Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

A ulceração da pele com cicatrização inadequada da ferida é uma das principais causas de amputação em pacientes humanos. A cicatrização adequada da ferida requer níveis mais elevados de profusão arterial que são necessários para manter a pele intacta, que está comprometida em pacientes com doença arterial periférica. Várias outras condições reumatológicas e diabetes também podem levar a microcirculação de pele perturbada e inadequada para curar feridas.

Muitos pacientes diabéticos têm doença arterial periférica concomitante, colocando-os em risco especialmente alto de amputação. A imagem de perfusão do doppler laser ou LDPI é usada em situações clínicas para avaliar a microcirculação da pele, bem como em situações de pesquisa para avaliar o fluxo sanguíneo e a recuperação do fluxo sanguíneo após isquemia experimental de retalhos, reperfusão de isquemia e retalhos microcirúrgicos. O sistema LDPI projeta um raio laser de baixa potência que é desviado por um espelho de varredura para se mover sobre uma região de interesse.

Isso difere da escoamento do doppler laser, que fornece uma medição de perfusão para a pequena área do tecido em contato direto com a sonda de esvoaça. Quando o raio laser interage com o sangue em movimento na microvasculatura, ele sofre uma mudança de frequência Doppler que é fotodesensificada pelo scanner e convertida em unidades arbitrárias de perfusão. Como o LDPI é uma técnica baseada na luz, é limitado em termos de profundidade de penetração de 0,3 a 1 milímetro, o que significa que na maior parte a perfusão dérmica é avaliada.

O fluxo dérmico pode ser alterado pela temperatura da pele e pelo sistema nervoso simpático, que pode ser afetado por vários agentes anestésicos. As medidas do laser óptico também são afetadas por condições de iluminação ambiente, pigmentação da pele e podem ser bloqueadas por peles ou cabelos excessivamente. O LDPI é a técnica de pesquisa mais usada para monitorar a recuperação da profusão após a isquemia por não ser invasiva, não requer administração de contrastes e tem tempos de varredura rápidos permitindo a coleta de dados em vários animais.

Isso torna ideal ajudar a determinar se tratamentos voltados para arteriogênese terapêutica ou angiogênese são eficazes em pequenos modelos animais. A recuperação do fluxo sanguíneo após a isquemia de subida traseira medida medida pelo LDPI correlaciona-se bem com o desenvolvimento da artéria colateral quando avaliada por outros meios, como fundição de microfilme ou microC. O objetivo deste protocolo é demonstrar a avaliação da perfusão de liminar por meio do LDPI. Ajuste a altura do scanner de modo que a distância até o objeto da varredura seja de aproximadamente 30 centímetros.

Ligue o imager e inicie o software associado. Abra o programa de medição. Se o software estiver se comunicando corretamente com o scanner, o laser infravermelho ativará o aviso aparecerá.

Ajuste as configurações do scanner para ser apropriado para o material de fundo e a configuração de iluminação na sala. Defina o limiar de fundo apontando o feixe de laser para o material de fundo preto e pressione Auto BK Set. Configure a câmara de indução de isoflurane com a limpeza adequada do gás residuado.

Colocar a câmara de indução em uma almofada de aquecimento ajudará a evitar a perda de temperatura do rato durante a indução da anestesia. Ligue a manta homeotérmica, que é colocada na área de varredura sob uma superfície não reflexiva. Neste caso, um tecido de neoprene preto.

A manta homeotérmica está programada para manter uma temperatura corporal de 37 graus Celsius. Posicione a sonda de temperatura e os lubrificantes para que estejam prontos para inserção. Coloque a máscara facial da anestesia e o sistema de limpeza na área de varredura também.

Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano. A taxa de oxigênio é fixada em um litro por minuto de fluxo. E o isoflurane é ajustado para 4% para indução de anestesia.

O fluxo é ligado à câmara de indução da anestesia e a taxa de respiração do rato diminuirá. A anestesia adequada é alcançada quando o rato perde o reflexo de redomamento. Transfira o rato para um cone de nariz de máscara anestésico com carniceiro de gás de resíduo ligado e ajuste o isoflurane para 1,5%Este nível de anestesia é geralmente adequado para manter o rato deitado relativamente parado durante a varredura, mas não se destina a fornecer níveis cirúrgicos de anestesia.

Assim, a profundidade da anestesia não é verificada. Mudar o nível isoflurane causa alterações na frequência cardíaca, respiração e profusão dérmica. Assim, uma porcentagem consistente deve ser usada em qualquer experiência de curso de tempo e para todos os sujeitos experimentais.

