Name: Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a usar células-tronco embrionárias haploides partenogenéticas de rato como substituto do esperma para criar embriões semi-clonados. Este método avança estudos de imprinting genômico e biologia reprodutiva.

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Agradecemos ao Dr. Giulio Di Minin pela derivação das linhas phaESC e dr. Remo Freimann pela operação de citometria de fluxo. Também reconhecemos a Sra. Michèle Schaffner e o Sr. Thomas M. Hennek por apoio técnico com transferência de embriões. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsa 31003A_152814/1).

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Os autores não têm nada a revelar.

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) foi pioneira na década de 1990,20,21. Esses desenvolvimentos seguiram estudos de clonagem realizados 30 anos antes em anfíbios22. O atraso considerável reflete a dificuldade da embriologia e da impressão genômica em mamíferos. O desenvolvimento do SCNT mamífero é a base para a aplicação do haESC para substituição de espermatozoides, que está detalhado neste protocolo.
A sincronização do ciclo celular é um fator importante para o sucesso do SCNT23. Este também é o caso da injeção de haESC neste protocolo. A introdução de um genoma doador em um receptor requer que as fases do ciclo celular sejam combinadas para evitar quebras cromossômicas ou aneuploidies que revogariam o desenvolvimento de embriões. A semi-clonagem tem a complexidade adicional que dois genomas e um citoplasto precisam ser compatíveis. Um relatório anterior demonstrou que a injeção de haESCs androgenéticos presos em fase M produziu melhores taxas de desenvolvimento de embriões semi-clonados do que a injeção de haESCs em fase G1 em oócitos7. Este relatório sugere a fase M como um ponto de sincronização adequado para a semi-clonagem. Assim, os phaESCs foram mitoticamente presos em metafase com demecolcina e injetados no ooplasma dos oócitos MII, que foram naturalmente presos em metafase II da meiose. É importante ressaltar que a detenção em fase M pode ser alcançada em ESCs de camundongos com alta eficiência, proporcionando excelente sincronização entre ciclos de células doadoras e receptoras.
Durante a mitose, a membrana nuclear se rompe e um fuso se forma a que os cromossomos replicados se conectam. Após a injeção de DKO-phaESCs de fase M, os cromátides irmãos são segregados em um corpo pseudo polar e o zigoto7 (Figura 3E). Consequentemente, um único conjunto de cromossomos de um DKO-phaESC contribui para o embrião semi-clonado. É fundamental que os cromátides irmãs dos cromossomos DKO-phaESC possam ser corretamente segregados após a injeção. A membrana plasmática de um DKO-phaESC intacto impede a segregação em um corpo pseudo polar. Observamos casos raros em que a membrana plasmática de DKO-phaESCs não foi rompida, e os embriões apresentaram DKO-phaESCs intactos no ooplasma após a injeção(Figura 3D). Portanto, deve-se tomar cuidado para remover a membrana plasmática de DKO-phaESCs por pipetação. Durante a injeção, é igualmente importante evitar a interrupção do fuso meiotico do oócito, o que poderia levar a defeitos de segregação do cromossomo e induzir aneuploidia também.
Em mamíferos, a impressão genômica limita a aplicação de phaESCs como substituição de espermatozoides. HaESCs partenogenéticas possuem uma configuração materna de impressões genômicas, enquanto os espermatozoides possuem uma configuração paternal. Portanto, a geração de filhotes a termo não ocorreu após a injeção de phaESCs de tipo selvagem como substituição de espermatozoides. Para superar essa limitação, as exclusões dos IG- e H19-DMRs são projetadas em phaESCs. A modificação da expressão impressa no Igf2-H19 materno e gtl2-dlk1 loci é suficiente para alterar a configuração de impressões genômicas para permitir a geração de camundongos semi-clonados com uma frequência de mais de 5,1%, com base em embriões transferidos de 2 células. Essas observações sugerem que o alvo de dois genes impressos muda o genoma dos phaESCs para uma configuração paternal funcional que pode substituir o esperma em camundongos. No entanto, é necessária uma modificação genética permanente dos phaESCs para essa estratégia. Como estratégia alternativa, pode-se considerar haESC androgenético. HaESCs androgenéticos são derivados do genoma do esperma e possuem impressões paternas. Há relatos de que os haESCs androgenéticos selvagens contribuíram como reposição de esperma para gerar filhotes a termo em uma frequência entre 1,3% e 1,9% dos embriões transferidos4,7,24. Os filhotes a termo também foram obtidos injetando haESCs androgenéticos com exclusões do IG- e H19-DMRs a uma frequência de 20,2% dos embriões de 2 células transferidos24. O aumento da eficiência da semi-clonagem usando haESCs androgenéticos modificados é provável porque as impressões podem se tornar instáveis na cultura. Os defeitos de impressão são corrigidos pelas exclusões genéticas das DMRs críticas.
