Name: Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a isolar e diferenciar preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos. Este método permite estudar a função adipocitária em obesidade e diabetes com maior precisão.

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Os autores agradecem a Cristina Godio no Centro Nacional de Biotecnología em Madrid, Espanha, Mari Gantner no The Scripps Research Institute, La Jolla, e Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins, baltimore, por assistência otimizando este protocolo com base no trabalho inicial de Kahn et al.18. Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH DK114785 e DK121196 para E.S.

Este protocolo segue todas as diretrizes da IACUC do Scripps Research Institute e da University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Coleta e digestão de depósitos adiposos (dia 1)
<ol><li>Prepare dois tubos de 1,5 mL para cada filhote: um para tecido adiposo marrom (BAT) e outro para tecido adiposo branco (WAT). Adicionar 250 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 200 μL de tampão de isolamento de 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 5 mM de glicose, 100 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido (HEPES), penicilina-estreptomicina, e 4% de albumina de soro bovino livre de ácido graxo) para cada tubo. Mantenha soluções estéreis e no gelo.</li>
	<li>Coloque os filhotes em pequenas câmaras (por exemplo, um poço de uma placa de 6 poços), e coloque-os no gelo até que eles se tornem hipotérmicos. Certifique-se de que não há contato direto entre os filhotes e o gelo. Pique uma pata com uma ponta para garantir a perda de consciência, e eutanásia os filhotes por decapitação usando tesoura afiada. NOTA: se trabalhar com genótipos diferentes, prepare um tubo adicional para coletar uma biópsia da cauda (corte de 3 mm) para genotipagem. Se a genotipagem for realizada imediatamente, mantenha os filhotes eutanizados no gelo até a dissecação para coletar depósitos adiposos.</li>
	<li>Calcule e pese a quantidade de colagem necessária para digerir todos os depósitos. Adicione 50 μL de 15 mg/mL de colagenase tipo I em 2x tampão de isolamento a cada tubo. Não resuspenque a colagem no tampão de isolamento até que todos os tecidos tenham sido coletados.</li>
	<li>Para coletar WAT subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen do filhote (evite ruptura peritoneal) e puxe suavemente a pele para baixo abaixo das pernas. Sem tomar a pele, colete cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido claro (P1 ou mais jovem) ou branco (P2 e mais velho), tecido fino e alongado preso no interior ou em cima do quadríceps(Figura 1B). Enxágüe o depósito de gordura em PBS, e coloque-o em um dos tubos contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento de 2x. Mantenha-se no gelo. NOTA: Os ratos P0 e P1 dão o melhor rendimento. Em filhotes P0-1, o depósito wat subcutâneo é quase transparente. Em camundongos P2 e mais velhos, o depósito é mais fácil de identificar porque já está ficando branco, indicando a presença de adipócitos brancos totalmente maduros, carregados de lipídios.</li>
	<li>Para coletar bat interescapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça. Levante o BAT - o tecido vermelho profundo entre as omoplatas - e faça cuidadosamente incisões ao seu redor para desprender-o do corpo(Figura 1B). Verifique se há consistência e cor; enxaguar com PBS; colocá-lo no outro tubo contendo 250 μL de PBS + 200 μL de tampão de isolamento de 2x; e manter no gelo. NOTA: Ao colher o BAT de ratos P2 e mais velhos, remova cuidadosamente o tecido adiposo branco ao redor do BAT. Consiste em uma fina, macia, folha branca de adipócitos localizados entre a pele e o BAT, que é mais profundo entre as omoplatas.</li>
	<li>Uma vez que todos os depósitos tenham sido coletados, pique suavemente cada depósito (4-6 vezes) usando pequenas tesouras diretamente dentro dos tubos.</li>
	<li>Resuspend colagenase tipo I no volume apropriado de tampão de isolamento de 2x para obter uma solução de estoque de 10x a 15 mg/mL. Adicione 50 μL de colagenase de 10x a cada tubo, mantendo os tubos no gelo até que a colagem tenha sido adicionada a todos os tubos.</li>
	<li>Inverta os tubos rapidamente para misturar e transfira para uma batedeira controlada pela temperatura. Incubar as amostras por 30 min a 37 °C em um agitador (frequência de 1.400 rpm para uma mistura eficaz de amostras).</li>
</ol>2. Chapeamento de preadipócitos (dia 1)
