Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Caracterizar uma estrutura proteica é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar uma estrutura proteica por espectro de massa, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica uma informação estrutural proteica em sua massa.

Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente a resolução de cadeias laterais de aminoácidos acessíveis. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de pirocarbonato de dietilo ou DEPC como um reagente de rotulagem covalente, juntamente com a detecção de especificações de massa.

O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso em conjunto com a especificação de massa para obter informações estruturais para muitas proteínas diferentes. Comece preparando uma solução tamponada de sua proteína de interesse em uma concentração na faixa de dezenas de micromolar.

Nós geralmente usamos um tampão de 10 mililitros pH 7.4 MOPS. Alternativamente, uma solução proteica existente pode ser a troca de buffer em MOPS ou outro buffer se a amostra original contiver um buffer que tenha grupos funcionais nucleofílicos. É necessário que o tampão não tenha grupos funcionais nucleofílicos porque eles vão interferir com a reação proteica DEPC.

Em um microtubo diferente, prepare uma solução de estoque de 100 mililitros DEPC em acetonitrilo seco. A preparação da solução de estoque em acetonitrila seca é necessária para evitar a hidrólise do DEPC. Em um novo microtubo, prepare a solução de um imidazol molar na água de grau HPLC.

Em um novo microtubo, misture a solução de tampão MOPS e proteínas. À proteína e ao tampão adicione uma alíquota da solução de estoque DEPC certificando-se de que está misturando corretamente antes de colocar a mistura de reação em um banho de água de 37 graus Celsius por um minuto. O volume da solução de estoque DEPC que é utilizada deve ser escolhido com base na razão final de concentração de proteína DEPC desejada.

Não há um conjunto de depc e concentrações proteicas que funcionarão com todas as proteínas, embora a concentração ideal de DEPC possa ser estimada com base no número de resíduos de histidina e liseina acessíveis de solvente presentes na proteína. Deve-se notar que o volume de acetonitrilo adicionado, que é efetivamente o volume da solução DEPC adicionado não deve exceder 1% do volume total de reação, a não ser para evitar perturbação da estrutura proteica durante a reação. O tempo de reação depende, em última análise, do usuário, embora uma reação de um minuto sob a condição de exemplo minimize a rotulagem da proteína e hidrólise do DEPC.

Depois de um minuto se passou, sacia a reação adicionando o imidazol para resmemar o restante no DEPC reagido. Certificando-se de que a concentração final de imidazol é 50 vezes a concentração de DEPC. Para identificar os resíduos que foram modificados pelo DEPC, a proteína deve ser digerida proteolítico em fragmentos de peptídeos.

Para a digestão, escolha condições que sejam favoráveis à proteína de interesse. As etapas comuns descritas aqui envolvem o desdobramento da proteína e, em seguida, a redução e alquilação de ligações de dissulfeto para que a eficiência de digestão possa ser melhorada. Em nossa experiência, o desdobramento da proteína com um denaturante e calor antes da digestão melhora a eficiência da digestão.

Enquanto a proteína está sendo desdobrada, compare soluções de TCEP e iodoacetamida em um buffer de digestão apropriado. O TCEP deve ser usado como agente redutor em vez de dithiothreitol ou DTT porque o DTT pode reagir com resíduos modificados de DEPC. A alquilação dos arquivos resultantes após a redução é essencial para evitar a rotulagem em que arquivos livres e a proteína reagem com aminoácidos modificados.

Uma vez terminado o passo de desdobramento, reduza as ligações de dissulfeto adicionando TCEP à mistura de reação e deixe-o reagir por três minutos à temperatura ambiente. Após a redução, adicione iodoacetamida à mistura de reação, deixe-a reagir por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Conseguido aqui colocando a mistura de reação em uma caixa.

A concentração final de iodoacetamida deve ser o dobro da concentração utilizada para TCEP ou 80 vezes a concentração proteica ou ligação de dissulfeto. Prepare a enzima de interesse, geralmente trippsina ou chymotrypsina de acordo com as especificações do fabricante. Depois de preparar a enzima escolhida, comece a digestão e incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius.

Uma relação proteína 10:1 para enzima com uma digestão de três horas usando enzimas imobilizadas é tipicamente uma boa escolha para proteínas rotuladas DEPC. Após a digestão, a amostra deve ser imediatamente analisada por LC-MS/MS ou flash congelado com nitrogênio líquido para minimizar a degradação da amostra e perda de rótulos. Os parâmetros padrão LC-MS/MS para proteômica de baixo para cima podem ser usados para identificar locais rotulados nos fragmentos de peptídeos protelíticos.