Considerando a dificuldade em introduzir modificações genéticas diretamente nos genomas oócitos ou espermatozoides, os haESCs são uma ferramenta valiosa para manipular os genomas parentais separadamente. O uso de haESCs como substituto do esperma fornece uma vantagem notável para a edição de genomas na germe do rato. Um estudo recente combinou a edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9 com a aplicação de haESCs para a caracterização de regiões de impressão que são fundamentais para o desenvolvimento embrionário12. Este estudo analisou o papel do Rasgrf1-DMR em combinação com os H19-e IG-DMRsno desenvolvimento de camundongos bimaternais, e a função de 7 DMRs diferentes no desenvolvimento de camundongos bipaternos. O método de substituição de haESCs por espermatozoides formou a base para abordagens de triagem genética para identificar aminoácidos-chave dentro da proteína DND1 no desenvolvimento de células germinativas primordiais e para a identificação de genes no desenvolvimento ósseo24,25,26. Estudos sobre impressão genômica e triagem genética para identificar fatores-chave no desenvolvimento embrionário são abordagens consideráveis para a aplicação de haESCs como genomas gameticos.

Nos mamíferos, os gametas são as únicas células que transmitem informações genéticas para a próxima geração. A fusão de um oócito e um espermatozoide forma um zigoto diploide que se desenvolve em um animal adulto. Mutações em genomas gameticos são, assim, herdadas pela prole e impulsionam a variação genética na espécie1. A introdução de mutações na linha germinal tem sido aplicada para produzir animais geneticamente modificados para diversos estudos biológicos, incluindo a caracterização da função genética e modelagem de doenças. Tanto os oócitos quanto os espermatozoides são células terminais diferenciadas e altamente especializadas que cessaram a proliferação. Portanto, a modificação direta dos gametas é tecnicamente difícil, e abordagens especializadas foram desenvolvidas. Modificações genéticas podem ser introduzidas na germeina do camundongo pela injeção de ESCs geneticamente modificados em blastocistos, onde eles se integram ao embrião em desenvolvimento e colonizam a linha germinal. Além disso, a modificação genética de zigotos usando abordagens de edição de genomas, incluindo o sistema CRISPR/Cas9, tornou-se amplamente adotada2.
Recentemente, foi relatada uma abordagem excepcional, que aplica haESCs como substituto de um genoma gametico3,4,5,6,7,8. HaESCs são linhas de células-tronco derivadas da massa celular interna de blastocistos haploíides partehenogenéticos ou androgenéticos e possuem um único conjunto de cromossomos4,7,9,10. Foi demonstrado que tanto haESCs partehenogenéticas quanto androgenéticas podem contribuir para o genoma de camundongos semi-clonados após injeção intracytoplasmática em oócitos. Em contraste com outras abordagens, os genomas dos haESCs podem ser diretamente modificados na cultura devido à sua capacidade de auto-renovação. Introduzir modificações genéticas na linha germinal substituindo o esperma por haESCs é um método importante para estudos biológicos. Prevê a possibilidade de cultura separada e manipulação do genoma materno ou paterno, derivado de haESCs partenogenéticas ou androgenéticas, respectivamente. Os HaESCs podem então ser usados como substituição de genoma gametico, o que é especialmente vantajoso para estudos de impressão genômica, expressão específica de alelo e processos específicos dos pais.
