Name: Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a analisar diferenciação e maturação de células precursoras de oligodendrócitos derivadas de células-tronco neurais usando triagem de alto conteúdo. Este método computacional permite modelar mielinização e triagem de fármacos.

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Apoiado pelo PROJETO DE CLUSTERS Nacionais de Tecnologia MIUR IRMI (CTN01_00177_888744) e Região Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Agradecimentos especiais à Fundação IRET por sediar o trabalho experimental.

Todos os protocolos de animais aqui descritos foram realizados de acordo com as Diretivas do Conselho Comunitário Europeu (86/609/CEE) e cumprem as diretrizes publicadas no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Soluções e reagentes
<ol><li>Preparar o meio padrão: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; HEPES de 8 mmol/L; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.</li>
	<li>Prepare o meio da neurosfera: adicione 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL EGF para médio padrão.</li>
	<li>Preparar oligosfera/meio OPC: adicionar 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA para médio padrão.</li>
	<li>Prepare o meio de diferenciação oligodendroctye: adicione 50 nM T3; 10 ng/mL CNTF; 1x N-acetil-L-cisteína (NAC) para médio padrão.</li>
	<li>Prepare o tampão de dissociação não enzimático: adicione 1% P/S ao tampão de dissociação não enzimático e mantenha o gelo frio.</li>
	<li>Prepare a solução de sacarose: HBSS, 0,3 g/mL de sacarose.</li>
	<li>Prepare a solução de lavagem BSA: EBSS, 40 mg/mL BSA, 0,02 mL/l HEPES.</li>
	<li>Prepare tampão de dissociação enzimática: HBSS, 5,4 mg/mL D-glicose, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/mL Trypsin, 0,7 mg/mL Hyaluronidase, 80 U/mL DNase.</li>
	<li>Prepare a mistura de citocinas: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 e IFN-γ (20 ng/mL cada).</li>
	<li>Prepare o veículo mix de citocinas: 0,04% do estoque (10% glicerol/100 nM de glycina/25 nM Tris, pH 7.3).</li>
	<li>Prepare o meio de privação oxigênio-glicose: meio padrão usando glicose DMEM w/o. Dependendo da stringency da condição de privação de glicose desejada, é possível remover também B27 e/ou N2 do meio para evitar compostos relacionados à glicose (por exemplo, D-Galactose em B27).</li>
</ol>2. Dissecção e isolamento do NSC
NOTA: Os NSCs fetais e adultos foram isolados do cérebro fetal E13,5 ou da zona sub-ventricular adulta (SVZ), seguindo o protocolo Ahlenius e Kokaia9 com modificações.
<ol><li>Culturas fetais do NSC NOTA: Antes de iniciar as dissecções, prepare tubos de 1,5 mL contendo 150 μL de tampão de dissociação não enzimática cada um; limpar pratos de Petri e adicionar HBSS gelado.<ol>
<li>Colete os embriões em E13.5 - 14.5 de camundongos grávidas cronometradas e coloque em uma placa de Petri contendo HBSS frio.</li>
		<li>Decapitar os embriões usando fórceps.</li>
		<li>Coloque as cabeças dos embriões em uma placa de Petri limpa contendo PBS gelada e remova a pele do crânio com fórceps, usando lupas ou um estereoscópio.</li>
		<li>Uma vez que o cérebro é visível e limpo da pele, esprema-o aplicando pressão nos lados com fórceps.</li>
		<li>Retire o cerebelo, mantenha apenas o cérebro e remova as meninges com fórceps.</li>
		<li>Coloque o tecido isolado no tampão de dissociação não enzimática e repita as etapas de dissecção com os outros embriões. Insira o tecido de 2 a 3 animais em cada tubo contendo o tampão.</li>
		<li>Incubar a 37 °C por 15 min sob agitação contínua.</li>
		<li>Após a incubação, adicione 850 μL de médio padrão e misture por pipetação até que a suspensão esteja livre de aglomerados.</li>
		<li>Se o tecido não dissociado ainda estiver visível, espere por 2 min no RT até que ele se deposite na parte inferior do tubo.</li>
