactérias Uropatogênicas em Camundongos para Desenvolver Modelo de Infecção do Trato Urinário

Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção uropatogênica por Escherichia coli em uma bexiga de camundongo fêmea por meio de instilação de cateter transuretral. As bactérias injetadas estabelecem com sucesso uma infecção do trato urinário dentro da bexiga, fornecendo uma plataforma valiosa para estudar doenças associadas à saúde relacionadas ao trato urinário.

Cateterismo transuretral e inoculação bacteriana para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos machos

Estabelecimento de um Modelo de Infecção do Trato Urinário em Camundongos Fêmeas

A capacidade de modelar infecções do trato urinário (ITU) é crucial para poder entender a patogênese bacteriana e gerar o desenvolvimento de novas terapêuticas. O objetivo deste trabalho é demonstrar modelos de camundongos de ITU experimental e ITU associada a cateter que recapitulam e predizem achados observados em humanos.

Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

Aprenda a investigar infecções urinárias recorrentes causadas por E. coli usando um modelo de camundongo. Este método demonstra como Gardnerella vaginalis desencadeia a emergência de UPEC a partir de reservatórios intracelulares na bexiga.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

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