Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Nosso protocolo permite que os pesquisadores estudem o processo de formação da rede de vasos de forma clara e facilmente rastreável, abrindo as portas para novos estudos e lançando luz sobre o comportamento dos vasos sanguíneos. Esta técnica apresenta a possibilidade de criar redes vasculares altamente organizadas e repetíveis com resposta ao ambiente circundante. As células endoteliais de pacientes que sofrem de uma doença vascular podem ser recuperadas no uso desse sistema, possibilitando recriar a doença vascular e encontrar um tratamento adequado.

O método proposto pode ser estendido para estudar o comportamento da rede vascular quando emparelhado com diferentes tipos de células, permitindo observar a interação dos vasos em desenvolvimento com um tipo específico de tecido. Comece submergindo os andaimes em 70% de etanol por um mínimo de 15 minutos, depois lave-os duas vezes na PBS. Misture 1,5 microliters de solução de estoque de fibronectina com 28,5 microliters de PBS por andaime a ser semeado.

Prepare uma diluição de fibronectina para ser usada para todos os andaimes para evitar erros de pipetação. Coloque os andaimes escassamente em cima de uma superfície hidrofóbica e cubra cada andaime com 30 microlitres da diluição da fibronectina. Substitua a tampa da placa e coloque os andaimes cobertos de fibronectina em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius e 100% de umidade por um mínimo de uma hora.

Após a incubação, enxágue levemente os andaimes em PBS para remover os remanescentes de fibronectina. Os andaimes podem ser mantidos na PBS a quatro graus Celsius por até uma semana. Prepare a célula endotelial ou o meio EC misturando o meio basal com os componentes correspondentes do kit médio, incluindo uma solução antibiótica, FBS e suplementos de crescimento de células endoteliais, conforme indicado pelo fabricante.

Faça a suspensão da célula endotelial microvascular de adiposa humana em meio ce com uma concentração de quatro milhões de células por mililitro. Usando fórceps, coloque um andaime revestido de fibronectina por poço em uma placa não TC 24-well. Cubra cada andaime com 25 gotículas de microliter da suspensão da célula, certificando-se de não deixar a suspensão fluir para longe do andaime.

Coloque a tampa na placa e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% umidade por 60 a 90 minutos. Após a incubação, encha cada poço com 700 microliters de meio CE. Incubar os andaimes endotelializados até que a confluência ce possa ser observada usando microscopia fluorescente ou por três dias.

Mude o meio dia não. Prepare o meio DPSC misturando 500 mililitros de DMEM de baixa glicose, 57,5 mililitros de FBS, 5,75 mililitros de aminoácidos não essenciais, 5,75 mililitros de GlutaMAX e 5,75 mililitros de solução penicilina-estreptomicina-nystatin. Transfira os andaimes endotelializados para uma nova placa não-TC 24-well.

Descarte todas as mídias da placa atual usando uma pipeta ou sucção a vácuo, tomando cuidado para não aplicar vácuo diretamente no andaime. Coloque um andaime no centro de cada poço e seque a área circundante com vácuo leve. Diluir as soluções de trombina e fibrinogênio com PBS para uma concentração final de cinco unidades por mililitro e 15 miligramas por mililitro, respectivamente.

Prepare uma suspensão de oito milhões de DPSC por mililitro na diluição da trombina e distribua 12,5 microliters da suspensão em microtubos individuais por andaime a ser semeado. Defina uma pipeta de 5 a 50 microlitres para 12,5 microliters e encha-a com solução fibrinogênio. Sem remover a ponta, coloque a pipeta em 25 microliters.

O material na ponta deve subir e deixar um volume vazio. Pressione lentamente o botão do êmbolo até que o líquido atinja a abertura da ponta, mas não vaze. Segure o êmbolo nesta posição e coloque a ponta em um dos tubos de microcentrifuuge contendo as células em suspensão de trombina, certificando-se de que a ponta esteja em contato com o líquido.

Solte suavemente o botão do êmbolo e puxe a suspensão da célula para a ponta. Misture bem os dois materiais, evitando a formação de bolhas. Dispense rapidamente os materiais mistos em cima de um andaime endotelializado.

Repita as etapas anteriores para cada andaime, certificando-se de alterar dicas entre os usos para evitar a formação inesperada de gel fibrin dentro da ponta. Substitua a tampa da placa e incuba os andaimes a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade por 30 minutos. Após a incubação, encha cada poço com um mililitro de dpsc e meio EC.

Cultura por uma semana, mudando o meio a cada dois dias. Em diferentes pontos de tempo durante a cultura, remova o meio do poço e imagem dos construtos usando um microscópio confocal para estudar o desenvolvimento vascular ou qualquer outro parâmetro de interesse. Este protocolo permite a fabricação de andaimes tesvendados feitos de fotoresist SU-8.

Foram obtidos andaimes com geometrias de compartimento distintas e características altamente precisas e repetíveis. Com a tradicional semeadura simultânea de células endoteliais e células de suporte, as células foram distribuídas de forma homogênea sobre o andaime, resultando em redes vasculares imprevisíveis e desorganizadas. Ao contrário, a semeadura de células stepwise resultou em redes vasculares altamente organizadas.

Ao usar células endoteliais fluorescentes, os vasos podem ser imagens em tempo real. Proteína fluorescente vermelha expressando células endoteliais foram cultivadas em andaimes hexagonais e imagens. As células de suporte foram adicionadas no primeiro dia e as redes vasculares foram imagens a cada dois dias para quantificar o desenvolvimento dos vasos.

Para cada ponto de tempo, imagens largas de todo o andaime foram tiradas. O crescimento da embarcação foi quantificado como comprimento total do vaso e área. Um lapso de tempo de imagem confocal foi realizado para permitir o rastreamento de um único vaso usando células endoteliais multicoloridas.

O caminho da embarcação foi gerado a partir do lapso de tempo, possibilitando observar a migração da embarcação. A maturação do vaso foi observada pela presença de actina muscular lisa e células de apoio. Para os compartimentos circulares, hexagonais e quadrados, as células se multiplicam e se organizam em estruturas.

No sétimo dia, todas as formas mostravam uma rede vascular rica e complexa. Imagens de ampliação mais altas revelaram uma actina muscular suave mais densa e presença celular de suporte co-localizada com vasos formados, evidenciando recrutamento de células de apoio e diferenciação em torno de estruturas vasculares. Essa técnica pode ser usada para estudar o comportamento de redes vasculares tridimensionais quando expostas a diferentes condições, como inibidores celulares específicos ou na presença de tipos celulares adicionais.