Name: Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de imagem de perfusão por laser Doppler para avaliar o fluxo sanguíneo no membro posterior de camundongos. Este método não invasivo auxilia pesquisadores a estudar a microcirculação cutânea e a cicatrização de feridas.

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Este trabalho foi realizado com a utilização de instalações e recursos no Centro de Saúde De Som VA Puget. O trabalho é do autor e não reflete necessariamente a posição ou política do Departamento de Assuntos dos Veteranos ou do governo dos Estados Unidos. Dr. Tang é atualmente financiado através do VA (Mérito 5 I01 BX004975-02).

Os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington.
1. Preparação do scanner
<ol><li>Ajuste a altura do scanner de modo que a distância até o sujeito digitalizado seja de aproximadamente 30 cm.</li>
	<li>Ligue o imager e inicie o software associado.</li>
	<li>Abra o programa de medição. Se o software estiver se comunicando corretamente com o scanner, o laser infravermelho liga o aviso será.</li>
	<li>Calibrar a máquina com padrões fornecidos pelo fabricante (não mostrado no vídeo e dependerá do modelo específico da máquina que está sendo usada).</li>
	<li>Ajuste as configurações do scanner para ser apropriado para o material de fundo e a configuração de iluminação na sala.<ol>
<li>Defina os níveis de ganho DC FLUX e CONC, de acordo com as instruções do fabricante (não mostradas no vídeo).</li>
		<li>Defina o limiar de fundo apontando o feixe de laser para o material de fundo preto e pressione o conjunto Auto BK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de pré-digitalização do mouse
<ol><li>Configure a câmara de indução de isoflurane com a retirada adequada do gás residuais. NOTA: Colocar a câmara de indução em uma almofada de aquecimento ajudará a evitar a perda de temperatura do rato durante a indução da anestesia.</li>
	<li>Ligue a manta homeotérmica, que é colocada na área de varredura sob uma superfície não refletida (neste caso um tecido de neoprene preto). Coloque a manta homeotémica para manter uma temperatura corporal de 37 °C.</li>
	<li>Posicione a sonda de temperatura para a manta homeômica e lubrificante para que estejam prontos para inserção.</li>
	<li>Coloque a máscara de anestesia e o sistema de limpeza na área de digitalização.</li>
	<li>Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano. Ajuste a taxa de oxigênio para 1 L/min de fluxo e ajuste o isoflurane para 4% para indução de anestesia. Ligue o fluxo para a câmara de indução da anestesia, e a taxa de respiração do rato diminuirá. A anestesia adequada é alcançada quando o rato perde o reflexo de redomamento.</li>
	<li>Transfira o mouse para uma máscara anestésico/cone de nariz com carniceiro de gás de resíduo ligado e ajuste o isoflurane para 1,5%. NOTA: Este nível de anestesia é geralmente adequado para manter o rato relativamente parado durante a varredura, mas não se destina a fornecer níveis cirúrgicos de anestesia, de modo que a profundidade da anestesia não é verificada. A mudança do nível isoflurane causa alterações nos batimentos cardíacos, respiração e perfusão dérmica, de modo que uma porcentagem consistente deve ser usada durante qualquer experimento de curso de tempo e para todos os sujeitos experimentais. Técnicas anestésicas alternativas, como a injeção de IP de xilazina de cetamina também podem ser usadas, mas a mesma técnica anestésica deve ser usada ao longo de qualquer estudo de curso de tempo, pois diferentes anestésicos afetam a perfusão dérmica de forma diferente.</li>
	<li>(Opcional dependendo da área de digitalização) Se a região planejada de interesse a ser escaneada for coberta por peles, use um pequeno aparador elétrico ou creme depilatório para remover os cabelos da região de interesse. NOTA: O creme depilatório deve ser completamente removido, e a pele do rato seca antes da digitalização.</li>
	<li>Coloque o mouse na posição de varredura apropriada na superfície nãoreflectiva preta que cobre a manta homeotérmica, confirmando que ambos os blocos traseiros permanecem na fonte de calor durante todo o equilíbrio e varredura(Figura 1). NOTA: É importante manter os dois pés na manta homeotérmica para evitar a variação regional da temperatura.</li>
	<li>Insira a sonda de temperatura retal lubrificada associada à manta homeotérmica.</li>
	<li>Equilibre a temperatura do mouse à temperatura de varredura desejada (37 °C); aproximadamente 5-10 minutos.</li>
	<li>Selecione Configuração do scanner, que pode ser acessada no menu superior ou no ícone de configuração do scanner. Ajuste a área de varredura alterando as coordenadas X-Y para acomodar a região de interesse. A velocidade do scan dependerá da resolução do scan. Uma resolução mais alta resultará em tempos de varredura mais longos. Para a repetição da varredura com foco na perfusão global, em oposição à maior resolução com foco na perfusão anatômica, uma velocidade de varredura de 4 ms/pixel é adequada. NOTA: Deve-se considerar maior resolução e tomografia única se o pesquisador estiver tentando estudar diretamente a circulação colateral em desenvolvimento (melhor imagem na coxa ventral e na panturrilha onde está mais próxima da pele). A varredura repetida em menor resolução/velocidade (por exemplo, 4 ms/pixel) é adequada ao avaliar a perfusão global ao órgão final do footpad do mouse. O software mostrado no vídeo carrega automaticamente o modelo usado anteriormente para área de digitalização, velocidade e resolução quando reiniciado, ou pode ser recuperado de um arquivo armazenado se diferentes regiões de interesse estiverem sendo usadas para vários experimentos.</li>