		<li>Quando a dissociação estiver completa, conte as células e as emplaque em suspensão a uma densidade de 10-50 células/μL em um frasco T-25 ou T-45 contendo 10-30 mL de neurosfera, mantido em posição vertical para evitar a adesão celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Culturas de NSC adultos
	<ol>
<li>Sacrificar animais por luxação cervical.</li>
		<li>Colete cérebros de 4 a 5 ratos em um tubo de 50 mL contendo HBSS gelado.</li>
		<li>Coloque o cérebro em uma superfície fria e estéril. Para isso, use um frasco T-25 cheio de água e colocado a -20 °C durante a noite. No momento do experimento, cubra o frasco com papel alumínio estéril.</li>
		<li>Coloque o lado ventral do cérebro para baixo, na direção rostro-caudal, e remova as lâmpadas olfativas usando uma lâmina de barbear.</li>
		<li>Usando uma lâmina de barbear, corte 2-3 fatias coronais de 1 mm de espessura, do córtex ao quiasma óptico.</li>
		<li>Coloque as fatias na superfície fria em uma posição ventro-dorsal e identifique o corpus caloso e os dois ventrículos laterais.</li>
		<li>Usando lupas ou um estereoscópio, isole as paredes dos ventrículos laterais, tomando cuidado para não carregar pedaços do caloso corpus.</li>
		<li>Coloque o tecido isolado no tampão de dissociação enzimática (5-10 mL) e incubar a 37 °C por 15 min.</li>
		<li>Misture a solução, pipetando várias vezes (pelo menos 50), e incubar novamente a 37 °C por 10 min.</li>
		<li>Neutralizar a trippsina adicionando 5 mL de meio de cultura padrão e filtrar a solução usando um filtro de 70 μm.</li>
		<li>Centrifugar a solução filtrada por 5 min a 400 x g.</li>
		<li>Resuspengem a pelota na solução de sacarose e centrífuga por 10 min a 500 x g.</li>
		<li>Resuspenha a pelota na solução de lavagem BSA e centrífuga por 7 min a 400 x g.</li>
		<li>Resuspend a pelota no meio de cultura padrão, conte as células e realize o revestimento conforme descrito acima (na etapa 2.1.10).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Neuroesferas primárias
<ol><li>Adicione os fatores de crescimento (bFGF/EGF) a cada 2 dias.</li>
	<li>A cada 4 a 6 dias (dependendo da densidade celular), troque metade do meio da seguinte forma:<ol>
<li>Transfira toda a suspensão celular para um tubo de 15 ou 50 mL.</li>
		<li>Centrifugar por 5 min a 400 x g.</li>
		<li>Remova metade do volume.</li>
		<li>Adicione a mesma quantidade de meio fresco, misture suavemente por pipetação e adicione fatores de crescimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Oligosferas
NOTA: A diferenciação de oligodendrocito é realizada seguindo o protocolo Chen10 com modificações.
<ol><li>Quando as neurosferas atingem um diâmetro de 100-150 μm, elas estão prontas para serem aprovadas. Para isso, transfira toda a suspensão celular para um tubo de 15 ou 50 mL, e centrífuga por 5 min a 400 x g.<ol>
<li>Avalie rapidamente o diâmetro tirando fotos das esferas usando um microscópio de luz transmitida invertida e abrindo-as pelo software ImageJ.</li>
		<li>Clique no menu Analisar e na janela Ferramentas, selecione Barra de escala.</li>
		<li>Defina 150 μm como Largura em mícrons e compare a barra de escala com as esferas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova todo o volume por inversão e resuspense a pelota em 180 μL de meio de cultura padrão fresco. Pipeta 50 vezes para permitir a desagregação das esferas.</li>
	<li>Adicione 810 μL de meio de cultura padrão fresco, conte as células e reemplaque-as como descrito para as neurosferas.</li>
	<li>Adicionar bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL a cada 2 dias.</li>
	<li>A cada 4 a 6 dias (dependendo da densidade celular), troque metade do meio da seguinte forma:</li>
	<li>Transfira toda a suspensão celular para um tubo de 15 ou 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 400 x g.</li>
	<li>Remova metade do volume.</li>
	<li>Adicione a mesma quantidade de meio fresco, misture suavemente por pipetação e adicione fatores de crescimento.</li>
</ol>5. Revestimento de placas