Em camundongos, informações genômicas maternas e paternas são necessárias para o desenvolvimento normal de embriões11. Portanto, os filhotes a termo não puderam ser obtidos quando haESCs (phaESCs) do tipo selvagem foram injetados para substituir o genoma do esperma5,8. Para superar o bloco de desenvolvimento, a impressão genômica do genoma materno das haESCs partehenogenéticas precisa ser corrigida para uma configuração paterna. Isso pode ser conseguido através da manipulação das regiões diferencialmente metiladas (DMRs). Até o momento, foram estudadas supressões direcionadas dos H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR para reprimir genes expressos maternamente nos phaESCs3,5,8,12. Estes estudos demonstraram que as exclusões tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR são suficientes para converter uma mãe em uma configuração de impressão paterna que pode substituir os cromossomos do esperma. A injeção intracytoplasmática de phaESCs que transportam as duas exclusões de DMR em oócitos produziu filhotes semi-clonados com uma frequência entre 5,1% e 15,5% dos embriões transferidos de 2 células.
Este protocolo baseia-se na aplicação de phaESCs com exclusões tanto de H19-DMR quanto IG-DMR, que chamamos de phaESCs duplo-knockout (DKO-phaESCs). Fornecemos instruções detalhadas para a modificação da impressão genômica em phaESCs para estabelecer linhas DKO-phaESC, para a injeção de DKO-phaESCs em oócitos como um substituto para um genoma de espermatozoides, para a cultura de embriões semi-clonados para blastocistos, e para a obtenção de camundongos semi-clonados. Este protocolo é uma referência para pesquisadores que requerem manipulação precisa e direta do genoma paterno e geração de embriões e camundongos semi-clonados.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td>188271 haCultura ESC Placa</td></tr><tr><td>de 12 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC Placa de 24 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>BSA fração</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axônio</td><td>1386</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC Solução de demecolcina</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC DR4 camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Meio de congelamento</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC </td></tr><tr><td>cultura Gelatina</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Solução de hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>MEF irradiado</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>LIF (Fator inibidor da leucemia)</td> <td>(caseiro)</td><td>-</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Reagente de lipofecção</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>cultura ESC</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axônio</td><td>1408</td><td>haCaneta de cultura ESC</td></tr><tr><td>Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC piggyBac plasmídeo carregando um transgene CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haCultura</td></tr><tr><td>ESC piggyBac plasmídeo transposase</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haCultura</td></tr> <tr>ESC<td>plasmídeo pX330</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>plasmídeo pX458</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haCultura ESC</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC cultura</td></tr><tr><td>DNA polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axônio</td><td>A3830</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotipagem</td></tr><tr><td>Tubo de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Tubo de 5 mL com tampa de filtro de célula</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>calibre 30 agulha de 1/2 polegada</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>B6D2F1 camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD saúde animal</td><td>49451</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 UI</td><td>Superovulação</td></tr><tr><td>prato de 10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Placa de 4 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Prato de 6 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Manipulação</td></tr> <tr>de embriões<td>Prato de poço central</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Balancim digital</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>M16 médio</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>M2 médio</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Cloreto de estrôncio</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Manipulação de embriões</td></tr><tr><td>5ml seringa</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Cápsula de vidro borossilicato</td><td>Produto científico</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Segurando pipeta</td><td>Instrumentos</td> <td>Biomédicos-Microinjeção</td><td></td></tr> <tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Pipeta de microinjeção</td><td>Instrumentos Biomédicos-Microinjeção</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pontas de microlaoder</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Braços micromanipuladores</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>PVP (Polivinilpirrolidina)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjeção</td></tr><tr><td>Seringa filtro</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

aplicação de células-tronco embrionárias haploid partehenogenéticas do rato como um substituto do esperma

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Em organismos com reprodução sexual, as células germinativas são a fonte de células totipotentes que se desenvolvem em novos indivíduos. Em camundongos, a fertilização de um oócito por um espermatozoide cria um zigoto totipotent. Recentemente, várias publicações relataram que células-tronco embrionárias haploides (haESCs) podem ser um substituto para genomas gameticos e contribuir para embriões, que se desenvolvem em camundongos. Aqui, apresentamos um protocolo para aplicar haESCs partenogenética como um substituto do esperma para construir embriões por injeção intracytoplasmática em oócitos. Este protocolo consiste em etapas para preparar haESCs como substituição de espermatozoides, para injeção de cromossomos haESC em oócitos, e para a cultura de embriões semi-clonados. Os embriões podem produzir camundongos semi-clonados férteis após a transferência de embriões. O uso de haESCs como substituição de esperma facilita a edição de genomas na linha germinal, estudos de desenvolvimento embrionário e investigação de impressão genômica.

