Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Olá a todos. Meu nome é Nicolas Wein. Sou um investigador principal do Hospital Infantil Nacional em Columbus, Ohio.

E hoje vamos mostrar um vídeo sobre como fazer uma biópsia de pele e convertê-la em míobios e miotube. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar a desordem neuromuscular. Além disso, é uma tecnologia muito mais rápida em comparação com o IPSC porque estamos usando dois tipos diferentes de vírus para combater diretamente esse tipo de célula.

Este vídeo demonstra o protocolo para estabelecer culturas de fibroblasto derivados da pele humana, a conversão em míbios e, em seguida, miotubos diferenciados. Uma biópsia da pele é transferida para a cultura celular para derivar fibroblastos dérmicos. Lentivírus portadores de genes hTERT e MYOD são usados para transduzir esses fibroblastos.

Após a adição do meio de crescimento myoblast suplementado com Doxycycline, o gene MYOD é expresso, induzindo a conversão de fibroblastos em míobios. Em seguida, o meio é trocado para um meio de diferenciação, também complementado com Doxycycline. Então os míobios se fundem uns com os outros, formando miótubos multinucleados.

Aspire a mídia do tubo e enxágue a biópsia com 10 mililitros, um x PBS em temperatura ambiente, três vezes. Após a terceira lavagem, deixe o PBS no tubo. Despeje o PBS e a biópsia da pele em um prato quadrado de 10 centímetros.

Usando bisturis estéreis, corte a biópsia em pedaços que são tão pequenos quanto possível. Usando uma pipeta, transfira uma peça de pele individual para um prato estéril de 10 centímetros quadrados. Aspire o excesso de PBS ao redor de cada peça.

Tenha cuidado para não aspirar a peça em si. Cubra os pratos com a tampa parcialmente e deixe as peças de biópsia da pele secarem por cinco a 20 minutos. Não deixe as peças secarem por muito tempo.

Uma vez que as peças estejam secas, incline o prato em um ângulo de 45 graus e adicione lentamente 12 mililitros de meio de fibroblasto ao canto do prato. Abaixe o prato, distribuindo cuidadosamente a mídia para que as peças não sejam levantadas pela mídia. Coloque os pratos na incubadora.

Substitua a mídia em cinco a sete dias, e uma vez por semana depois. Os fibroblastos primários de sementes a 30% de confluência e dois poços de uma placa de 12 poços, aproximadamente 20.000 células por poço, a fim de ter cerca de 50% de confluência no dia seguinte. Para transdução lentiviral, adicione dois a 5 bilhões de genomas virais de hTERP Puromycin Lentivirus e 400 microliters de meio fibroblasto.

Adicione a mistura de lentivírus a um poço. Para o segundo poço, adicione apenas 400 microliters de meio fibroblasto. No dia seguinte, adicione um mililitro da mídia.

Um ou dois dias depois, transfira as células para uma placa de seis poços e plante-as até atingir 60 a 70% de confluência. Suplemente o meio do fibroblasto com um micrograma por mililitro de Puromicina e adicione dois mililitros a cada poço. Mantenha as células em seleção até que todas as células do poço de controle estejam mortas por pelo menos 12 dias, mudando a mídia a cada dois ou três dias.

Gráfico de sementes H expressando fibroblastos a 30% de confluência em três poços da placa de 12 poços para ter cerca de 50% de confluência no dia seguinte. Para a transdução lentiviral, misture de dois a cinco bilhões de genomas virais de lentivírus MYOD Hygromycin B e 400 microlitros de meio fibroblasto e adicione a dois poços. Adicione um mililitro de meio no dia seguinte.

Um ou dois dias depois, transfira as células para uma placa de seis poços e cresça até 60 a 70% de confluente. Complemente a mídia de crescimento com 400 microgramas por mililitro de Hygromicina B.Adicione dois mililitros a cada poço. Mantenha as células em seleção até que todas as células dos poços de controle tenham morrido, normalmente levando pelo menos 12 dias, mudando a mídia a cada dois ou três dias.

Para indução de míobios, cresçam fibroblastos até que sejam 70% confluentes. Adicione oito microgramas por mililitro de Doxycycline ao meio de crescimento myoblast. Use sempre alíquotas frescas de Doxycycline e média.

