Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização
10 de abril de 2021
Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.
A neovascularização, a geração de novos vasos sanguíneos é um processo altamente regulado em eventos normais e patológicos. Para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Desenvolvemos um chip microfluido e controle automático.
Circulações altamente eficientes são feitas para formar micro-tubos de perfusão e simular o uso da proteína para recapitular ao evento inicial de nova vascularização. O chip de brotação microfluida era composto por três canais. Um canal de cultura celular endotelial e um canal líquido foram separados por um amplo canal de hidrogel central.
O sistema de controle microfluido consistia em uma bomba de microsiringe e válvula de beliscão eletromagnética. Um chip de armadilha de bolhas, um chip de brotação microfluido, uma bomba micro-peristáltica, e um reservatório de cultura média. Com um sistema microfluido, as células endoteliais poderiam ser estimuladas por alto estresse luminal, nível fisiológico de fluxo transendotelial e várias distribuições de fatores de crescimento endotelial vascular simultaneamente.
Pipeta 20 microliter de 125 microgramas por mililitro de fibronectina em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Corte uma ponta de pipeta para caber no canal de cultura de células com uma tesoura. Insira a ponta pipeta no outro porta de injeção de mídia do canal de cultura celular.
Em seguida, pipeta fora ar do canal de cultura celular para preenchê-lo com fibronectina. Incubar os chips a 37 graus Celsius por uma hora. Antes da semeadura celular, pipeta 20 microliter de meio celular endotelial em cada porta de injeção de mídia e incubar os chips a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Então, pipeta toda a mídia em todas as portas de injeção de mídia. Em seguida, pipeta cinco microliter de suspensão celular em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, as células endoteliais rapidamente se espalham por todo o canal sob pressão hidrostática diferencial.
Adicione cerca de quatro a seis microliter de mídia ECM à outra porta para ajustar a pressão hidrostática e parar o movimento da célula. Controle os chips para a incubadora de células. Em seguida, vire os chips a cada 30 minutos até que as células endoteliais se vestem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular, duas horas depois.
Use a ponta pipeta para remover as células anexadas nas portas de injeção com muito cuidado. Em seguida, insira quatro adaptadores Luer femininos farpados nas portas de injeção de mídia e encha com mídia ECM. Remova os chips para a incubadora celular, troque a mídia ECM e os adaptadores Luer a cada 12 horas.
Para montar o sistema de controle microfluido, prepare dois tubos de politetrafluoroetileno, dois tubos curtos de silicone, três tubos de silicone longos, um adaptador luer feminino farpado, um conector tipo Y e, em seguida, três conectores tipo L. Encha a seringa com 10 mililitros de meio ECM pré-aquecido. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno à seringa por um adaptador luer fêmea farpado.
Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de politetrafluoroetileno a um conector do tipo Y. Em seguida, conecte dois tubos de silicone longos às outras duas extremidades do conector tipo Y. Usamos um tubo para conectar ao reservatório e ao outro tubo para conectar ao chip de armadilha de bolhas.
Conecte outro tubo de silicone longo ao reservatório. Em seguida, use dois tubos curtos de silicone para conectar todos os orifícios de entrada e saída na camada superior do chip de armadilha de bolhas. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno ao backend do chip.
Em seguida, conserte uma seringa na bomba de microsinga. Corte dois tubos de silicone longos na válvula de beliscão eletromagnética. Em seguida, troque a válvula de beliscão eletromagnética para abrir o gasoduto entre a seringa e o reservatório.
Injete mídia no reservatório usando a bomba de microsiringe para esgotar o ar no tubo. Em seguida, troque a válvula novamente para abrir o gasoduto entre a seringa e o chip de armadilha de bolhas. Injete mídia para encher a câmara líquida e o tubo de retroescadidade do chip de armadilha de bolhas.
Retire chips de broto endotelial da incubadora celular e remova os adaptadores luer no lado da cultura celular. Insira dois plugues de tubo nas portas de injeção de hidrogel do chip de brotação microfluida. Conecte o tubo back-end do chip bubble trap a uma porta de canal de cultura celular.
Insira um conector tipo T na outra porta e conecte-o ao tubo de silício longo conectado ao reservatório. Corte o tubo de silicone longo na bomba micro peristáltica. Em seguida, insira um filtro de ar no reservatório.
Em seguida, monte o chip de brotação microfluidic para a incubadora de topo do palco. Em seguida, conecte a bomba de vácuo aos orifícios na camada inferior do chip de armadilha de bolhas por um tubo TPU. Defina o volume de circulação oposto e uma taxa de fluxo no programa personalizado que controla a bomba de microsinga e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente.
Em seguida, configure a taxa de fluxo da bomba micro peristáltica. Ligue a bomba de microsiringe. Em seguida, o sistema de controle de circulação é estabelecido.
Testamos a função de barreira de alguns micro-vasos em nosso modelo medindo o coeficiente de permeabilidade difuso de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como é mostrado na figura, o coeficiente de permeabilidade difuso de chip de cultura estática com revestimento celular é de 0,1 mais ou menos 0,3 micrômetro por segundo. E o coeficiente de permeabilidade difusional do canal vazio sem forro celular é de 5,4 mais ou menos 0,7 micrômetros por segundo.
O ensaio de broto endotelial mostrou que as células endoteliais brotaram no hidrogel central em grande parte após 24 horas de cultivo estático, enquanto o grau de broto diminuiu significativamente com o aumento do estresse luminal da tesoura. Quantitativamente, o estresse da tesoura luminal diminuiu significativamente o broto endotelial em termos de área de broto, comprimento médio de broto e o maior comprimento de broto. Com nosso sistema, o estresse de cisalhamento nas células endoteliais pode ser alterado opcionalmente a qualquer momento durante o experimento, enquanto o fluxo transendotelial permaneceu em nível fisiológico.