Técnicas anestésicas alternativas, como a injeção de IP de xilazina de cetamina também podem ser usadas, mas a mesma técnica anestésica deve ser usada ao longo de qualquer estudo de curso de tempo, pois diferentes anestésicos afetam a profusão dérmica de forma diferente. Se a região de interesse do plano a ser escaneada for coberta por peles, use um pequeno aparador elétrico e/ou creme depilatório para remover os cabelos da região de interesse. Os cremes depilatórios devem ser completamente removidos e a pele do rato seca antes da varredura, pois a pele molhada pode causar reflexos do laser Insira a sonda de temperatura retal lubrificada associada à manta homeotérmica no reto do rato.

Equilibre a temperatura do mouse para desejar temperatura de varredura, 37 graus Celsius. Isso pode levar de cinco a 10 minutos. Selecione A configuração do scanner que pode ser acessada no menu superior ou no ícone de configuração do scanner.

A área de varredura deve ser ajustada alterando as coordenadas X, Y para acomodar a região de interesse. A velocidade do scan dependerá da resolução do scan. Uma resolução mais alta resultará em tempos de varredura mais longos.

Para a repetição da varredura, com foco na profusão global, em oposição à maior resolução com foco na perfusão anatômica, a maior velocidade de varredura de quatro milissegundos por pixel é adequada. Se realizar varreduras repetidas, selecione a guia 'Verificar repetição e de linha'. O número de exames pode ser alterado.

Neste caso, três varreduras, bem como o intervalo de repetição. O tempo mínimo para o intervalo de repetição seria o tempo estimado de varredura mostrado na área acinzentado à direita da caixa, determinado pela área de varredura e resolução de varredura. Adicionar alguns segundos permite ao usuário pausar e potencialmente reposicionar o mouse se necessário entre as varreduras.

O tempo total de varredura neste caso é de três minutos e 21 segundos. Selecione a guia Varredura de imagens e selecione o botão Marcar. Isso fará com que o laser delineie a área de varredura.

Ajuste a posição do mouse para que o alvo a ser escaneado esteja dentro da área marcada. Inicie a medição repetida selecionando o ícone "Repetindo" e pressionando o botão Reproduzir para iniciar a varredura. Uma janela pop-up confirmando a distância de varredura aparecerá.

Clique em OK para iniciar a digitalização. A varredura inicial de um rato antes da indução da isquemia de subida traseira é mostrada em tempo real. A segunda e terceira repetições são aceleradas para 16x de velocidade.

A janela principal mostra os resultados da varredura como ela é gerada pelo software. O inset no canto inferior direito mostra o laser escaneando os footpads do mouse. Para o footpad ou footpad e a varredura dorsal da panturrilha, o posicionamento propenso com os blocos traseiros estendidos em direção à cauda fornece uma região mais consistente de interesse em posicionamento supino.

A artéria femoral, artéria safena e as garantias estão muito próximas da superfície ventral da coxa e da panturrilha. Assim, o posicionamento supino é preferido se usar essas regiões de interesse. Monitore o mouse durante a varredura para obter o movimento do mouse.

Se o mouse se mover o suficiente para que os footpads não estejam mais na região de varredura no meio de uma varredura, reinicie a varredura. Pequenas variações na posição do footpad do mouse podem ser acomodadas para o software de análise. Além disso, monitore a temperatura do mouse durante o processo de varredura, pois ele pode flutuar mesmo com o uso da manta homeotérmica.

Se houver muita variação na temperatura do mouse, isso pode resultar em uma variação significativa entre os scans. Geralmente, uma faixa de temperatura de 36,8 a 37,2 resultará em dados aceitáveis. Salve a varredura capturada sob a janela Salvar Como com um nome de arquivo que inclui identificador do mouse e ponto de tempo para facilitar a análise de dados.

Digite os detalhes do mouse e do ponto de tempo, se desejar na janela Detalhes do assunto. A varredura de subida ventral com o mouse na posição supina é mostrada aqui após ajuste da área de varredura. Observe que a proposição com o supino do mouse resulta em uma porção variável do lado do pé sendo escaneado.

Remova a sonda de temperatura retal e desinfete-a com 70% de etanol para que esteja pronto para o próximo mouse. Diminuir a isoflurano para 0%O rato se recuperará mais rápido se continuar recebendo oxigênio, mas também pode ser recuperado sem oxigênio suplementar. Deixe que o mouse se recupere da anestesia até o ponto em que exibe um reflexo de direita, invertendo da posição supina para a posição propensa antes de devolvê-lo à gaiola.

A recuperação pode ser realizada em um cobertor de aquecimento para isoflurane, uma vez que a recuperação é muito rápida ou em uma gaiola de recuperação quente para xilazina de cetamina. Abra o programa de software de revisão de imagens. Uma nova janela para revisar as varreduras será aberta.