<ol><li>Revestimento poly-D, L-ornithine/laminin: pelo menos 2 dias antes de emplacamento dos OPCs, adicione 50 μg/mL de poli-D, solução L-ornithine, diluída em PBS, para cada poço (40 μL/well para placas de 96 poços) e incubar na RT durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o líquido e lave três vezes com água estéril destilada.</li>
	<li>Deixe as placas secarem no RT durante a noite. No dia seguinte, adicione uma solução de laminina diluída em PBS (5 μg/mL; 40 μL/well para placas de 96 poços) e incubar por 2h a 37 °C.</li>
</ol>6. Semeadura celular
<ol><li>Quando as oligosferas atingem um diâmetro de 100-150 μm, elas estão prontas para serem dissociadas e semeadas nas placas revestidas de poli-D, L-ornithine/laminina. Para isso, transfira toda a suspensão celular para um tubo de 15 ou 50 mL, e centrífuga por 5 min a 400 x g (conforme indicado na etapa 4.1)</li>
	<li>Remova todo o volume por inversão e resuspense a pelota em 180 μL de meio de cultura padrão fresco. Pipeta 50 vezes para permitir a desagregação das esferas.</li>
	<li>Adicione 810 μL de meio de cultura padrão fresco e conte as células.</li>
	<li>Remova a solução de laminina dos poços e emplaque as células a 3.000 células/cm2 densidade (100 μL/bem para placas de 96 poços).</li>
</ol>7. Indução de diferenciação OPC
<ol><li>Após 3 dias, retire todo o meio e adicione o mesmo volume do meio de diferenciação de oligodendrocito.</li>
	<li>Troque metade do meio a cada 4 dias e adicione um novo mix de diferenciação (T3/CNTF/NAC) a cada 2 dias.</li>
</ol>8. Indução do bloco de diferenciação mediado por inflamação
<ol><li>Após a dissociação da neurosfera e a produção de oligosfera (seção 4), adicione a mistura de citocinas ao meio da cultura e mantenha as oligosferas expostas a citocinas para toda a etapa de formação das esferas. NOTA: O volume depende do número de células, uma vez que para as esferas que formam células são semeadas a 10-50 células/μL.</li>
	<li>Se o meio precisar ser alterado, altere todo o volume e adicione a mistura de citocina mais uma vez.</li>
</ol>9. Indução da morte celular de privação de oxigênio-glicose
<ol><li>Em -1 DIV (2 dias após a semeadura de células em placas multiwell), remova o meio e conserva-o em uma nova placa multiwell.</li>
	<li>Adicione metade do volume (50 μL para placas de 96 poços) de OGD-médio (grupo OGD) ou meio fresco (grupo de controle). A metade do volume é usada para reduzir a troca de oxigênio entre o líquido e o ar.</li>
	<li>Coloque as culturas do grupo OGD em uma câmara hermética de hipóxia saturada com 95% N2 e 5% de CO2. Para alcançar a saturação da câmara, deixe a mistura de gás fluir por 6 min a 25 l/min antes de fechar os tubos da câmara.</li>
	<li>Incubar a câmara hipóxica na incubadora por 3h. O grupo controle e as placas contendo o meio removido e conservado na etapa 9.1 também devem ser deixados na incubadora.</li>
	<li>Remova o grupo OGD livre de glicose ou o novo meio (grupo controle) e adicione o meio removido e conservado na etapa 9.1.</li>
</ol>10. Imunocytoquímica
<ol><li>No ponto de tempo desejado, fixar as células com paraformaldeído frio de 4% por 20 minutos na RT.</li>
	<li>Lave duas vezes com PBS (10 minutos de incubação para cada lavagem em RT).</li>
	<li>Incubar 1 h na RT com a solução de bloqueio (PBS Triton 0,3% contendo 1% BSA e 1% de burro/cabra normal.</li>
	<li>Incubar com mistura de anticorpos primários(Tabela 1),diluído em tritão PBS 0,3%, durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave duas vezes com PBS (10 minutos de incubação para cada lavagem em RT).</li>
	<li>Incubar com anticorpo secundário (Tabela 1) solução diluída em tritão PBS 0,3% adicionando Hoechst 33258 por 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Lave duas vezes com PBS (10 minutos de incubação para cada lavagem em RT).</li>
</ol>11. Análise do HCS sobre viabilidade celular, composição de linhagem e morte celular específica da linhagem
NOTA: As imagens representativas do HCS e o fluxo de trabalho são mostrados na Figura 2A,B.