<ol><li>Depois de digerir os tecidos, coloque os tubos de volta no gelo. NOTA: A partir deste passo, todo o trabalho é realizado em condições estéreis em um armário de biossegurança.</li>
	<li>Coe os tecidos digeridos através de um coador de células de 100 μm em novos tubos de 50 mL. Se trabalhar apenas com camundongos WT, ou se forem conhecidos genótipos, unindo os BATs relevantes e dissociados juntos; repetir isso para os WATs. Para maximizar o rendimento celular, enxágue cada tubo com 1 mL de meio de isolamento (o meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) + 20% de soro bovino fetal (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicilina-estreptomicina) e filtre-o através do coador celular. Se trabalhar com genótipos desconhecidos, vá para o passo 2.4 NOTA: A FBS é um determinante essencial tanto da proliferação pré-iedícica quanto da diferenciação. Teste rigorosamente diferentes lotes de FBS para garantir alto desempenho e consistência entre lotes.</li>
	<li>Diluir as suspensões BAT e WAT para a placa 2-3 poços de uma placa de 6 poços para cada amostra de BAT e 4-6 poços de uma placa de 6 poços para cada amostra WAT. Por exemplo, se 6 BATs e 6 WATs foram agrupados, diluir a suspensão da célula BAT até 24-36 mL e a suspensão da célula WAT até 48-72 mL. Placa 2 mL das suspensões celulares por poço.</li>
	<li>Para amostras com genótipos desconhecidos, mantenha cada amostra separada; coloque um coador de células de 100 μm em cima de cada poço de uma placa de 6 poços, e filtre uma amostra por poço. Enxágüe o tubo com 1,5 mL de meio de isolamento e passe-o através do coador, com o volume final até 2 mL por poço. Descarte o coador de células, coloque a tampa na placa e transfira a placa para a incubadora. NOTA: O meio nos poços deve parecer turvo devido a células sanguíneas flutuantes, detritos celulares e lipídios de células líssedas.</li>
	<li>1-1,5 h após o revestimento, aspirar mídia e lavar com 2 mL de DMEM sem soro. Agitar suavemente a placa para separar as células sanguíneas do fundo dos poços. Após 3 lavagens, adicione 2 mL de meio de isolamento fresco e transfira as células para a incubadora (37 °C, 5% CO2). NOTA: Verifique as células sob o microscópio. O material flutuante (células sanguíneas, detritos celulares) deve ser mínimo. Os pré-apócitos marrons aparecerão como pequenas células não translúcidas, enquanto os pré-apócitos brancos exibirão uma forma mais alongada. Os preadipócitos marrons e brancos devem estar bem presos à placa.</li>
</ol>3. Expansão da cultura pré-idílica (dia 2 ao dia 5)
<ol><li>No dia seguinte, aspire o meio, lave as células com 2 mL de DMEM sem soro e adicione 2 mL do meio de isolamento.</li>
	<li>Repita o passo 3.1 uma vez a cada 2 dias até que as células atinjam 80-90% de confluência. NOTA: Para preadipócitos marrons primários, atingir 80-90% de confluência pode levar de 4 a 5 dias. Para preadipócitos brancos primários, geralmente leva de 2 a 3 dias. Uma vez que os pré-iadipócitos atingem 60% de confluência, eles podem ser eficientemente infectados com partículas virais para experimentos de knockdown ou superexpressão. Infecte preadipócitos com carga viral apropriada por até 8h. O uso de polímeros cônicos para aumentar a eficiência da infecção é desencorajado, pois muitas vezes resulta em toxicidade e em uma redução significativa do potencial adipogênico de preadipócitos infectados.</li>
	<li>Para dividir as células, cubra novas placas de destino usando uma solução estéril de gelatina de 0,1% w/v (dissolvida em água destilada; não use nenhum calor). Use volume suficiente para cobrir a parte inferior do poço/prato. Incubar placas a 37 °C até que as células estejam prontas para serem semeadas (pelo menos 10 min). NOTA: Esta etapa é opcional. O revestimento de placas de cultura celular não afeta o potencial de rendimento ou diferenciação, mas simplifica substancialmente a manutenção e manuseio de adipócitos diferenciados.</li>
	<li>Quando as células atingem densidade subconfluente (85-95%), aspiram o meio, lavam com PBS e adicionam trippsina por 3 minutos para desprender as células. Bloqueie a atividade de trippsina adicionando 2,5x volume de trippsina de meio de isolamento. Pipeta a suspensão da célula para cima e para baixo para maximizar a recuperação celular, e transferir para um novo tubo. Lave os poços com 1 mL de meio de isolamento e adicione-os à primeira coleção.</li>
	<li>Centrifugar as células por 5 min a 800-1200 × g, aspirar o supernasce e resuspensar as células em 3-5 mL do meio de isolamento. Conte as células e dilui-as à densidade final desejada. NOTA: Por exemplo, 50.000-80.000 células/mL (2,5, 1 e 0,5 mL para placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente) resultarão em poços totalmente confluentes dentro de 72-96 h.</li>