O objetivo deste protocolo é aplicar haESCs como substituto de espermatozoides para obter embriões e camundongos semi-clonados. Para isso, foi gerada e utilizada uma linha DKO-phaESC que transportava o transgene CAG-EGFP para injeção intracytoplasmática em oócitos MII. Para obter uma linha phaESC adequada com uma configuração de impressão paterna, realizamos engenharia genética utilizando núcleos Cas9. Uma linha ESC haploide contém células haploides e diploides que surgem devido a uma tendência inerente de ESCs haploides para diploidização10. Um conjunto de cromossomos haploides é um pré-requisito para a substituição bem sucedida do genoma do esperma. A análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo mostra a distribuição de células haploides e diploides nas fases G0/G1-, S e G2/M(Figura 2A).
Para estabelecer as linhas DKO-phaESC, as linhas phaESC do tipo selvagem foram transfeinadas com construções transposon piggyBac para expressão transgênica estável e com plasmídeos CRISPR/Cas9 para obtenção de exclusões do H19- e IG-DMRs. Para excluir ESCs diploides e isolar apenas ESCs haploides expressando EGFP, foi definido um portão de tipo específico(Figura 2A). Células eGFP-positivas haploides únicas foram então emplacar em poços individuais de placas de 96 poços para obter sub-clones. Os alimentadores MEF foram utilizados para aumentar a eficiência do revestimento e a sobrevivência dos phaESCs transfectados. Após a expansão das culturas, uma rodada inicial de genotipagem foi realizada pelo PCR para identificar sub-clones que carregam exclusões de ambas as DMRs. Após a retirada dos alimentadores mef das culturas, um segundo genotipo foi realizado para confirmar a ausência de alelos do tipo selvagem no H19- e IG-DMRs(Figura 2B). De um total de 135 sub-clones, obtivemos 5 linhas haploid DKO-phESC que carregavam os alelos excluídos e estavam livres de alelos wildtype tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR.
Um transgene CAG-EGFP foi introduzido em DKO-phaESCs para estudar sua contribuição para embriões semi-clonados por visualização de fluorescência verde sob um microscópio(Figura 3A). Para a injeção intracytoplasmática, dko-phaESCs foram tratados com demecolcina para prendê-los em fase M. Assim, o ciclo celular de DKO-phaESCs foi sincronizado com o dos oócitos MII. A análise da citometria de fluxo mostrou 2 populações correspondentes à fase G2/M presas em células haploides (2n) e diploides (4n) após o tratamento com demecolcina (Figura 3B). A ausência do pico haploide de 1n indicou que a prisão do ciclo celular estava em grande parte completa. Os ESCs haploides da fase M foram então classificados e injetados em oócitos. Para isso, um único DKO-phaESC foi carregado na pipeta de microinjeção e injetado no citoplasma de um oócito MII(Figura 3C). A membrana plasmática do DKO-phaESC foi rompida por tubulação na ponta da pipeta de microinjeção.
Após a injeção, a expressão EGFP raramente foi detectada nos embriões semi-clonados construídos, pois o citoplasma dos DKO-phaESCs havia se dispersado no grande citoplasma do oócito (Figura 3D). Em casos raros, uma mancha redonda de intensa expressão EGFP poderia ser observada dentro do ooplasma. Esta observação foi provavelmente causada pela injeção inadvertida de DKO-phaESCs intactos. A falha na ruptura da membrana celular DKO-phaESC provavelmente não é compatível com o desenvolvimento de embriões e deve ser evitada. Uma hora após a injeção, os embriões foram ativados pelo tratamento com cloreto de estrôncio18. Seis horas após o início da ativação, até 3 corpos polares foram observados sob o microscópio (Figura 3E). Estes corpos polares correspondem ao primeiro e segundo corpos polares do oócito e a um corpo pseudo polar do DKO-phaESC7. Além disso, dois pronucleis foram observados sob um microscópio de contraste de interferência diferencial, que se assemelhava ao estágio pronuclear de zigotos após fertilização normal com espermatozoides.