<ol><li>Selecione o algoritmo de Análise Compartimental no menu principal do software (HCS Studio v 6.6.0) e selecione Digitalizar no menu principal Desenvolver ensaio/placa de varredura.</li>
	<li>Na janela iDev, selecione Nova e selecione Ferramenta de medição de intensidade geral do modelo Develop Assay.</li>
	<li>Clique em Criar no lado direito do menu, selecionando o objetivo de 10x.</li>
	<li>Isso abrirá o menu Configurar aquisição. Nesta janela, selecione os seguintes parâmetros: (a) número de canais: o primeiro para a coloração nuclear hoechst (BGRFR_386) e um para cada marcador específico de linhagem usado na reação (b) selecione o foco do software no canal 1 e o intervalo de foco automático como 1 (c) selecione o modelo de placa da lista.</li>
	<li>A partir do menu de aquisição, veja a qualidade da coloração em diferentes poços e diferentes campos e selecione manualmente o tempo de exposição selecionando o Tempo de Exposição Fixa no menu.</li>
	<li>Uma vez definidos os parâmetros de aquisição, selecione Mini Scan na parte superior do menu e selecione dez campos por poço em dois poços por condição experimental. Isso permitirá a configuração de todo o parâmetro de análise em um subconjunto de campos para toda a placa.</li>
	<li>Quando a mini varredura estiver concluída, clique no Parâmetro de ensaio configurar para configurar o algoritmo da análise.</li>
	<li>Clique em Configurar grupos no lado direito da janela e arrastar e soltar os poços do miniscan. Clique no botão Adicionar na subseção Grupos para configurar os diferentes grupos.</li>
	<li>Siga o fluxo de trabalho no lado esquerdo da janela passo a passo para desenvolver todo o algoritmo. Selecione primeiro Imagem de processo para cada canal e clique em Remoção de fundo e no nível desejado.</li>
	<li>Primeiro identificar e selecionar os núcleos por coloração nuclear. Clique em Identificar objeto primário – Canal 1 para selecionar os núcleos reais e evitar analisar artefatos e detritos. Para isso, amplie uma imagem representativa da coloração nuclear e verifique se os núcleos estão bem cercados pelo perímetro construído pelo software. É possível alterar o valor de limiar e aplicar algoritmos de segmentação para identificar melhor núcleos únicos.</li>
	<li>Uma vez que os núcleos sejam definidos corretamente, clique na seguinte etapa: Validar objeto primário. Selecione Object.BorderObject.Ch1 para evitar a análise de núcleos na borda de cada imagem de campo. Selecione Object.Area.Ch1 e, movendo as barras "baixas" e "altas" nos histogramas, remova todos os detritos identificados ou objetos grandes correspondentes a agregados ou artefatos.</li>
	<li>Verifique todas as imagens representativas da mini varredura de todas as condições experimentais para ter certeza de que os parâmetros selecionados se encaixam com todos eles.</li>
	<li>Clique em Identificar pontos para cada canal correspondente aos marcadores de linhagem específicos e selecione os valores do anel: Largura = 3 e Distância = 0. Isso permitirá a identificação da fluorescência citoplasmática. De acordo com a densidade celular, esses valores podem ser adaptados. O software evitará automaticamente a sobreposição entre anéis adjacentes.</li>
	<li>Selecione Níveis de referência no fluxo de trabalho para construir a análise. A definição dos níveis de referência permitirá a contagem automática de núcleos condensados, baseados no tamanho nuclear e intensidade de coloração nuclear, e de células específicas marcador-positivas, baseadas na fluorescência citoplasmática identificada pelo Anel.</li>
	<li>Primeiro clique em Object.Area.Ch1. Nas imagens mini scan, selecione um núcleo condensado e mova a barra "LOW" nos histogramas, a fim de selecionar como "condensado" todos os núcleos sob este tamanho.</li>
	<li>Clique em Object.AvgIntensity.Ch1. Nas imagens mini scan, selecione um núcleo condensado e mova a barra "ALTA" nos histogramas, a fim de selecionar como "condensado" todos os núcleos acima desta intensidade de fluorescência.</li>
	<li>Clique em Object.RingAvgIntensity para cada canal de marcadores específicos de linhagem. Selecione em suas mini imagens uma célula positiva e mova a barra "HIGH" nos histogramas, a fim de selecionar como "positivo" todas as células acima desta intensidade de fluorescência.</li>
	<li>Verifique todas as imagens representativas da mini varredura de todas as condições experimentais para ter certeza de que os parâmetros selecionados se encaixam com todos eles.</li>
	<li>No menu superior, selecione Caracterização populacional e selecione Subpopulação de Eventos.</li>
	<li>Como Evento tipo 1, selecione ObjectAreaCh1 na lista esquerda e clique no botão E > e, finalmente, selecione ObjectAvgIntensityCh1. Isso permitirá a identificação de núcleos condensados, como uma combinação de baixa área e alta intensidade.</li>
	<li>Na mesma janela, desmarque todos os limites de varredura.</li>