	<li>Aspire a solução de revestimento na etapa 3.3 e lave o excesso de gelatina com PBS. Semear as células, e devolver as placas à incubadora até ficar totalmente confluente.</li>
</ol>4. Diferenciação de preadipócitos brancos e marrons (dias 7 a 12)
<ol><li>Quando os pré-iadócitos se tornam confluentes, aspiram o meio e substituem-no por meio de diferenciação composto por 10% de FBS em DMEM contendo insulina de 170 nM, 1 μM dexametasona e 0,5 mM 3-isobuthyl-1-metilxantina. Se diferenciar os pré-apócis do BAT, adicione também triiodothronina de 1 nM (T3). Marque o dia em que a diferenciação adipogênica é induzida como dia 0 de diferenciação. NOTA: Tanto os preadipócitos brancos quanto os marrons podem diferenciar-se espontaneamente ao atingir a confluência. No entanto, para maximizar a diferenciação de adipócito, deve ser utilizado o tradicional coquetel pró-adipogênico descrito acima (mais T3 para pré-apócitos bat).</li>
	<li>Após 48h (dia 2 de diferenciação), atualize o meio com meio de manutenção composto por 10% de FBS em DMEM e insulina de 170 nM (mais 1 nM T3 para BAT). NOTA: No dia 2, pequenas gotículas lipídicas acumuladas nas células sob o microscópio podem ser observadas usando campo brilhante padrão.</li>
	<li>Repita o passo 4.2 uma vez a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos. NOTA: No dia 4 ou 5 de diferenciação, a maioria das células aparecerá carregadas de lipídios. Adipócitos de diferenciação terminal podem ser mantidos na cultura por mais tempo ou usados nesta fase para experimentos.</li>
</ol>5. Re-revestimento para experimentos de bioenergésicos
NOTA: Se a intenção é realizar estudos de bioenergésticos em adipócitos maduros no formato de 96 poços, as seguintes etapas precisam ser tomadas. Idealmente, devem ser utilizadas células que tenham apenas totalmente diferenciado (dia 4 ou 5). O procedimento descrito abaixo começa a partir de 1 poço de uma placa de 6 poços.
<ol><li>Antes da digestão da trippsina, prepare o revestimento para placas de 96 poços. Adicione 50 μL de gelatina de 0,1% a cada poço. Deixe a placa em uma incubadora de cultura tecidual até que as células estejam prontas para serem semeadas.</li>
	<li>No dia 4 ou 5 de diferenciação, aspire o meio, lave com 1 mL de PBS e adicione 300 μL de 0,25% de ácido tetraacético trypsin-etilenodiamina (para 1 poço de uma placa de 6 poços). Incline suavemente a placa para garantir que a trippsina cubra completamente a parte inferior do poço; incubar por 2 min em temperatura ambiente. Bloqueie a ação da trippsina com 700 μL de meio de manutenção, pipeta para cima e para baixo para maximizar a recuperação celular e transfira a suspensão da célula para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células a 1200 × g por 5 min. Remova o supernasal, resuspense a pelota em 1 mL de meio de manutenção e conte as células. NOTA: Um poço de uma placa de 6 poços deve render aproximadamente 1,5-1,8 milhões de células.</li>
	<li>Diluir as células para ter uma concentração final de 60.000 a 80.000 células/mL para adipócitos marrons e 100.000 a 120.000 células/mL para adipócitos brancos. Placa 100 μL da suspensão celular por poço em placas revestidas de gelatina 96-well. NOTA: Um poço de uma placa de 6 poços fornece células suficientes para até duas placas de 96 poços. Para experimentos de bioenergésicos, o revestimento de baixa densidade (30-40% de confluência) é necessário para permitir a medição precisa do consumo de oxigênio e evitar o esgotamento de oxigênio nos poços durante o ensaio.</li>
	<li>Deixe as células aderirem ao fundo da placa por pelo menos 48 h. Se as células forem mantidas na placa por mais de 48h, refresque o meio após 2 dias.</li>
	<li>No dia do ensaio, aspire o meio e substitua-o por meio de ensaio. Incubar por 1h a 37 °C em uma incubadora não controlada por CO2e realizar o ensaio de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O tecido adiposo é fundamental para a sensibilidade sistêmica da insulina e a homeostase de glicose20. A disfunção adipócito ligada à obesidade está fortemente associada ao aparecimento do diabetes tipo 2. Portanto, uma maior compreensão da biologia básica e fisiologia do tecido adiposo pode permitir a concepção de novos tratamentos para distúrbios metabólicos. Como complemento à análise funcional e transcricional direta de adipócitos maduros isolados dos depósitos de gordura21</...