Para demonstrar competência de desenvolvimento, embriões semi-clonados foram cultivados até o estágio blastocisto(Figura 5A). Além disso, um camundongo a termo foi obtido após a transferência de embriões semi-clonados de estágio de 2 células para os ovidutos de uma fêmea receptora(Figura 5B). Como esperado, o rato derivado de um embrião semi-clonado era uma fêmea, pois nem oócitos nem phaESCs derivados de oócitos carregam um cromossomo Y. O rato semi-clonado era excessivamente normal e produzia descendentes saudáveis quando acasalado com um macho webster suíço selvagem. Até agora, o rato semi-clonado está vivo há mais de 600 dias sem problemas de saúde aparentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figura 1: Visão geral da aplicação de DKO-phaESCs como substituição de espermatozoides. (A) Um período de tempo dos procedimentos do protocolo. (B) O esquema mostra as etapas para estabelecer linhas DKO-phaESC (etapas 1-6). (C) O esquema mostra os passos para construir embriões semi-clonados por injeção intracytoplasmática de um DKO-phaESC em um oócito MII (passos 7-14). Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; MEF = fibroblasto embrionário de camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figura 2: Estabelecimento de linhas DKO-phaESC por exclusões mediadas por CRISPR/Cas9 de H19- e IG-DMRs. (A) Análise da citometria de fluxo de phaESCs após a transfecção com plasmídeos piggyBac para expressão estável EGFP e com 4 plasmídeos CRISPR/Cas9. Os phaESCs não transfectados são mostrados como controle. O perfil de DNA (topo) mostra a distribuição do ciclo celular das células haploides e diploides. As células haploides da fase G1/S expressando EGFP são indicadas pelo portão verde (inferior, à direita). (B) Genotipagem de sub-clones phaESC que foram cultivados em MEFs (primeiro genotipagem) e após a remoção de MEFs (segunda genotipagem). As linhas phaESC sub clonadas 1, 2, 3 e 4 representam células do tipo selvagem, células com exclusão H19-DMR, com exclusão IG-DMR, e com exclusões combinadas de H19- e IG-DMR,respectivamente. As linhas DKO-phaESC 5-8 possuem exclusões H19-DMR e IG-DMRe estão livres de alelos do tipo selvagem. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; DMR = região diferencialmente metilada; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; WT = tipo selvagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figura 3: Injeção de DKO-phaESCs presos mitoticamente em oócitos MII. (A) Morfologia de uma cultura DKO-phaESC que carrega um transgene CAG-EGFP e exclusões dos DMRs H19 e IG; barra de escala = 50 μm. (B) Análise representativa da citometria de fluxo de DKO-phaESCs após a detenção com demecolcina por 8 h. DKO-phaESCs sem tratamento demecolcina são mostrados como controle. (C) Morfologia de DKO-phaESCs na pipeta de microinjeção. Um único DKO-phaESC intacto antes (esquerda) e depois (direita) rompendo a membrana plasmática por tubulação é mostrado; barra de escala = 20 μm. (D) Embriões construídos a 1 h após a injeção de DKO-phaESCs em oócitos MII. Uma imagem mesclada de fluorescência EGFP e campo brilhante é mostrada. Pontas de flecha pretas indicam pontos redondos de intensa expressão EGFP após a injeção de DKO-phaESCs intactos, que devem ser evitados; barra de escala = 50 μm. (E) Uma imagem de contraste de interferência diferencial de embriões semi-clonados 6 h após o início da ativação com cloreto de estrôncio é mostrada. Pontas de flechas brancas indicam embriões com 3 corpos polares, incluindo um corpo pseudo polar do DKO-phaESC injetado; barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figura 4: Esquema da configuração para injeção intracytoplasmática de DKO-phaESCs em oócitos. (A) O arranjo de uma pipeta de injeção, uma pipeta de retenção e um oócito na câmara de injeção é mostrado. α, ângulo de dobra da pipeta de microinjeção. (B) Layout das gotas na antena de micromanipulação para injeção intracytoplasmática. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figura 5: Desenvolvimento de embriões semi-clonados. (A) Desenvolvimento de pré-implantação de embriões semi-clonados in vitro. A expressão EGFP é inicialmente observada em embriões de quatro células no dia 2 após injeção intracytoplasmática. No dia 4, a expressão intensa do EGFP pode ser observada em blastocistos; barra de escala = 100 μm. (B) Um rato semi-clonado obtido após a transferência de embrião de 2 células para uma fêmea receptora. Aos 74 dpp, o rato semi-clonado (ponta de flecha) entregou seus primeiros filhotes (asterisco) por nascimento natural após o acasalamento com um macho suíço webster selvagem. Embriões semi-clonados e o camundongo semi-clonado mostrado nesta figura são idênticos aos relatados em Aizawa et al.3. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; .dpp, dias pós-parto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Solução de gelatina</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>gelatina</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Célula-tronco embrionária haploide (HaESC) média</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 UI/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 UI/mL</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de manutenção HaESC</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio HaESC</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Solução HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de lavagem</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fração BSA</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio MEF</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoetanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de lise</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Solução SDS</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio de ativação</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Rio KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de estrôncio</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8.0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Solução PVP</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio M2</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Solução PMSG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">solução hCG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>hCG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio de hialuronidase</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio M2</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hialuronidase</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abreviaturas: LIF = fator inibidor da leucemia; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = soro bovino fetal; DMEM = Meio águia modificada de Dulbecco; BSA = albumina de soro bovino;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = ácido etilenodiaminetetraacético; SDS = dodecylsulfato de sódio; EGTA = ácido tetraacético e egta = etileno-bis (oxyethylenenitrilo)tetraacético;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; PVP = polivinylpyrrolidone; hCG = gonadotropina coriônica humana;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = égua grávida gonadotropina.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Receita de meio, tampão e solução.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td colspan="2">Sequência (5' a 3')</td>
			<td>aplicação</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Lista de oligonucleotídeos.

Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso de células-tronco embrionárias haploides partehenogenéticas como um substituto para o esperma para a construção de embriões semi-clonados.

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Este protocolo data falsamente a modificação do imprinting genômico em células-tronco embrionárias de camundongos haplóides, como o de nosso sujeito devido a espermatozóides falsos, permitindo a geração de embriões caseiros em camundongos. A modificação genética de um gameta geralmente requer técnicas difíceis. Usando essa metodologia, os gametas parentais podem ser manipulados em células-tronco embrionárias híbridas para posterior introdução em camundongos como uma opção de substituição de espermatozoides.Como este método permite nossa modificação específica artificial de um gameta paterno em embriões, é particularmente aplicável ao estudo de impressão genômica e cauterização. Demonstrando este procedimento estará Charles Etienne Dumeau, um embriologista de camundongos do meu laboratório. Para preparar pipetas de retenção e microinjeção para o experimento, primeiro use um extrator de micropipeta para puxar os capilares de vidro borossilicato com formato alongado e conicidade gradual.Para preparar pipetas de retenção, posicione um capilar puxado com um diâmetro externo de 60 a 100 micrômetros em uma microforja sobre o grânulo de vidro no filamento. Ligue o filamento e abaixe o capilar até que ele entre em contato com o cordão. Quando o capilar estiver preso ao cordão, desligue o filamento e retraia o capilar, fazendo com que o capilar se quebre com uma extremidade reta.Em seguida, posicione a ponta capilar quebrada horizontalmente ao lado da conta de vidro no filamento e aqueça o filamento para derreter a extremidade até que o diâmetro interno da ponta capilar atinja 10 a 20 micrômetros de diâmetro. Em seguida, posicione o capilar acima da conta de vidro a aproximadamente um milímetro da ponta e aqueça o filamento para permitir que o capilar seja dobrado em um ângulo de 20 graus. Para preparar uma pipeta de microinjeção, posicione um capilar puxado com um diâmetro externo de cerca de seis micrômetros