	<li>Clique em Selecionar recursos para armazenar no menu superior, para escolher os parâmetros para manter na análise.</li>
	<li>Selecione Recursos de poço e mova-se da lista à esquerda para a direita apenas os parâmetros desejados: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (Para cada canal dos marcadores de linha de linha específicos). NOTA: Esta análise dará como leitura o número total de células, a porcentagem de núcleos condensados e a porcentagem de células positivas específicas de linhagem para cada marcador analisado no número total da célula. Se a porcentagem das diferentes linhagens é necessária apenas em células vivas, é possível manter o valor "High_RingAvgIntensity" para o canal (número absoluto de células positivas) e recalcular a porcentagem no número total de células após a subtração da porcentagem de células mortas.<ol>
<li>Alternativamente, é possível remover as células mortas da análise estabelecendo os mesmos parâmetros utilizados para identificar núcleos condensados (etapas 11.14-11.15) sobre a validação dos núcleos (etapa 11.11).</li>
	</ol></li>
	<li>Selecione Digitalizar placa no menu principal e clique no símbolo da placa no subempreste de configuração de varredura na seção superior para identificar o poço a analisar.</li>
	<li>Escreva o nome do experimento e a descrição e, uma vez concluídas todas as configurações, pressione o símbolo de reprodução.</li>
</ol>

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<li>Bribián, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mouse+and+human+brain+OPCs%3A+relevance+for+preclinical+studies+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis.</a> Journal of Clinical Medicine. 9, 1681(2020).</li>
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<li>Baldassarro, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+pure-neuronal+and+neuron-astrocyte+mixed+primary+culture+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%3A+the+contribution+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerases+and+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases.</a> Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A natureza complexa dos processos de mielinação/remielinização e eventos desmielinização torna o desenvolvimento de sistemas in vitro preditivos extremamente desafiadores. Os sistemas de triagem de drogas in vitro mais utilizados são principalmente linhas de células humanas ou culturas primárias de OL puras, com uso crescente de co-culturas mais complexas ou sistemas organotipicos15. Mesmo que tais sistemas estejam associados a tecnologias de alto conteúdo, culturas puras de OL continuam sendo o m...

No sistema nervoso central (SNC), as células formadoras de mielina (oligodendrocytes, OLs) e seus precursores (células precursoras oligodendrocytes, OPCs) são responsáveis pela mielinação do desenvolvimento, processo que ocorre durante os períodos peri e pós-natal, e para a rotatividade e reparação da mielina (remielinização) na idade adulta1. Essas células são altamente especializadas, interagindo anatomicamente e funcionalmente com todos os outros componentes gliais e neuronais, tornando-as uma parte fundamental da estrutura e função do CNS.
Eventos desmelique estão envolvidos em diferentes lesões e doenças do CNS2, e atuam principalmente em OPCs e OLs por meio de mecanismos multifatoriais, tanto durante o desenvolvimento quanto na idade adulta. Os precursores indiferenciados são impulsionados por fatores diferenciadores, principalmente o hormônio da tireoide (TH), em um processo sincronizado3 que leva o OPC a reconhecer e responder a estímulos específicos que induzem a proliferação, migração para o axônio não mielinado e diferenciação em OLs maduros que, por sua vez, desenvolvem a baiamielina 4. Todos esses processos são finamente controlados e ocorrem em um ambiente complexo.
Devido à natureza complexa dos eventos de mielinação, remielinação e dessalinização, há uma grande necessidade de um método in vitro simplificado e confiável para estudar os mecanismos subjacentes e desenvolver novas estratégias terapêuticas, com foco no principal player celular: o OPC5.
Para que um sistema in vitro seja confiável, uma série de fatores precisam ser levados em conta: a complexidade do ambiente celular, diferenças intrínsecas relacionadas à idade celular, diferenciação fisiológica mediada pelo TH, mecanismos patológicos e a robustez dos dados6. De fato, a necessidade não atendida no campo é um modelo que imita a complexidade da condição in vivo, não alcançada com sucesso através do uso de culturas OPC puras isoladas. Além disso, os dois principais componentes dos eventos desmielinizadores, inflamação e hipóxia/isquemia (OI), envolvem diretamente outros componentes celulares que podem afetar indiretamente a diferenciação fisiológica e a maturação das OPCs, aspecto que não pode ser estudado em modelos in vitro super simplificados.