A obesidade resulta de um desequilíbrio crônico entre o consumo de energia e o gasto energético. À medida que a obesidade se desenvolve, os adipócitos brancos sofrem uma expansão maciça no tamanho celular que resulta em hipóxia no microambiente, morte celular, inflamação e resistência à insulina1. Adipócitos disfuncionais e hipertróficos não conseguem armazenar adequadamente lipídios em excesso, que se acumulam em outros tecidos onde amortecem a ação da insulina2,3. Prevê-se que agentes que melhoram a função de adipócito e restaurem a partição lipídica normal entre os tecidos são considerados benéficos para o tratamento de condições associadas à obesidade caracterizadas pela resistência à insulina, como diabetes tipo 2. Telas fenotípicas em adipócitos usando linhas celulares imortalizadas, como 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, têm se mostrado úteis para identificar fatores genéticos que regulam a adipogênese e isolar moléculas pró-adipogênicas com propriedades anti-diabéticas4,5,6,7. Essas linhas celulares, no entanto, não refletem totalmente a heterogeneidade dos tipos celulares presentes nos depósitos adiposos, que incluem subtipos brancos, marrons, bege e outros adipócitos com características únicas, todos os quais contribuem para a homeostase sistêmica8,9,10. Além disso, as linhas de células cultivadas frequentemente mostram uma resposta reduzida a estímulos externos.
Em contraste, culturas de adipócitos primários recapitulam com mais precisão a complexidade da adipogênese in vivo, e os adipócitos primários apresentam respostas funcionais robustas. Os pré-iícios primários são tipicamente isolados da fração vascular estromica dos depósitos adiposos de camundongos adultos11,12,13,14. No entanto, como os depósitos adiposos de animais adultos consistem principalmente de adipócitos totalmente maduros que têm uma taxa de rotatividade muito lenta15,16,17, essa abordagem produz uma quantidade limitada de pré-doenças com baixa taxa de proliferação. Portanto, o isolamento de preadipócitos de camundongos recém-nascidos é preferível obter grandes quantidades de células de rápido crescimento que podem ser diferenciadas in vitro. Aqui, foi descrito um protocolo, inspirado no trabalho inicial com adipócitos marrons primários de Kahn et al.18 para isolar eficientemente preadipócitos brancos e marrons que podem ser expandidos e diferenciados in vitro em adipócitos primários totalmente funcionais(Figura 1A). A vantagem de isolar células primárias de recém-nascidos, ao contrário dos camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão crescendo rapidamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação ativa de pré-doenças17. Células isoladas usando este protocolo têm alta capacidade de proliferação, permitindo uma rápida ampliação das culturas. Além disso, os pré-nascidos de filhotes apresentam maior potencial de diferenciação do que os progenitores adultos, o que reduz a variabilidade bem-para-bem na extensão da diferenciação e, portanto, aumenta a reprodutibilidade.