acima do grânulo de vidro no filamento aquecido e abaixe o capilar até que ele entre em contato com o grânulo.Uma vez que o capilar esteja fixado, desligue o filamento e retraia o capilar. O capilar se romperá com uma extremidade reta. Em seguida, mova o capilar sobre o grânulo de vidro aproximadamente um milímetro da ponta do capilar e aqueça o filamento para permitir que o capilar seja dobrado em um ângulo de 20 graus.Para realizar uma injeção intracitoplasmática, coloque cinco gotas de microlitro de solução de PVP e gotas de 20 microlitros de meio M2 na tampa de cabeça para baixo de um prato de 10 centímetros e cubra as gotas com óleo mineral. Coloque o prato no palco e instale uma pipeta de retenção no micromanipulador. Use uma ponta de micro carregador para encher a pipeta de microinjeção com óleo de fluorocarbono e monte a pipeta no atuador piezoelétrico.Observando através do microscópio, abaixe a pipeta de microinjeção em uma gota de solução de PVP. Quando a pipeta estiver imersa, pipete para cima e para baixo várias vezes para revestir o vidro com o PVP. Coloque um pequeno volume de solução de PVP na pipeta de microinjeção.Mergulhe as pipetas de microinjeção e retenção no meio M2 e concentre-se na pipeta na parte inferior da gota. Transfira aproximadamente dois microlitros da suspensão de células ES partogênicas nocaute duplo para a gota média M2 e use uma pipeta bucal para transferir 10 oócitos M2 para a mesma gota. Gire um oócitos e aplique pressão negativa através da pipeta de retenção para segurar o oócito de modo que o espaço perivitelino fique voltado para a pipeta de microinjeção, tomando cuidado para que a placa metafásica dois não fique posicionada no caminho da pipeta de microinjeção.Puxe uma célula ES partogênica de nocaute duplo na ponta da pipeta de microinjeção e confirme a ruptura da membrana celular. Aplique uma leve pressão negativa na pipeta de microinjeção e forneça quatro impulsos piezoelétricos enquanto empurra a ponta da pipeta de microinjeção em direção ao espaço perivitelino para romper a zona pelúcida. Penetre no oócito com uma pipeta de microinjeção para que o oolema se estique para o lado oposto e aplique um pulso piezo para perfurar o oolema, certificando-se de que o oolema relaxa ao longo da haste da pipeta de microinjeção.Injete a célula ES partogênica de nocaute duplo com um volume mínimo de meio no ooplasma e retire a pipeta de microinjeção suavemente do oócito. Solte o oócito injetado da pipeta de retenção e mova-o para o lado da microgota para coleta posterior. Quando todos os oócitos tiverem sido injetados, transfira os oócitos para uma placa de poço central pré-aquecida contendo meio KSOM e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora antes da ativação.A análise do conteúdo de DNA desta linhagem celular ES partogênica nocaute duplo representativa, carregando o transgene CAG/EGFP por citometria de fluxo, ilustra a distribuição de células haplóides e diplóides nas fases G0, G1, S e G2 M. A genotipagem pode ser realizada para confirmar a ausência de alelos do tipo selvagem nas regiões H19 e intergênicas diferencialmente metiladas. Um transgene CAG / EGFP pode ser introduzido em células ES patogênicas de nocaute duplo para estudar sua contribuição para embriões semiclonados pela visualização de fluorescência verde sob um microscópio.A análise por citometria de fluxo mostra que duas populações correspondentes à fase G2 M prenderam células haplóides e diplóides após o tratamento com demuculceno. A ausência de um pico haplóide 1N indica que o ciclo de repouso da célula estava praticamente completo. Após a injeção, a expressão de EGFP raramente é detectada nos embriões semiclonados construídos.à medida que o citoplasma das células ES partogênicas nocaute duplo se dispersa no grande citoplasma do oócito. Seis horas após a ativação, até três corpos polares podem ser observados ao microscópio. O primeiro e o segundo corpos polares do oócito e um corpo pseudopolar do ESC haplóide.Para demonstrar sua competência de desenvolvimento, embriões semiclonados podem ser cultivados até o estágio de blastócito. Além disso, camundongos fêmeas a termo podem ser obtidos a partir de embriões semiclonados em estágio de duas células transferidos para os ovidutos de fêmeas receptoras. Durante a microinjeção, é importante romper a membrana plasmática das células-tronco embrionárias haplóides, pois ela atua para evitar a segregação cromossômica quando o oócito é ativado.Em vez de células ES haploides partenogenéticas, células ES haplóides androgênicas também podem ser usadas. permitindo que o gameta materno ou paterno seja selecionado como substituto do esperma, dependendo do objetivo do estudo.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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