Vá para o menu Arquivo, Abra e localize o arquivo salvo. Selecione o ícone ROI na barra de ferramentas. Selecione o ícone Adicionar polígono.

Rastreie uma área ao redor da região de interesse usando o mouse. Quando terminar, volte para a barra de ferramentas e selecione o ícone Estatísticas. Isso trará uma janela mostrando estatísticas da região de interesse.

Na revisão dos dados, a unidade de profusão média, ou PU, os valores não variam mais de 100 a 150 PUs sobre as varreduras repetidas para cada footpad. Esta é uma varredura aceitável e indica que o mouse foi bem equilibrado durante a varredura. Valores médios de PU com variação superior a 100 a 150 UIs, o que corresponde a mais de 10% da perfusão média para um footpad de rato não operado sobre os scans repetidos indicaria que o mouse não estava bem equilibrado e uma repetição é fortemente sugerida.

Realizar uma análise rápida imediatamente após a conclusão da varredura permite que uma varredura repetida seja realizada enquanto o mouse ainda está anestesiado e evitar a perda de um ponto de dados que poderia ocorrer se as varreduras forem analisadas posteriormente e uma varredura for considerada inaceitável devido à variação significativa entre os scans repetidos. Os resultados são expressos como uma razão de profusão de hindlimb cirúrgico sobre a perfusão de subida traseira de controle como camundongos inicialmente vasodilatados e, em seguida, desenvolver suas garantias intrínsecas, a recuperação do fluxo sanguíneo pelo LDPI deve ser vista ao longo de um curso de tempo pós-operatório. O grau de recuperação depende da tensão do camundongo e da gravidade do modelo de isquemia de cetameira.

Esta figura mostra um experimento de curso de tempo completo ao longo de 28 dias onde o LDPI foi usado para medir a recuperação do fluxo sanguíneo do footpad ao longo do tempo após a ligadura da artéria femoral e o nocaute P27 e ratos do tipo selvagem C57Bl/6. Ambos os nocautes P27 em camundongos do tipo selvagem tiveram a recuperação do fluxo sanguíneo prejudicada quando tratados com doxiciclina oral, um inibidor de metaloproteinases matriz generalizada, sugerindo que a atividade de MMP facilita a arteriogênese. A configuração de ganhos e o limiar de fundo devem ser mantidos constantes durante todo o experimento do curso de tempo.

Se o limiar de fundo for definido muito baixo, a digitalização do material de fundo resultará em baixos valores de profusão. Isso resultará na média dos valores de profusão de fundo na região de interesse durante a seleção do polígono. Para eliminar esse problema, o limiar de fundo pode ser ajustado na janela Configuração do scanner sob a guia Geral.

Neste caso, o aumento do limiar de fundo para 118 unidades de profusão resulta no fundo cinza que não será incluído em nenhuma análise. A paleta ou escala de cores para a imagem de fluxo pode ser ajustada tanto no software de medição quanto no software de revisão de imagem. Todos os valores de profusão maiores que o valor máximo na escala serão exibidos como a cor de profusão mais alta.

Neste caso, vermelho. O aumento do alcance dinâmico, por exemplo, mudando a escala para variar de zero a 1500, tornará a variação de varredura repetida mais óbvia aos olhos, pois áreas que medem entre 1000 e 1500 unidades de profusão serão agora exibidas usando o gradiente de cor em vez de todas serem mostradas como vermelhas. A varredura mostrada aqui foi obtida em um rato cuja temperatura corporal principal estava inicialmente abaixo de 36,8 no início do exame repetido e, em seguida, aumentou ao longo dos scans repetidos.

Note que a profusão média do footpad de controle foi mais efetuada pela temperatura corporal do núcleo mais frio do que o footpad isquêmico. Uma única varredura da temperatura corporal mais fria teria resultado em uma maior proporção de profusão sendo registrada para este ponto de dados. A variação na pigmentação da pele do camundongo, como pode ser vista com camundongos C57Bl/6, pode resultar na área de varredura estar abaixo do valor do limiar de fundo, o que dificultará a análise de regiões de interesse contendo áreas pigmentadas.

Os footpads do mouse em geral não têm hiperpigmentação, tornando esta a área mais conveniente para digitalizar esta cepa do mouse. Se o pesquisador deseja estudar o retrocesso ventral, então uma cepa de rato branco deve ser selecionada. O LDPI é um método eficaz, facilmente realizado e repetível para medir a profusão dérmica de medida hindlimb como reflexo da perfusão arterial geral.

Técnica consistente é necessária ao usar LDPI para obter dados confiáveis.