Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

Olá, e bem-vindos à arquitetura laboratorial e reatividade do RNA no Instituto de Biologia Molecular e Celular em Estrasburgo. Cultivar cristais bem desfracting é um passo crítico em qualquer estudo cristalográfico. Neste vídeo, demonstraremos o uso de uma nova ferramenta microfluida para cultivar cristais de uma biomolécula e determinar sua estrutura 3D por difração de raios-X in situ.

O dispositivo microfluido chamado ChipX apresenta várias vantagens. Ele foi projetado para miniaturizar e facilitar os ativos de cristalização pelo método de contra-difusão. Sua configuração é fácil e realizada com material de laboratório padrão.

Também é otimizado para a caracterização direta de cristais cultivados no chip por cristalografia de raios-X em série. ChipX elimina o manuseio de cristais e passos de resfriamento criogênico e preserva a qualidade intrínseca dos cristais que são analisados in situ e à temperatura ambiente. ChipX tem o formato de um slide de microscópio, 7,5 por 2,5 centímetros.

Contém oito canais microfluidos usados como câmaras de cristalização com uma seção de 80 por 18 micrômetros e um comprimento de quatro centímetros. A entrada do lado esquerdo permite a injeção manual da solução biomolécula que encherá os oito canais até os reservatórios. As soluções de cristalização são depositadas nesses reservatórios do lado direito.

A cristalização é desencadeada por um fenômeno chamado contra difusão. Quando o agente cristalizador se difunde na solução biomolécula e cria uma concentração e um gradiente de super saturação. Rótulos e bost ao longo dos canais ajudam a localizar os cristais com mais facilidade.

A configuração de um chip requer de cinco a seis microlitradores de solução biomolécula em uma concentração típica de cinco a 10 miligramas por mililitro. Um óleo de parafina de microlitro, cinco microliters de solução de cristalização por reservatório e fita adesiva. O carregamento do ChipX é realizado manualmente com uma micropipette e pontas padrão.

Uma solução de amostra azul é usada neste exemplo para uma melhor visualização do processo de injeção. Para evitar vazamentos, a ponta é inserida na entrada da amostra perpendicularmente ao chip. Um microliter de óleo de parafina é carregado após a amostra para separar os canais um do outro.

A entrada da amostra é então selada com fita adesiva. Os oito reservatórios são carregados individualmente com cinco microliters de solução de agente cristalizador. Para isso, a ponta da pipeta é colocada perto do final do canal em um ângulo de cerca de 45 graus.

Isso impede a formação de uma bolha de ar entre a amostra e o agente cristalizador. Os reservatórios podem ser preenchidos com coquetéis contendo vários tampões, polímeros ou sais, etc. para triagem ou otimização. Os reservatórios estão selados com fita adesiva.

Como demonstrado aqui, configurar um chip é fácil e leva apenas alguns minutos. No ChipX, a cristalização ocorre por contra-difusão. Agentes cristalizadores depositados nos reservatórios difundem nos canais que contêm a biomolécula.

Isso cria gradientes de concentração e de super saturação que desencadearão a cristalização. Estes são exemplos de cristais de uma enzima obtida dentro dos canais. Eles podem crescer para preencher os canais que têm uma seção transversal de 80 por 80 micrômetros.

Cristais são facilmente detectáveis no ChipX por microscopia de fluorescência usando a fluorescência natural de resíduos de triptofano sob luz UV, ou como mostrado aqui usando uma proteína fluorescentemente rotulada. Esta seção mostra uma análise telegráfica de Chris realizada na fonte de luz suíça em filaggrins Suíça. Os chips podem ser transportados para o síncrotron sem qualquer equipamento adicional ou cuidados especiais.

Vamos entrar no corredor da fonte de luz suíça. Elétrons circulam no anel central e geram um amplo espectro de ondas eletromagnéticas, incluindo raios-x explorados em diferentes linhas de raios. Este vídeo foi gravado em X06, que é uma linha de feixe dedicada à cristalografia macro-molecular.

O protocolo pode mudar de uma instalação síncrotron para outra, mas o princípio geral permanece o mesmo. ChipX é montado em um suporte impresso em 3D. Este suporte é então anexado ao ímã de um goniômetro padrão.

A análise serial consistente coletando dados de uma série de cristais cultivados no chip. Listas de posições de cristal são estabelecidas usando as etiquetas e bost ao longo dos canais de chip. Pesquisadores movem o chip para centralizar os cristais no raio-x simbolizado pela janela amarela.

Um procedimento de centralamento rápido usando o raio-x é iniciado. A parada do feixe sobe no lugar e o detector se move em direção à amostra. A triagem da grade é realizada para garantir que o cristal esteja alinhado com a viga.

O mesmo procedimento é repetido após a rotação do chip em 30 graus. O segundo passo é importante porque o material do chip cria um efeito paralaxe que leva a uma mudança do máximo de difração em relação à posição de cristal observada. Assim que o cristal estiver centrado no feixe, a coleta de dados começa.

Esta sequência mostra a coleta de dados em tempo real. O chip gira 30 graus. Enquanto isso, as imagens correspondentes de difração são coletadas pelo detector.

A caracterização deste cristal está completa. O chip traduzido para o próximo cristal no canal e todo o procedimento é repetido. Observe que esta análise é operada in situ sem manuseio direto do cristal e à temperatura ambiente.

Os dados coletados em uma série de cristais são então mesclados para obter um conjunto de dados de difração completa que é usado para calcular um mapa de densidade de elétrons, mostrado em azul, e para construir o modelo atômico. O procedimento descrito neste vídeo foi aplicado no quadro da caracterização estrutural da enzima de modificação tRNA. A enzima de adição de CCA da bactéria adaptada a frio, Planococcus halocryophilus.

ChipX foi usado para cristalizar a enzima por contra-difusão na presença de sulfeto de amônio como um agente cristalizador. Cristais piramidais apareceram ao longo dos canais, após alguns dias de incubação a 20 graus Celsius. A rotulagem fluorescente da proteína facilitou a identificação de cristais proteicos e sua discriminação por cristais de sal.

Uma série de cristais foi analisada in situ e em temperatura ambiente. Seus dados de difração foram mesclados e levaram à estrutura cristalina da enzima APOE em uma resolução de 2,5 angstrom. Além disso, o difuso ambiente nos canais de chips foi explorado para entregar um substrato à enzima que constrói os cristais.

No presente caso, foi adicionado um analógico CTP às soluções do reservatório dois dias antes da análise síncrotron. Isso permitiu que o composto se difundisse e alcançasse o local catalítico da enzima. Como visto na estrutura cristalina do complexo determinada em uma resolução de 2,3 angstrom.

O protocolo demonstrado neste vídeo é geralmente aplicável e foi testado em uma variedade de biomoléculas. Para concluir, o ChipX é uma ferramenta de chip lab que integra todas as etapas de um estudo cristalográfico e permite que você vá da solução biomédica para a estrutura cristalina em um dispositivo microfluido único. Obrigado por assistir este vídeo.

e esperamos ter convencido você dos benefícios de usar chipx para cristalizar e determinar a estrutura cristalina de seus favoritos pela Biomolecule.