A partir de um sistema de cultura altamente preditivo, o desafio subsequente e mais geral é a produção de dados robustos e confiáveis. Nesse contexto, a triagem de alto teor baseado em células (HCS) é a técnica mais adequada7, uma vez que nosso objetivo é, em primeiro lugar, analisar toda a cultura em um fluxo de trabalho automático, evitando o viés de escolha de campos representativos e, em segundo lugar, obter a geração automática e simultânea de dados de alto conteúdo baseados em imagem8.
Dado que a principal necessidade é alcançar o melhor equilíbrio entre a simplificação in vitro e a complexidade in vivo-imitação, aqui apresentamos um método altamente reprodutível para a obtenção de OPCs derivados de células-tronco neurais (NSCs) isoladas do cérebro fetal e da zona sub-ventricular adulta (SVZ). Este modelo in vitro abrange todo o processo de diferenciação OPC, desde NSC multipotente até OL maduro/mieliing, de forma fisiológica dependente de TH. A cultura resultante é um sistema de diferenciação/amadurecimento dinamicamente que resulta em uma cocultura espontânea que consiste principalmente em diferenciar OPCs e astrócitos, com baixa porcentagem de neurônios. Essa cultura primária imita melhor o complexo ambiente in vivo, enquanto sua derivação de células-tronco permite que manipulações simples sejam realizadas para obter o enriquecimento de linhagem celular desejado.
Ao contrário de outras estratégias de triagem de medicamentos utilizando linhas celulares ou culturas puras de OPCs primárias, o método descrito aqui permite o estudo do efeito de interferentes patológicos ou moléculas terapêuticas em um ambiente complexo, sem perder o foco no tipo celular desejado. O fluxo de trabalho do HCS descrito permite uma análise da viabilidade celular e especificação de linhagem, bem como de morte celular específica da linhagem e parâmetros morfológicos.

<table><tbody><tr><td>Placas de 96 poços -</td><td>suplemento NUNC</td><td>267313</td><td></td></tr><tr><td>B27 não tratado (100x)</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF)</td><td>GIBCO</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fator Neurotrópico Ciliar (CNTF)</td><td>GIBCO</td><td>PHC7015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem glicose</td><td>GIBCO</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td></td><td>GIBCO 14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF)</td> <td>GIBCO</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gama;</td><td>Orígenes</td><td>TP721239</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Orígenes</td><td>TP723199</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Origene</td><td>TP723210</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Origene</td><td>TP723240</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>GIBCO</td><td>23017-051</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2 (50x)</td> <td>GIBCO</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de dissociação não enzimática</td><td>GIBCO</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-AA)</td> <td>GIBCO</td><td>PHG0035</td><td></td></tr><tr><td>poli-D, L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Orígenes</td><td>TP720760</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Origene</td><td>TP723451</td><td></td></tr><tr><td>Triiodotironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

O principal obstáculo no desenvolvimento de técnicas de triagem de medicamentos para avaliar a eficácia de estratégias terapêuticas em doenças complexas é encontrar um equilíbrio entre a simplificação in vitro e a recriação do complexo ambiente in vivo, juntamente com o objetivo principal, compartilhado por todas as estratégias de triagem, de obtenção de dados robustos e confiáveis, altamente preditivos para a tradução in vivo.
No campo das doenças desmielinizantes, a maioria das estratégias de rastreamento de medicamentos baseia-se em linhas celulares imortalizadas ou culturas puras de células precursoras de oligodendrocytos primários isolados (OPCs) de animais recém-nascidos, levando a fortes vieses devido à falta de diferenças relacionadas à idade e a qualquer condição ou complexidade patológica real.
Aqui mostramos a configuração de um sistema in vitro destinado a modelar a diferenciação fisiológica/maturação de OPCs derivados de células-tronco neurais (NSC), facilmente manipulados para imitar condições patológicas típicas de doenças desmielinizantes. Além disso, o método inclui o isolamento de cérebros fetais e adultos, dando um sistema que se diferencia dinamicamente de OPCs para oligodenrócitos maduros (OLs) em uma cocultura espontânea que também inclui astrócitos. Este modelo se assemelha fisiologicamente ao processo de mielinação mediada por hormônios da tireoide e processo de reparação da mielina, permitindo a adição de interferentes patológicos que modelam mecanismos da doença. Mostramos como imitar os dois principais componentes das doenças desmielinizantes (ou seja, hipoxia/isquemia e inflamação), recriando seu efeito na mielina do desenvolvimento e na reparação da mielina adulta e levando em conta todos os componentes celulares do sistema, ao mesmo tempo em que focamos na diferenciação de OPCs.
