Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

O método de fixação de gradiente, no qual uma centrifugação de gradiente de glicerol é realizada na presença de um reticulador, ajuda a identificar interações entre proteínas que se ligam transitoriamente a complexos de múltiplas subunidades. O uso de reagentes de fixação no gradiente de glicerol estabiliza a ligação de fatores soltos, sem a formação de precipitados, permitindo a identificação das interações de proteínas específicas com semicomplexos splionados. A demonstração do protocolo final ajuda os usuários iniciantes a aprender informações que podem ser difíceis de entender apenas com texto escrito.

Para a preparação do extrato total de levedura, cultive as células de levedura que expressam um dos fatores de splicing fundidos à etiqueta da torneira e um litro de meio de glicose Y e B suplementado com os aminoácidos ou bases nucléicas apropriados. Quando a cultura atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de um, colete as células de levedura por centrifugação em três frascos de centrífuga de 500 mililitros e lave as células duas vezes em 10 mililitros de água fria estéril por lavagem. Após a segunda lavagem, ressuspenda as células em um décimo do volume celular do tampão frio A e congele gotas de 50 microlitros da suspensão de células de levedura em nitrogênio líquido.

Após o congelamento, triture os pellets de células congeladas por seis ciclos a 20 hertz por três minutos em um dispositivo de moinho de bolas, imergindo o recipiente de células congeladas em nitrogênio líquido no final de cada ciclo. Após o último ciclo, colocar os tubos contendo os extratos em água à temperatura ambiente, agitando ocasionalmente. Depois de derretido, centrifugue para coletar os extratos.

E quantificar a proteína que os sobrenadantes eliminaram pelo método BCA. Em seguida, congele rapidamente as alíquotas dos extratos em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus Celsius negativos. Para preparar um gradiente de glicerol, adicione uma concentração final de 0,1% do agente de reticulação glutaraldeído a uma solução de glicerol a 30% e tampão A e misture para homogeneizar.

Adicione seis mililitros de glicerol frio a 10% e tampão A a uma solução de centrífuga de 12 mililitros e use uma seringa de dispositivo mestre de gradiente equipada com uma agulha longa para colocar a solução de glutaraldeído a 30% de glicerol no fundo do tubo. Use um dispositivo mestre de gradiente para criar um gradiente linear de glicerol de acordo com as especificações do fabricante. Cuidadosamente coloque 200 microlitros de glicerol a 7% e tampone uma almofada A no topo do gradiente antes de adicionar aproximadamente dois miligramas de extrato celular no topo do tubo.

Após a geração do gradiente de glicerol, coloque a amostra em um rotor de balde oscilante pré-resfriado e colete o extrato por centrifugação. Alicotar a amostra de cada tubo de amostra de 12 mililitros em 24 fracções de 500 microlitros e utilizar uma bomba peristáltica para empurrar uma solução de glicerol a 40% através do gradiente de 10 a 30% do tubo para a recolha de frações. Em seguida, carregue 50 microlitros de cada fração diretamente nas membranas de nitrocelulose em um dot blot, seguido pela adição de tampão de bloqueio, e use um anticorpo primário contra CBP para detectar a proteína no immunoblot e um anticorpo secundário apropriado, conforme necessário.

Na ausência de reticulador, o CWC 24 está concentrado entre as frações cinco e 13, correspondendo a complexos de cerca de 80 a 200 megadaltons. Na presença do reticulador, no entanto, a posição do CWC 24 no gradiente é deslocada para frações na parte inferior do gradiente correspondentes a complexos maiores. Comparando a sedimentação de CWC 24 com a da subunidade U5 snRNP, Prp8, e a subunidade NTC, Prp19 revela que CWC 24 está concentrado nas mesmas frações.

Mas, por se associar transitoriamente ao spliceossomo, também está presente nas frações mais leves. Curiosamente, as frações 11 e 12 são aquelas em que Prp8 e 19 começam a se concentrar, sugerindo que esta é a porção do gradiente onde o complexo B Act começa a sedimentar. A análise de Western blot das frações 11 e 12 revela sinais de Prp8 e 19 como esfregaços que mal entram em um gel de acrilamida a 8%, mostrando que eles são de fato parte de grandes complexos.

CWC 24 também está presente na fração 12, mas em uma concentração muito menor, consistente com sua ligação transitória ao complexo B Act. Tomados em conjunto, esses resultados mostram que o glutaraldeído pode ser usado como um reticulador para estabilizar a ligação de fatores transitórios a subcomplexos de splicing. Este método pode ser aplicado ao estudo de quaisquer complexos de subunidades motoras dinâmicas que se associam transitoriamente a alguns de seus componentes, como o spliceossomo.