Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este protocolo fornece uma estratégia simples para gerar modelos culturais celulares de adipócitos brancos e marrons que recapitulam fielmente in vitro, a fisiologia do tecido adiposo que temos in vivo. Este protocolo permite o isolamento simultâneo de pré-nascidos brancos e pardos de camundongos recém-nascidos e as células que isolamos usando este método avaliam alta capacidade proliferativa e potencial de diferenciação. Células isoladas usando essa abordagem refletem a complexidade do tecido adiposo melhor do que outros modelos culturais.

E pode ser usado para estudar com mais precisão a função adipócito na obesidade e diabetes. Focamos principalmente na compreensão da disfunção tecidual adiposa na obesidade. No entanto, as células preparadas com esse método também podem ser usadas para estudar questões básicas sobre células em biologia do desenvolvimento.

A chave para um experimento bem-sucedido é determinar como identificar os depósitos de adiposos brancos como esses depósitos, que são pequenos, mas muito ricos e proliferando pré-apócitos podem ser difíceis de distinguir em filhotes. A demonstração visual ilustra o quão simples é este protocolo e permite o fornecimento de dicas para localizar e dissecar os depósitos adiposos brancos e marrons. Ver o isolamento do depósito é muito útil.

Para coletar tecido adiposo branco subcutâneo, corte a pele ao redor do abdômen de um filhote recém-nascido eutanizado, e puxe suavemente a pele abaixo das pernas. Sem coletar nenhum tecido da pele, colhe cuidadosamente o depósito de gordura, que aparecerá como um tecido alongado claro ou branco, fino, preso ao interior da pele ou em cima do quadríceps. Enxágüe o depósito colhido em PBS e coloque o tecido adiposo em um tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.

Para coletar tecido adiposo marrom interscapular, puxe a pele das omoplatas sobre a cabeça e levante o tecido adiposo marrom vermelho profundo localizado entre as omoplatas. Faça cuidadosamente incisões ao redor do adiposo para desprender do corpo e verificar se o tecido tem consistência e cor. Após a lavagem, coloque o tecido em um segundo tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS e 200 microliters de tampão de isolamento 2X no gelo.

Quando todos os depósitos tiverem sido coletados, use uma tesoura para cortar suavemente cada depósito quatro a seis vezes diretamente dentro dos tubos e adicionar 50 microliters de colagenase 10X em tampão de isolamento 2X a cada tubo. Em seguida, inverta os tubos rapidamente para misturar e colocar os tecidos em uma batedeira controlada pela temperatura por 30 minutos a 37 graus Celsius e 1400 rotações por minuto. No final da digestão, coloque os tubos de volta no gelo e filtre os tecidos digestivos através de 100 coerdeiras de células de mícrons em novos tubos de 50 mililitros.

Para maximizar o rendimento celular, enxágue cada tubo com um mililitro de meio de isolamento e filtre esta lavagem através do coador. Diluir as soluções de tecido adiposo marrom e branco para dois mililitros de suspensão tecidual por poço por depósito em meio de isolamento fresco. Em seguida, a placa dois mililitros de suspensão de tecido adiposo branco para cada um de quatro a seis poços e dois mililitros de suspensão de tecido adiposo marrom para cada um de dois a três poços de uma placa de seis poços através de um filtro de 100 mícrons por poço.

Quando todas as células tiverem sido banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 60 a 90 minutos. No final da incubação, lave cada poço com dois mililitros de meio livre de soro e agitar suavemente a placa para separar quaisquer células sanguíneas da parte inferior dos poços. Depois de três lavagens, adicione dois mililitros de meio de isolamento fresco aos poços e devolva a placa à incubadora de cultura celular.

Quando as células atingem 80 a 90% de confluência, cubra novas placas de destino com gelatina estéril de 0,1% em água destilada a 37 graus Celsius por 10 minutos. Enquanto as placas estão incubando, lave as células com PBS antes de tratar com trippsina por três minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separaram, pipeta a suspensão celular várias vezes para maximizar a recuperação celular e transferir as células para um novo tubo.

Quando todas as células tiverem sido coletadas, lave cada poço com um mililitro de meio de isolamento e puxe as lavagens com a suspensão celular. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em três a cinco mililitros de meio de isolamento para contar. Diluir as células à concentração adequada para chapeamento em meio de isolamento fresco e lavar as placas revestidas de gelatina com PBS para remover qualquer excesso de gelatina.

Em seguida, semear as células nas placas revestidas de gelatina e devolver as células à incubadora de cultura celular. Quando as células atingirem a confluência, substitua o meio de isolamento por meio de diferenciação. Se diferenciar os pré-apócitos de tecido adiposo marrom, adicione também uma triiodotironina nanomolar.

Após 48 horas, atualize o meio com o volume adequado de meio de manutenção por cultura. Neste momento, o acúmulo de pequenas gotículas líquidas dentro das células deve se tornar visível sob microscopia de campo brilhante. Mesmo após a filtragem, alguns detritos celulares e células sanguíneas permanecem dentro da suspensão celular.

Lavagens suaves uma hora após o revestimento removerão células não relevantes à medida que os pré-apócitos se prendem rapidamente à parte inferior do poço. Embora os pré-apócis brancos e marrons isolados de filhotes recém-nascidos tenham uma alta capacidade de proliferação, o rendimento de pré-nascidos brancos é geralmente o dobro dos preadipócitos marrons em uma base por depósito. Portanto, se forem desejadas culturas sincronizadas, essa densidade inicial dos preadipócitos brancos deve ser calculada em conformidade.

Ao final da diferenciação, as células parecerão carregadas com gotículas lipídicas e expressarão marcadores clássicos de adipócitos brancos e marrons, respectivamente. Nesta análise comparativa do consumo de oxigênio em um teste de estresse mitocondrial de adipócitos brancos e marrons primários em condições basais, bem como em resposta aos estimuladores conhecidos da função mitocondrial, essa capacidade bioenergénica específica de cada tipo de célula pode ser observada. Lembre-se que estamos isolando células vivas e que queremos cultuá-las por vários dias.

Portanto, certifique-se de manter condições estéreis durante o isolamento para evitar contaminação, o que pode comprometer a cultura subsequente. Este método gera adipócitos totalmente maduros que podem ser usados para diferentes aplicações, incluindo ensaios funcionais, telas genéticas ou químicas, ou perfis omics para estudar mecanismos autônomos celulares que impactam a função adipócito.