Este modelo misto espontâneo, juntamente com tecnologias de triagem de alto conteúdo baseadas em células, permite o desenvolvimento de um sistema robusto e confiável de triagem de medicamentos para estratégias terapêuticas destinadas a combater os processos patológicos envolvidos na desmielinização e induzir a remielinização.

A primeira fase da cultura pode variar de duração, dependendo da densidade de semeadura e se as esferas são de origem fetal ou adulta. Além disso, as oligosferas apresentam uma redução da população em relação às neuroesferas (Figura 1B). Além disso, a produção de esferas a partir de tecido adulto é mais lenta e pode levar de 2 a 3 semanas para gerar oligosferas em comparação com o fetal que pode levar de 1 a 2 semanas, dependendo da densidade de semeadura.
Uma vez...

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...

O protocolo combina o isolamento específico da idade de culturas mistas espontâneas derivadas de células-tronco neurais contendo células precursoras e astrócitos diferenciadas, ensaios imitando condições patológicas e leituras robustas e de alto conteúdo. Essas características possibilitam o estudo diferencial da milinação do desenvolvimento e da remielinação adulta em condições fisiológicas e patológicas e em um microambiente que leve em consideração a contribuição dos astrócitos. Para o isolamento neural de células-tronco do dia embrionário 13,5 a 14,5 cérebros fetais, coloque as cabeças dos embriões em uma placa de Petri limpa com PBS gelado e use fórceps para remover a pele do crânio sob ampliação.Uma vez que o cérebro esteja visível e limpo da pele, use fórceps para espremer o cérebro para fora do crânio e remover o cerebelo. Use os fórceps para remover as meninges e coloque o tecido isolado no tampão de dissociação não enzimática. Quando todo o tecido cerebral tiver sido isolado, puxe de duas a três amostras em 150 microliters de tampão de dissociação não enzimática por tubo de 1,5 mililitro, e incubar os tubos por 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua.Ao final da incubação, adicione 850 microliters de meio padrão a cada tubo e pipeta para misturar até que a suspensão esteja livre de aglomerados. Se o tecido não dissociado ainda estiver visível, deixe que as amostras descansem por dois minutos para permitir que os tecidos se acomodem na parte inferior dos tubos. Quando a dissociação estiver completa, as células da placa a uma densidade de 10 a 50 células por microliter em 10 a 30 mililitros de concentração média da neurosfera em um frasco T25 ou T45, e colocam o frasco na incubadora de cultura celular em uma posição vertical para evitar o apego celular.de camundongos adultos de 2,5 meses de idade, coloque cérebros de quatro a cinco ratos adultos em um tubo de 50 mililitros de HBSS gelado e coloque um cérebro, lado ventral para baixo, na direção rostral-caudal em um frasco estéril coberto de papel alumínio cheio com menos 20 graus Celsius de água fria durante a noite. Use uma lâmina de barbear para remover as lâmpadas olfativas e para cortar de duas a três fatias coronais de um milímetro de espessura do córtex para o chiasma óptico. Coloque as fatias na superfície fria em uma posição ventro-dorsal, e identifique o corpus caloso e os dois ventrículos laterais.Utilizando ampliação, isole as paredes dos ventrículos laterais, tomando cuidado para não incluir pedaços do caloso corpus, e coloque o tecido isolado em cinco a 10 mililitros de tampão de dissociação enzimática para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, pipete os tecidos pelo menos 50 vezes antes de incubar as amostras a 37 graus Celsius por mais 10 minutos. No final da incubação, neutralize a trippsina com cinco mililitros de cultura padrão e filtre a suspensão do tecido através de um filtro de 70 mícrons.Centrifugar a solução filtrada por cinco minutos a 400 vezes g, e suspender a pelota em solução de sacarose para uma segunda centrifugação. No final da centrifugação, suspenda novamente a pelota na solução de lavagem de albumina de soro bovino para outra centrifugação, depois suspenda novamente a pelota no meio de cultura padrão para contagem e emplaque as células em um frasco T-25 ou T-45 vertical. Para diferenciação da neurosfera primária, adicione fatores básicos de fibroblasto e crescimento endotelial à cultura de células-tronco neurais a cada dois dias.Quando as neuroesferas atingirem um diâmetro de 100 a 500 mícrons, passagem as células por dissociação mecânica de acordo com os protocolos padrão. Para diferenciação de oligosfera, trate as células com fator básico de crescimento do fibroblasto no fator derivado de plaquetas-AA a cada dois dias. Quando as oligosferas atingem um diâmetro de 100 a 150 mícrons, dissociam as esferas por dissociação mecânica de acordo com os protocolos padrão e semeam a suspensão celular a uma densidade de 3000 células por centímetro quadrado em placas revestidas de laminina poli-DL-ornithine.Após três