Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Este método ajudará a responder a questões-chave sobre a função fisiológica das gônadas, incluindo o papel dos esteróides sexuais na plasticidade e regulação do sistema neuroendócrino em teleósteos e, em maior medida, em vertebrados. Este protocolo possibilita a realização de gonadectomia com alta taxa de sucesso em pequenos modelos de teleósteo medeka Para ser bem-sucedida e alcançar uma alta taxa de sobrevivência, essa técnica requer treinamento adequado, principalmente na avaliação das gônadas e na sutura dos peixes.

Comece retirando o peixe da solução anestésica e colocando-o horizontalmente de lado sob um microscópio de dissecação. Para realizar a ovariectomia em mulheres, raspe as escamas na área da incisão. Faça suavemente uma incisão de dois a 2,5 milímetros entre as costelas e as barbatanas pélvica e anal usando uma lâmina de barbear.

Aperte o abdômen do peixe suavemente enquanto retira os ovários usando uma pinça fina com uma ponta larga. É importante evitar quebrar as costelas, o que pode causar a morte. Corte a ponta dos ovários com a pinça fina e reserve.

Para realizar a orquidectomia em homens, faça uma incisão entre as costelas acima do ânus e abra a incisão lentamente usando uma pinça fina. Agarre suavemente os testículos com a pinça e retire-os lentamente. Em seguida, corte a extremidade dos testículos para removê-los completamente.

Após a realização do procedimento, suturar a incisão de forma semelhante para homens e mulheres. Coloque o fio de náilon ao lado da área da incisão e esfaqueie a pele do lado direito da incisão através da cavidade interna do corpo, usando uma pinça ultrafina para prender o fio. Em seguida, perfure a pele do lado esquerdo da incisão através da cavidade externa do corpo para retirar o fio.

Feche a abertura da incisão, faça dois nós e corte o excesso de linha. Coloque os peixes na água de recuperação isotónica e deixe-os lá durante pelo menos 24 horas antes de os transferir para o sistema de aquário. Monte a gaveta de sangue prendendo uma agulha de vidro ao capilar de silicone.

Quebre a ponta da agulha com uma pinça de ponta larga e cubra o interior da agulha com solução anticoagulante por sucção e sopro. Direcione a agulha em direção à área do pedúnculo do peixe, visando a veia do pedúnculo caudal, e retire o sangue com a boca até que pelo menos 1/4 do volume total da agulha seja preenchido. Solte a agulha e coloque um pedaço de fita adesiva perto do lado afiado.

Coloque uma tampa com um orifício em um tubo de coleta e coloque a agulha dentro do tubo através do orifício com a ponta da agulha do lado de fora. Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os lá por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário. Gire rapidamente o sangue por um a dois segundos a 1.000 vezes G para coletar o sangue no tubo.

A taxa de sobrevida após a ovariectomia, ou OVX, nas mulheres foi de 100% e 94% nos homens após a orquidectomia. Todos os peixes sobreviveram ao procedimento de amostragem de sangue. As fêmeas operadas simuladamente apresentaram posição OV.

Todos os óvulos foram fertilizados e seguiram para o desenvolvimento embrionário. Quando o procedimento de gonadectomia foi realizado corretamente, a forma do corpo do peixe mudou ligeiramente e nenhum pedaço de gônada permaneceu. A incisão e a sutura desapareceram completamente quatro semanas após a gonadectomia.

Após quatro meses, todos os peixes ainda apresentavam um fenótipo saudável e nenhum tecido gonadal foi encontrado. A análise de sangue em fêmeas revelou que o nível de E2 em peixes OVX foi significativamente menor do que em peixes operados de forma simulada 24 horas após a cirurgia. Após quatro meses, o nível de E2 em peixes OVX ainda era significativamente menor do que em peixes operados por simulação.

Parcialmente os peixes OVX, onde apenas 1/3 a 1/2 da gônada foi removida, mostraram níveis de E2 significativamente mais baixos do que os peixes operados por simulação e níveis de E2 significativamente mais altos do que os peixes totalmente OVX. A concentração de 11 KT em machos orquidectomiados foi significativamente menor do que em peixes operados por simulação 24 horas após a cirurgia. Após quatro meses, o nível de 11 KT ainda era menor do que em peixes operados de forma simulada.

Peixes parcialmente orchidectomizados apresentaram níveis mais baixos de 11-KT do que peixes operados por simulação e níveis mais altos do que peixes totalmente orchidectomizados. Para garantir que o procedimento seja bem-sucedido, é essencial remover a gônada da maneira mais cuidadosa e completa possível, sem danificar outros órgãos dentro do peixe. Como se sabe que os esteróides sexuais desempenham um papel importante na plasticidade das células cerebrais e hipofisárias, essa técnica fornece uma ferramenta poderosa para investigar mecanismos subjacentes em pequenos modelos de teleósteos.