A fase inversa C18 deve ser usada para alcançar a melhor separação dos peptídeos. Em nossa experiência, a LC capilar fornece informações quantitativas mais confiáveis sobre os níveis de modificação do que a nano LC devido às maiores quantidades de amostra utilizadas. Uma fase móvel típica da LC que é usada para separar peptídeos rotulados de DEPC é composta por dois solventes.

Solvente A é água com ácido fórmico de 0,1% e solvente B é um acetonitrilo com ácido fórmico de 0,1%. É utilizada uma elução gradiente e o tempo de separação pode ser otimizado com base na complexidade da amostra. Um espectrômetro de massa capaz de fazer LC-MS e MS/MS on-line é necessário para identificar sites de modificação DEPC nos peptídeos.

Em nossos experimentos, usamos com sucesso vários tipos de espectrômetros de massa. Descobrimos que uma Thermo Orbitrap Fusion fornece excelentes resultados, embora qualquer espectrômetro de massa capaz de realizar automaticamente MS/MS de muitos peptídeos durante uma análise LC-MS deve ser adequado. As condições do HPLC e os parâmetros espectrométricos de massa devem ser definidos adequadamente antes da medição.

Se a amostra foi congelada, deve ser descongelada antes da análise. Tente o seu melhor para minimizar o tempo entre a preparação da amostra e a injeção de HPLC. Carregue e injete a amostra de proteína rotulada digerida no sistema LC e inicie a aquisição do LC-MS/MS ou a identificação do local do rótulo DEPC e a quantificação da área de pico, existem vários métodos.

Em instrumentos Thermo Fisher, excalibur ou descobridor proteome talvez usado. Defina parâmetros apropriados para identificação de peptídeos em um programa. A adição de DEPC e carbamidometilação são incluídas como modificações variáveis auxiliando resíduos ou alocados.

Áreas de pico cromatográficas de versões modificadas e não modificadas dos peptídeos são usadas para determinar percentagens de modificação do nível de resíduo. A rotulagem DEPC com detecção de MS também é uma ferramenta valiosa para caracterizar mudanças estruturais de ordem superior às proteínas. A partir do nosso estudo, a rotulagem covalente do DEPC pode identificar regiões proteicas específicas que sofrem alterações estruturais após o estresse térmico e oxidativo.

Na figura, mudanças significativas nos percentuais de modificação são mostradas em azul para a diminuição da rotulagem e vermelho para o aumento da rotulagem, enquanto resíduos sem alterações significativas de rotulagem são mostrados em verde pálido. Por exemplo, após a microglobulina beta-2 ser exposta ao estresse térmico, muitos resíduos que sofrem quedas significativas nas extensões de rotulagem, N-terminus, serina 28, histidina 31, serina 33, serina 55, serina 57, e lysina 58 estão mais próximas de um lado da proteína sugerindo que esta região da proteína sofre uma mudança confirmacional ou possivelmente mediações de agregação. Após a proteína ser exposta ao estresse oxidativo, diferentes resíduos com diminuição na rotulagem, serina 11, histidina 13, lysina 19, lise 41 e lise 94 de um aglomerado em outra fase da proteína indicando que a oxidação induzida a alteração confirmacional ocorre em outros lugares.

Este estudo tem implicações importantes para a terapêutica proteica, que atualmente é o segmento que mais cresce no mercado farmacêutico. Outros trabalhos do nosso grupo também mostraram que a especificação de massa de rotulagem covalente do DEPC pode detectar e identificar locais de alterações confirmacionais na terapêutica de anticorpos monoclonais estressados. Como você pode ver, a rotulagem covalente com DEPC é simples de implementar experimentalmente, mas pode fornecer informações estruturais valiosas para proteínas.

A resolução estrutural fornecida pela especificação de massa de rotulagem DEPC é modesta quando comparada com as técnicas como cristalografia de raios-X e RMN, mas é aceitável para quase qualquer proteína, independentemente de seu tamanho ou capacidade de ser cristalizado. A especificação de massa de rotulagem covalente DEPC também trabalha com misturas proteicas e pode trabalhar com tipos de amostras muito complicadas, como o lise celular e as células haCat. Depois de assistir a este vídeo, estamos confiantes de que você encontrará a rotulagem DEPC como uma ferramenta útil para caracterizar a estrutura proteica.