Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

Este protocolo data falsamente a modificação do imprinting genômico em células-tronco embrionárias de camundongos haplóides, como o de nosso sujeito devido a espermatozóides falsos, permitindo a geração de embriões caseiros em camundongos. A modificação genética de um gameta geralmente requer técnicas difíceis. Usando essa metodologia, os gametas parentais podem ser manipulados em células-tronco embrionárias híbridas para posterior introdução em camundongos como uma opção de substituição de espermatozoides.

Como este método permite nossa modificação específica artificial de um gameta paterno em embriões, é particularmente aplicável ao estudo de impressão genômica e cauterização. Demonstrando este procedimento estará Charles Etienne Dumeau, um embriologista de camundongos do meu laboratório. Para preparar pipetas de retenção e microinjeção para o experimento, primeiro use um extrator de micropipeta para puxar os capilares de vidro borossilicato com formato alongado e conicidade gradual.

Para preparar pipetas de retenção, posicione um capilar puxado com um diâmetro externo de 60 a 100 micrômetros em uma microforja sobre o grânulo de vidro no filamento. Ligue o filamento e abaixe o capilar até que ele entre em contato com o cordão. Quando o capilar estiver preso ao cordão, desligue o filamento e retraia o capilar, fazendo com que o capilar se quebre com uma extremidade reta.

Em seguida, posicione a ponta capilar quebrada horizontalmente ao lado da conta de vidro no filamento e aqueça o filamento para derreter a extremidade até que o diâmetro interno da ponta capilar atinja 10 a 20 micrômetros de diâmetro. Em seguida, posicione o capilar acima da conta de vidro a aproximadamente um milímetro da ponta e aqueça o filamento para permitir que o capilar seja dobrado em um ângulo de 20 graus. Para preparar uma pipeta de microinjeção, posicione um capilar puxado com um diâmetro externo de cerca de seis micrômetros acima do grânulo de vidro no filamento aquecido e abaixe o capilar até que ele entre em contato com o grânulo.

Uma vez que o capilar esteja fixado, desligue o filamento e retraia o capilar. O capilar se romperá com uma extremidade reta. Em seguida, mova o capilar sobre o grânulo de vidro aproximadamente um milímetro da ponta do capilar e aqueça o filamento para permitir que o capilar seja dobrado em um ângulo de 20 graus.

Para realizar uma injeção intracitoplasmática, coloque cinco gotas de microlitro de solução de PVP e gotas de 20 microlitros de meio M2 na tampa de cabeça para baixo de um prato de 10 centímetros e cubra as gotas com óleo mineral. Coloque o prato no palco e instale uma pipeta de retenção no micromanipulador. Use uma ponta de micro carregador para encher a pipeta de microinjeção com óleo de fluorocarbono e monte a pipeta no atuador piezoelétrico.

Observando através do microscópio, abaixe a pipeta de microinjeção em uma gota de solução de PVP. Quando a pipeta estiver imersa, pipete para cima e para baixo várias vezes para revestir o vidro com o PVP. Coloque um pequeno volume de solução de PVP na pipeta de microinjeção.

Mergulhe as pipetas de microinjeção e retenção no meio M2 e concentre-se na pipeta na parte inferior da gota. Transfira aproximadamente dois microlitros da suspensão de células ES partogênicas nocaute duplo para a gota média M2 e use uma pipeta bucal para transferir 10 oócitos M2 para a mesma gota. Gire um oócitos e aplique pressão negativa através da pipeta de retenção para segurar o oócito de modo que o espaço perivitelino fique voltado para a pipeta de microinjeção, tomando cuidado para que a placa metafásica dois não fique posicionada no caminho da pipeta de microinjeção.

Puxe uma célula ES partogênica de nocaute duplo na ponta da pipeta de microinjeção e confirme a ruptura da membrana celular. Aplique uma leve pressão negativa na pipeta de microinjeção e forneça quatro impulsos piezoelétricos enquanto empurra a ponta da pipeta de microinjeção em direção ao espaço perivitelino para romper a zona pelúcida. Penetre no oócito com uma pipeta de microinjeção para que o oolema se estique para o lado oposto e aplique um pulso piezo para perfurar o oolema, certificando-se de que o oolema relaxa ao longo da haste da pipeta de microinjeção.

Injete a célula ES partogênica de nocaute duplo com um volume mínimo de meio no ooplasma e retire a pipeta de microinjeção suavemente do oócito. Solte o oócito injetado da pipeta de retenção e mova-o para o lado da microgota para coleta posterior. Quando todos os oócitos tiverem sido injetados, transfira os oócitos para uma placa de poço central pré-aquecida contendo meio KSOM e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora antes da ativação.

A análise do conteúdo de DNA desta linhagem celular ES partogênica nocaute duplo representativa, carregando o transgene CAG/EGFP por citometria de fluxo, ilustra a distribuição de células haplóides e diplóides nas fases G0, G1, S e G2 M. A genotipagem pode ser realizada para confirmar a ausência de alelos do tipo selvagem nas regiões H19 e intergênicas diferencialmente metiladas. Um transgene CAG / EGFP pode ser introduzido em células ES patogênicas de nocaute duplo para estudar sua contribuição para embriões semiclonados pela visualização de fluorescência verde sob um microscópio.

A análise por citometria de fluxo mostra que duas populações correspondentes à fase G2 M prenderam células haplóides e diplóides após o tratamento com demuculceno. A ausência de um pico haplóide 1N indica que o ciclo de repouso da célula estava praticamente completo. Após a injeção, a expressão de EGFP raramente é detectada nos embriões semiclonados construídos.

à medida que o citoplasma das células ES partogênicas nocaute duplo se dispersa no grande citoplasma do oócito. Seis horas após a ativação, até três corpos polares podem ser observados ao microscópio. O primeiro e o segundo corpos polares do oócito e um corpo pseudopolar do ESC haplóide.

Para demonstrar sua competência de desenvolvimento, embriões semiclonados podem ser cultivados até o estágio de blastócito. Além disso, camundongos fêmeas a termo podem ser obtidos a partir de embriões semiclonados em estágio de duas células transferidos para os ovidutos de fêmeas receptoras. Durante a microinjeção, é importante romper a membrana plasmática das células-tronco embrionárias haplóides, pois ela atua para evitar a segregação cromossômica quando o oócito é ativado.

Em vez de células ES haploides partenogenéticas, células ES haplóides androgênicas também podem ser usadas. permitindo que o gameta materno ou paterno seja selecionado como substituto do esperma, dependendo do objetivo do estudo.