<table><tbody><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed (Vermelho Nilo)</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini Bioproducts LLC</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo 1&nbsp; &nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6442</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td>Para estudos bioenergéticos</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina BSA sem ácidos graxos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Norepinefrina</td><td>Cayman Chemical</td><td>16673</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Caneta / Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557368</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>Para estudos de bioenergética</td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td><td>RS-5158</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>triiodotironina (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>642511</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

A compreensão dos mecanismos subjacentes à diferenciação e função adipócitos beneficiou-se muito do uso de linhas celulares pré-apócidas brancas imortalizadas. Essas linhas de células cultivadas, no entanto, têm limitações. Eles não capturam totalmente o espectro funcional diversificado das populações heterogênios que agora são conhecidas por existirem dentro de depósitos adiposos brancos. Para fornecer um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a complexidade do tecido adiposo branco, um protocolo foi desenvolvido e otimizado para permitir o isolamento simultâneo de progenitores adipócidos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos, sua rápida expansão na cultura e sua diferenciação in vitro em adipócitos maduros e totalmente funcionais. A principal vantagem de isolar células primárias de camundongos recém-nascidos, em vez de camundongos adultos, é que os depósitos adiposos estão se desenvolvendo ativamente e são, portanto, uma rica fonte de proliferação de pré-doenças. Os pré-doenças primários isolados usando este protocolo diferenciam-se rapidamente ao atingir a confluência e tornam-se totalmente maduros em 4-5 dias, uma janela temporal que reflete com precisão o aparecimento de almofadas de gordura desenvolvidas em camundongos recém-nascidos. As culturas primárias preparadas com essa estratégia podem ser expandidas e estudadas com alta reprodutibilidade, tornando-as adequadas para telas genéticas e fenotípicas e possibilitando o estudo dos fenótipos adipócitos autônomos de células de modelos genéticos de camundongos. Este protocolo oferece uma abordagem simples, rápida e barata para estudar a complexidade do tecido adiposo in vitro.

A seção 1 do protocolo produzirá uma suspensão heterogênea de células que são visíveis sob um microscópio de luz padrão. A filtragem de tecidos digeridos com um coador celular (seção 2) removerá tecido não digerido. No entanto, alguns detritos celulares, células sanguíneas e adipócitos maduros passarão(Figura 1C). Lavagens suaves 1 h após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os preadipócitos se prendem rapidamente à parte inferior do p...

