CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Esta técnica é benéfica para a introdução de mutações precisas em C. elegans por edição do genoma CRISPR / Cas9 em um curto espaço de tempo. Essa técnica fornece uma maneira eficiente e simplificada de editar o genoma de C. elegans, pois o uso de um marcador Co-CRISPR melhora muito a probabilidade de identificar vermes editados positivamente. Certifique-se de praticar a realização das microinjeções e injetar ambos os braços das gônadas do maior número possível de vermes para aumentar as chances de obter as edições desejadas.

Demonstrando o procedimento estarão Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith e Carter Dierlam, todos estudantes de graduação do meu laboratório. Para preparar vermes adultos jovens para injeção, escolha C.elegans de estágio L2, L3 em um gramado bacteriano fresco em uma placa MYOB e incube a placa a 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, prepare a mistura de injeção conforme descrito na tabela em tubos estéreis sem nuclease e misture por pipetagem.

Incube a mistura de injeção a 37 graus Celsius por 15 minutos para montar os complexos de ribonucleoproteínas antes de girar a mistura por centrifugação. Em seguida, use um microscópio de dissecação para escolher cerca de 30 vermes adultos jovens com menos de 10 embriões no útero e injete ambos os braços das gônadas de cada verme com alguns picolitros de mistura de injeção por braço. Após a microinjeção, use um aparelho de recuperação para pipetar suavemente os vermes injetados da almofada de injeção em uma placa MYOB de 60 milímetros semeada com OP50 E.coli.

Deixe os vermes injetados se recuperarem por uma hora em temperatura ambiente. No final do período de recuperação, use uma picareta de fio de platina para transferir cada verme injetado para uma única placa de ágar MYOB de 35 milímetros semeada e permita que os vermes ponham ovos a 20 graus Celsius. Após 24 horas, transfira os vermes injetados para novas placas individuais de 35 milímetros.

Por três a quatro dias após a injeção, use um microscópio de dissecação para identificar placas que tenham progênie F1 exibindo fenótipos de rolo, conforme indicado pelo corpo do animal girando em torno de seu eixo longo à medida que os animais se movem em um padrão circular, e fenótipos atarracados, como evidenciado por uma fisiologia mais curta e robusta em comparação com animais de controle no mesmo estágio de desenvolvimento. Transfira 50 a 100 vermes F1 para suas próprias placas individuais e deixe os vermes botarem ovos por um a dois dias. Após um a dois dias de produção de vermes F2, transfira cada mãe de rolo F1 de uma placa numerada para seu tubo de PCR numerado correspondente contendo 2,5 microlitros de tampão de lise suplementado com uma diluição de 1:100 de 20 miligramas por mililitro de proteinase K. Congele os tubos a menos 30 graus Celsius por 20 minutos antes de lisar os vermes em um termociclador, conforme indicado.

No final do ciclo, adicione 12,5 microlitros de mistura de PCR 2X contendo trifosfatos de desoxinucleosídeos, DNA polimerase, cloreto de magnésio e corante de carga, um microlitro de primer direto de 10 micromolares, um microlitro de primer reverso de 10 micromolares e água estéril suficiente para levar a mistura de reação a 25 microlitros por cada amostra de verme lisado. Em seguida, execute as amostras no termociclador conforme indicado. Para rastrear edições com menos de 50 pares de bases de comprimento, transfira 10 microlitros de cada reação de PCR para um novo tubo e adicione cinco microlitros da mistura mestre de digestão de restrição a cada tubo.

Incube as reações de digestão a 37 graus Celsius por duas horas. No final da incubação, aqueça e ative as digestões com uma incubação de 10 a 15 minutos a 65 graus Celsius. Em seguida, carregue toda a reação de cada tubo em um único poço de um gel de agarose de 1% a 2% e execute o gel a 110 miliamperes até que a separação adequada da banda seja alcançada.

No final da corrida, visualize géis de agarose sob luz ultravioleta para detectar os tamanhos das bandas de DNA. Vermes editados positivamente exibirão uma banda extra de DNA no tamanho esperado devido à edição usando o modelo de reparo, carregando o local de restrição no locus desejado dentro do genoma do verme. Escolha de oito a 12 vermes F2 não rolantes de aparência selvagem das respectivas placas de vermes F1 editados positivamente e permita que os vermes ponham ovos e produzam progênie por um a dois dias.

Em seguida, identifique as linhas de vermes homozigóticas conforme demonstrado para vermes editados positivamente e analise os resultados do sequenciamento usando um software de análise de sequência para confirmar a presença da edição de acordo com os protocolos padrão. Aqui, o DNA genômico e o RNA CRISPR projetado e o modelo de reparo para o gene C.elegans rbm-3.2 podem ser observados. Nesta análise representativa, sete dos 73 vermes F1 foram considerados positivos para a edição.

Os vermes não editados exibiram o fragmento de DNA único de 445 pares de bases após a digestão do EcoRI, enquanto os vermes portadores de um códon de parada prematuro no gene rbm-3.2 exibiram dois fragmentos em 265 e 166 pares de bases após a digestão do EcoRI. Vermes editados heterozigotos exibiram três fragmentos após a digestão de EcoRI. Seis dos 12 vermes F2 dos heterozigotos F1 positivos identificados foram considerados homozigotos para a edição de interesse.

O DNA genômico de uma linha de vermes editada homozigótica identificada poderia então ser usado para configurar uma reação de sequenciamento de DNA, que confirmou a presença da edição em seu estado homozigoto. Tome cuidado para que os reagentes de edição e os primers de triagem sejam projetados corretamente e que a mistura de injeção seja preparada adequadamente. Uma microinjeção precisa também é crítica.

Após este procedimento, a validação fenotípica da edição, se aplicável, e a análise da expressão gênica e proteica podem ser realizadas para verificar a precisão da edição do genoma.