O meio deve ser preparado antes de qualquer mudança de mídia. Além disso, a Doxycycline não deve ser refrozen. Aspire o meio do fibroblasto e enxágue as células com PBS.

Adicione 10 mililitros de mídia myoblast suplementada. Dois a três dias depois, as células são 90 a 95% confluentes e sua morfologia terá mudado. Aspire a mídia de crescimento myoblast e enxágue a superfície celular com PBS.

Adicione 10 mililitros de mídia de diferenciação que foi complementado com oito microgramas por mililitro de Doxycycline fresco. Continue a mudar a mídia a cada dois ou três dias até que os miotubes sejam formados. Sete a dez dias após o início da diferenciação do miotube, as células devem ser totalmente diferenciadas, mas isso varia de uma linha celular para outra.

Os primeiros fibroblastos podem surgir cinco dias após as peças de pele estarem na cultura. Na foto B, os fibroblastos são confluentes e prontos para serem transferidos para frascos quadrados de 75 centímetros para maior proliferação. É importante congelar vários frascos de fibroblastos em baixos números de passagem à medida que as células primárias entram na senescência replicativa.

Uma vez estabelecidas as linhas celulares FM para a conversão de fibroblastos em miotubes, os fibroblastos devem proliferar até 70% confluentes como mostrado na imagem A.É importante não exceder 80% de confluência, pois uma alta densidade pode prejudicar a diferenciação. Após a adição de Doxycycline ao meio, dentro de dois a quatro dias as células se tornam míferas, caracterizadas por uma morfologia alongada e orientação paralela como visto na imagem B.Myotubes diferenciados são mostrados na imagem C.O tempo para fusão e diferenciação dos miótubos pode variar de sete a 21 dias, dependendo do genótipo celular. As células devem ser coletadas ou fixadas antes de se desprenderem.

O início do destacamento pode ser observado pela cor e brilho das bordas do miotube, como apontado pelas setas nesta imagem. Por imunofluorescência, a expressão de proteínas específicas musculares maduras confirma a conversão bem sucedida de fibroblastos em mítuos. Nestas imagens, três células diferentes são mostradas.

O grau de diferenciação variará de célula para célula, podendo ou não ser efetuado pela mutação primária, pois é o caso das células nas figuras B e C.A posterior validação do modelo foi confirmada pela RNAseq. Como mostrado nesta trama há mais de 12.000 genes expressos diferencialmente detectados em miotubes FM em comparação com o músculo esquelético. A correlação significativa entre ambos os transcritos suporta que as células FM têm um perfil de expressão específico muscular demonstrando que eles são um substituto útil e confiável para linhas celulares derivadas musculares.

Para ilustrar a utilidade deste modelo in vitro, usamos uma das duplicações exônicas mais comuns no gene DMD. A duplicação do Exon dois leva à interrupção do quadro de leitura DMD, e seu salto pode levar à restauração desse quadro de leitura ou utilização do local interno de entrada ribossosome. Esta terapia já foi validada com estudos in vivo Figura A, demonstramos prova de conceito pela análise rtpcr desta linha celular mutada particular, com e sem tratamento por exon skipping.

A mancha ocidental na figura B demonstra que a proteína de distrofina funcional é expressa em células tratadas. Ao comparar a eficiência dessa terapia com os modelos in vivo, os resultados suportam a confiabilidade da técnica de diferenciação celular e apoiam seu uso para testar várias terapias genéticas específicas de mutação. Antes os estudos clínicos exigiam testar a eficácia do suporte terapêutico oficial em distúrbios neuromusculares, dependendo da capacidade dos modelos animais e celulares.

O desenvolvimento de modelos animais, embora seja mais fácil hoje em dia, não é uma opção viável para cada mutação específica. A geração de myoblasts através de células IPS derivadas de fibroblastos dérmicos é uma alternativa, mas é uma técnica demorada. Assim, este procedimento é uma alternativa simples à geração de IPS que permite a conversão direta de fibroblastos em míbios.

Facilita o acesso a modelos de células humanas, evitando a aplicação mais invasiva de biópsias musculares Em conclusão, essa conversão direta de fibroblastos em míobios é uma poderosa ferramenta para testar terapias para distúrbios neuro musculares em contexto específico de limitação.