Este modelo biomimético 3D in vitro pode ser diretamente aplicado ao estudo do mecanismo de neovasularização, e mantém a promessa potencial como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta o desenvolvimento de um modelo microfluídico 3D in vitro que replica as fases iniciais da neovascularização em condições fisiológicas. O modelo, denominado MIEN, integra um chip microfluídico de brotamento e um sistema de circulação automatizado para simular o microambiente biomecânico e bioquímico das células endoteliais (ECs) durante a neovascularização inicial. Esta plataforma permite controle preciso da tensão cisalhante luminal, fluxo transendotelial e gradientes do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fornecendo uma ferramenta valiosa para estudos mecanicistas e triagem de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vascular
- Engenharia de tecidos
- Microfluídica
Antecedentes
- A neovascularização é a formação de novos vasos sanguíneos a partir da vasculatura existente, fundamental em contextos fisiológicos e patológicos.
- O microambiente inicial ao qual as células endoteliais são expostas durante a neovascularização difere significativamente das fases posteriores.
- Os modelos existentes frequentemente não conseguem imitar com precisão as condições bioquímicas e biomecânicas iniciais da neovascularização.
- Existe uma necessidade de sistemas in vitro que recapitulem esses eventos iniciais para pesquisas mecanicistas e translacionais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo in vitro tridimensional que simule o processo inicial de neovascularização sob condições fisiológicas do microambiente.
- Permitir a aplicação controlada de tensão de cisalhamento, fluxo transendotelial e gradientes de VEGF em células endoteliais (ECs).
- Fornecer uma plataforma adequada para estudos mecanicistas e triagem de fármacos/toxicologia.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um chip microfluídico de brotamento com três canais: um canal de cultura de células endoteliais, um canal central de hidrogel e um canal líquido.
- Revestimento dos canais com fibronectina e semeadura de células endoteliais para formar um endotélio confluente.
- Montagem de um sistema de controle microfluídico automatizado incluindo bombas de seringa e peristálticas, captador de bolhas e controle de fluxo programável.
- Aplicação de tensão de cisalhamento luminal controlada, fluxo transendotelial fisiológico e gradientes de VEGF.
- Avaliação da função de barreira do vaso por meio de ensaios de permeabilidade com dextrano-FITC.
- Quantificação do brotamento endotelial sob diferentes condições de tensão de cisalhamento.
Resultados Principais
- O modelo formou com sucesso microcanais perfuráveis e endotelializados que imitam a neovascularização inicial.
- A função de barreira foi demonstrada por coeficientes de permeabilidade baixos em canais revestidos por células, comparados a canais vazios.
- O brotamento endotelial para dentro do hidrogel foi observado após 24 horas de cultivo estático.
- O aumento da tensão cisalhante luminal reduziu significativamente a extensão e o comprimento do brotamento endotelial.
- O sistema permitiu a modulação dinâmica da tensão cisalhante mantendo o fluxo transendotelial fisiológico.
Conclusões
- O modelo MIEN recapitula efetivamente o microambiente inicial da neovascularização in vitro.
- O estresse cisalhante é um regulador chave da brotamento endotelial neste contexto.
- Esta plataforma é promissora para estudos mecanicistas de neovascularização e como uma ferramenta de baixo custo para triagem de fármacos e toxicologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem da neovascularização em estágios iniciais é fundamental para reduzir os riscos associados a hipóteses sobre alvos vasculares e otimizar a confiança preditiva nos processos de descoberta de fármacos. A plataforma microfluídica MIEN permite a simulação precisa do microambiente vascular inicial, apoiando a investigação mecanicista e a avaliação quantitativa das respostas endoteliais. Essa capacidade aumenta a continuidade translacional e orienta a triagem de portfólios para terapêuticas direcionadas a alvos vasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a desmistificação mecanicista de alvos vasculares ao replicar gradientes fisiológicos de estresse cisalhante e de VEGF.
- Apóia a validação funcional do comportamento de células endoteliais sob condições microambientais controladas.
- Facilita a confiança preditiva em hipóteses iniciais de biologia vascular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma padronizada e reproduzível de ensaio tridimensional para avaliar os efeitos de compostos na brotação endotelial.
- Gera saídas quantitativas, como coeficientes de permeabilidade e métricas de brotamento, para comparação robusta.
- Permite triagem escalonável de candidatos a fármacos e perfis de toxicologia em um contexto fisiologicamente relevante.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com mecanismos vasculares relevantes para doenças, aprimorando estratégias translacionais de biomarcadores.
- Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, modelando eventos precoces de neovascularização.
- Reduz a ambiguidade biológica nas decisões de avanço pré-clínico de programas direcionados ao sistema vascular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo MIEN integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, triagem quantitativa e validação mecanicista de alvos vasculares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da manipulação controlada do microambiente.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas e reprodutíveis para avaliação de compostos e padronização de ensaios.
- Análises: Oferece leituras de permeabilidade e brotamento para comparar condições experimentais e subsidiar a tomada de decisões.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas in vitro com modelos vasculares pré-clínicos quando alinhados à relevância da doença.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para diversas aplicações em biologia vascular e triagem de fármacos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos vasculares.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios endoteliais e favorece a reprodutibilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital ao reduzir riscos em programas vasculares em estágios iniciais.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos direcionados a alvos vasculares.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microfluídica, cultura de células endoteliais e análise de ensaios quantitativos.
- Exige acesso a bombas programáveis, chips microfluídicos e infraestrutura de imagem.
- Exige padronização entre equipes no preparo dos ensaios e na interpretação dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes fontes de células endoteliais ou modelos de doenças.
- As limitações incluem restrições na produtividade e a necessidade de treinamento técnico especializado.
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