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Este protocolo fornece uma estratégia simples para gerar modelos culturais celulares de adipócitos brancos e marrons que recapitulam fielmente in vitro, a fisiologia do tecido adiposo que temos in vivo. Este protocolo permite o isolamento simultâneo de pré-nascidos brancos e pardos de camundongos recém-nascidos e as células que isolamos usando este método avaliam alta capacidade proliferativa e potencial de diferenciação. Células isoladas usando essa abordagem refletem a complexidade do tecido adiposo melhor do que outros modelos culturais.E pode ser usado para estudar com mais precisão a função adipócito na obesidade e diabetes. Focamos principalmente na compreensão da disfunção tecidual adiposa na obesidade. No entanto, as células preparadas com esse método também podem ser usadas para estudar questões básicas sobre células em biologia do desenvolvimento.A chave para um experimento bem-sucedido é determinar como identificar os depósitos de adiposos brancos como esses depósitos, que são pequenos, mas muito ricos e proliferando pré-apócitos podem ser difíceis de distinguir em filhotes. A demonstração visual ilustra o quão simples é este protocolo e permite o fornecimento de dicas para localizar e dissecar os depósitos adiposos brancos e marrons. Ver o isolamento do depósito é muito útil.Para coletar tecido adiposo branco subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen de um filhote recém-nascido eutanizado, e puxe suavemente a pele abaixo das pernas. Sem coletar nenhum tecido da pele, colhe cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido alongado claro ou branco, fino, preso ao interior da pele ou em cima do quadríceps. Enxágüe o depósito colhido em PBS e coloque o tecido adiposo em um tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.Para coletar tecido adiposo marrom interscapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça e levante o tecido adiposo marrom vermelho profundo localizado entre as omoplatas. Faça cuidadosamente incisões ao redor do adiposo para desprender do corpo e verificar se o tecido tem consistência e cor. Após a lavagem, coloque o tecido em um segundo tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.Quando todos os depósitos tiverem sido coletados, use uma tesoura para cortar suavemente cada depósito quatro a seis vezes diretamente dentro dos tubos e adicionar 50 microliters de colagenase 10X em tampão de isolamento 2X a cada tubo. Em seguida, inverta os tubos rapidamente para misturar e colocar os tecidos em uma batedeira controlada pela temperatura por 30 minutos a 37 graus Celsius e 1400 rotações por minuto. No final da digestão, coloque os tubos de volta no gelo e filtre os tecidos digestivos através de 100 coerdeiras de células de mícrons em novos tubos de 50 mililitros.Para maximizar o rendimento celular, enxágue cada tubo com um mililitro de meio de isolamento e filtre esta lavagem através do coador. Diluir as soluções de tecido adiposo marrom e branco para dois mililitros de suspensão tecidual por poço por depósito em meio de isolamento fresco. Em seguida, a placa dois mililitros de suspensão de tecido adiposo branco para cada um de quatro a seis poços e dois mililitros de suspensão de tecido adiposo marrom para cada um de dois a três poços de uma placa de seis poços através de um filtro de 100 mícrons por poço.Quando todas as células tiverem sido banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 60 a 90 minutos. No final da incubação, lave cada poço com dois mililitros de meio livre de soro e agitar suavemente a placa para separar quaisquer células sanguíneas da parte inferior dos poços. Depois de três lavagens, adicione dois mililitros de meio de isolamento fresco aos poços e devolva a placa à incubadora de cultura celular.Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, cubra novas placas de destino com gelatina estéril de 0,1% em água destilada a 37 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto as placas estão incubando, lave as células com PBS antes de tratar com trippsina por três minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separaram, pipeta a suspensão celular várias vezes para maximizar a recuperação celular e transferir as células para um novo tubo.Quando todas as células tiverem sido coletadas, lave cada poço com um mililitro de meio de isolamento e puxe as lavagens com a suspensão celular. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em três a cinco mililitros de meio de isolamento para contar. Diluir as células à concentração adequada para chapeamento em meio de isolamento fresco e lavar as placas revestidas de gelatina com PBS para remover qualquer excesso de gelatina.Em seguida, semear as células nas placas revestidas de gelatina e devolver as células à incubadora de cultura celular. Quando as células atingirem a confluência, substitua o meio de isolamento por meio de diferenciação. Se diferenciar os pré-apócitos de tecido adiposo marrom, adicione também uma triiodotironina nanomolar.Após 48 horas, atualize o meio com o volume adequado de meio de manutenção por cultura. Neste momento, o acúmulo de pequenas gotículas líquidas dentro das células deve se tornar visível sob microscopia de campo brilhante. Mesmo após a filtragem, alguns detritos celulares e células sanguíneas permanecem dentro da suspensão celular.Lavagens suaves uma hora após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os pré-apócitos se prendem rapidamente à parte inferior do poço. Embora os pré-apócis brancos e marrons isolados de filhotes recém-nascidos tenham uma alta capacidade de proliferação, o rendimento de pré-nascidos brancos é geralmente o dobro dos preadipócitos marrons em uma base por depósito. Portanto, se forem desejadas culturas sincronizadas, essa densidade inicial dos preadipócitos brancos deve ser calculada em conformidade.Ao final da diferenciação, as células parecerão carregadas com gotículas lipídicas e expressarão marcadores clássicos de adipócitos brancos e marrons, respectivamente. Nesta análise comparativa do consumo de oxigênio em um teste de estresse mitocondrial de adipócitos brancos e marrons primários em condições basais, bem como em resposta aos estimuladores conhecidos da função mitocondrial, essa capacidade bioenergénica específica de cada tipo de célula pode ser observada. Lembre-se que estamos isolando células vivas e que queremos cultuá-las por vários dias.Portanto, certifique-se de manter condições estéreis durante o isolamento para evitar contaminação, o que pode comprometer a cultura subsequente. Este método gera adipócitos totalmente maduros que podem ser usados para diferentes aplicações, incluindo ensaios funcionais, telas genéticas ou químicas, ou perfis omics para estudar mecanismos autônomos celulares que impactam a função adipócito.

isolation-differentiation-primary-white-brown-preadipocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos o procedimento cirúrgico para isolar o tecido adiposo branco subcutâneo e o tecido adiposo marrom interescapular de um camundongo recém-nascido.

Coleção de depósito adiposo branco e marrom do filhote de rato: um procedimento cirúrgico para colher o tecido adiposo branco e o tecido adiposo marrom do filhote de camundongo

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

O presente protocolo descreve um método simples para isolar pré-apócitos do tecido adiposo em embriões de frango. Este método permite o isolamento com alto rendimento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-apócitos. Manchas de óleo Vermelho O e mancha lipídica/DNA mediram a capacidade adipogênica de células isoladas induzidas com meios de diferenciação.

Isolamento de Preadipócitos de Embriões de Broiler Chick

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

A dissecção e crescimento de células de uma área do cérebro individuais facilita investigação de parâmetros celulares e fisiológicos. Nós descrevemos um método para cultivo de células primárias, que produz neurônios enriquecido culturas em um ambiente sem soro.

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

Aprenda a isolar e diferenciar preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos. Este método permite estudar a função adipocitária em obesidade e diabetes com maior precisão.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

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