dias, substitua o supernatante de cada cultura pelo mesmo volume de meio de diferenciação oligodendrocida. Para realizar uma indução de bloco de diferenciação mediada por inflamação, após a dissociação da neurosfera e durante a produção da oligosfera, adicione a mistura de citocina de interesse ao meio da cultura. Para induzir a morte celular de privação de oxigênio-glicose, dois dias após a semeadura nas placas multi-poços, transfira o supernante de cada cultura para poços individuais de uma placa multi-poço.Adicione metade do volume de meio OGD aos poços, e transfira as culturas para uma câmara hermética de hipóxia saturada com 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono. Coloque a câmara na incubadora de cultura celular. Após três horas, substitua o meio nas câmaras pelo conjunto médio à placa de cultura multi-poço.Depois de verificar a qualidade da coloração celular, no menu Aquisição do software de triagem de alto conteúdo, selecione o tempo de exposição fixa e mini scan, e selecione 10 campos por poço e dois poços por condição experimental para permitir que os parâmetros de análise no subconjunto de campos sejam definidos para toda a placa. Siga o fluxo de trabalho passo a passo para desenvolver todo o algoritmo. Selecione Processar imagem para cada canal e clique em Remoção de fundo para selecionar o nível de sinal desejado.Para identificar e selecionar os núcleos por coloração nuclear, clique em Identificar objeto primário, ajustar o limiar para identificar núcleos únicos e clicar em Validar objetos primários para definir os limiares com base nas áreas e posição do objeto. Clique em Identificar pontos para cada canal correspondente aos marcadores específicos de linhagem e definir a largura do valor do anel para três e a distância a zero para permitir a identificação da fluorescência citoplasmática. Selecione os níveis de referência no fluxo de trabalho para construir a análise e para permitir a contagem automática dos núcleos condensados com base no tamanho nuclear e intensidade de coloração nuclear e das células específicas marcador-positivas baseadas na fluorescência citoplasmática identificada pelo anel, em seguida, clique em Reproduzir.Durante a primeira fase da cultura, as células-tronco neurais mantêm sua expressão de ninho. A maioria das células também são NG2-positivas. As células positivas do CNPase correspondentes ao estágio pré-oligodendrocyto são detectáveis de três a seis dias após a indução de diferenciação mediada por T3, enquanto oligodendrocitos maduros mbp positivos aparecem em uma porcentagem significativa após seis a 12 dias in vitro.A análise de triagem de alto teor de conteúdo permite a detecção de células únicas dentro da cultura através da análise de coloração nuclear e intensidade de fluorescência. A composição da cultura no final da fase de diferenciação difere dependendo se as culturas são de origem fetal ou adulta, com culturas fetais mais responsivas à diferenciação mediada por T3, e atingindo uma porcentagem maior de oligodendrocitos maduros. Observe que quando as células precursoras do oligodendrocyte derivadas de células-tronco neurais são semeadas a uma alta densidade, elas se agregam, e os astrócitos replicantes produzem rapidamente uma camada celular confluente, impedindo a observação da forma característica da rede de aranhas de oligodendrocitos maduros.Mediado por inflamação, o bloqueio diferenciado induz uma forte diminuição nos oligodenrócitos pré e maduros, conforme detectado pelas manchas de CNPase e MBP nas culturas fetal e adulta. Um aumento no número de células precursoras oligodendrocytos também ocorre em culturas adultas tratadas com citocinas. Enquanto as células precursoras do oligodendrocyte fetal e adulto mostram o mesmo à exposição inflamatória de citocinas, apenas culturas derivadas do fetal são sensíveis à toxicidade da privação de oxigênio-glicose.O método pode ser implementado com qualquer tipo de células precursoras oligodendrocyte, processo de diferenciação e amadurecimento, para testar novas estratégias visando combater doenças que afetam a mielinação ou remielinização

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais...

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra o processo de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) a partir de células-tronco embrionárias humanas, seguido pela maturação de OPCs em oligodendrócitos. Esse processo de geração de oligodendrócitos abre vários caminhos para melhorar a pesquisa e o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em oligodendrócitos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Aprenda a analisar diferenciação e maturação de células precursoras de oligodendrócitos derivadas de células-tronco neurais usando triagem de alto conteúdo. Este método computacional permite modelar mielinização e triagem de fármacos.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

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