	<li>Se realizar varreduras repetidas, selecione a guia 'Verificar repetição e de linha'. O número de varreduras pode ser alterado (neste caso 3 varreduras) bem como o intervalo de repetição. O tempo mínimo para o intervalo de repetição seria o tempo estimado de varredura, que é mostrado na área acinzentado à direita da caixa determinada pela área de varredura e resolução de varredura. Adicionar alguns segundos permite ao usuário pausar e potencialmente reposicionar o mouse se necessário entre as varreduras.</li>
</ol>3. Digitalização
<ol><li>Selecione a guia Varredura de imagens e selecione o botão Marcar. O laser se moverá para delinear a área de varredura. Ajuste a posição do mouse para que o alvo a ser escaneado esteja dentro da área marcada. NOTA: Para o footpad ou footpad e a varredura da panturrilha, o posicionamento propenso com as plataformas traseiras estendidas fornece uma região de interesse mais consistente do que o posicionamento supino. A artéria femoral e artéria safena e as colaterais estão muito próximas da superfície ventral da coxa e da panturrilha, por isso o posicionamento supino é preferido se usar essas regiões de interesse.</li>
	<li>Inicie a medição repetida selecionando o ícone "Repetindo" e pressione o botão Reproduzir para iniciar a varredura.</li>
	<li>Confirme a distância de digitalização na janela pop-up e clique em OK para iniciar a digitalização.</li>
	<li>Monitorar o mouse durante a varredura para o movimento do mouse; se o mouse se mover o suficiente para que as patas traseiras não estejam mais na região de digitalização no meio de uma varredura, reinicie a varredura. Pequenas variações na posição de pata traseira do mouse podem ser acomodadas no software de análise.</li>
	<li>Monitore a temperatura do mouse durante o processo de varredura, pois ele pode flutuar mesmo com o uso da manta homeotérmica. Se houver muita variação na temperatura do mouse, isso pode resultar em uma variação significativa entre os scans. Geralmente, uma faixa de temperatura de 36,8-37,2 °C resultará em dados aceitáveis.</li>
	<li>Salve a varredura capturada sob a janela Salvar como um nome de arquivo que inclui identificador de mouse e ponto de tempo para uma análise de dados mais fácil. Digite os detalhes do mouse e do ponto de tempo, se desejar na janela de detalhes do assunto.</li>
	<li>Desligue o isoflurane e remova a sonda de temperatura retal.</li>
	<li>Desinfete a sonda de temperatura retal com 70% de etanol para que esteja pronta para uso no próximo mouse.</li>
	<li>Deixe que o mouse se recupere da anestesia até o ponto em que exibe um reflexo de direita, invertendo da posição supina para a posição propensa antes de devolvê-lo à gaiola. NOTA: A recuperação pode ser realizada em um cobertor de aquecimento para isoflurane, uma vez que a recuperação é muito rápida ou em uma gaiola de recuperação aquecida para cetamina/xilazina.</li>
</ol>4. Captura de dados LDPI(Figura 3)
<ol><li>Abra o programa de software de revisão de imagens.</li>
	<li>Vá para o menu do arquivo, abra e localize o arquivo salvo.</li>
	<li>Selecione o ícone ROI na barra de ferramentas.</li>
	<li>Selecione o botão Adicionar polígono.</li>
	<li>Rastreie a região de interesse (ROI) para a montagem traseira de controle usando o mouse. O rastreamento do polígono não precisa ser exato, pois o fundo cinza não será incluído nas médias calculadas.</li>
	<li>Repita as etapas 4.3-4.5 para a etapa posterior cirúrgica.</li>
	<li>Escolha o ícone Estatísticas para abrir a janela RESULTADOS ESTATÍSTICAS de ESTATÍSTICAS (PU) da Imagem ROIs.</li>
	<li>Exporte os resultados para Polygon 1 (controle hindlimb) e Polygon 2 (hindlimb cirúrgico) para uma planilha de coleta de dados via cópia/pasta.</li>
</ol>5. Análise
<ol><li>Capture os dados como relação Cirúrgica/Controle para cada varredura.</li>
	<li>Use a média cirúrgica/controle para todas as três varreduras para o ponto de dados para esse mouse em particular nesse ponto de tempo. Devido à variabilidade biológica na resposta à isquemia de subida traseira, em geral são necessários 8-10 camundongos por ponto de tempo para alcançar resultados reprodutíveis com ~10% de erro padrão. NOTA: Antes de permitir que o mouse se recupere da anestesia, vale a pena realizar uma análise rápida das varreduras repetidas para verificar se os dados são muito variáveis (por exemplo, mais de 100-150 unidades de perfusão diferentes entre as varreduras 1-3). A alta variação entre as varreduras repetidas sugere que o mouse não foi completamente equilibrado durante a varredura(Figura 2), e uma varredura repetida pode ser realizada sem perder um datapoint, o que ocorreria se as imagens não fossem analisadas até uma data posterior. Alterar a paleta de cores para otimizar a gama dinâmica de valores de fluxo exibidos pode ser necessário para exibir melhor a variação de varredura(Figura 2).</li>
</ol>

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</ol>

Tang não tem conflitos de interesse para revelar.

A técnica consistente é fundamental para obter resultados confiáveis com LDPI. O mesmo anestésico, as configurações de temperatura, a posição do mouse e a região de interesse devem ser usadas durante todo o curso de tempo. Diferentes agentes anestésicos resultarão em valores de perfusão maiores ou menores9. A anestesia isoflurane é conveniente devido ao seu rápido início e emergência, bem como à segurança geral. Uma porcentagem consistente de isoflurane deve ser usada como profundidade de anestesi...

A ulceração da pele com cicatrização inadequada da ferida é uma das principais causas de amputações em pacientes humanos1. A cicatrização adequada da ferida requer níveis mais elevados de perfusão arterial do que os necessários para manter a pele intacta, que está comprometida em pacientes com doença arterial periférica2,3,4. Várias outras condições reumatológicas e diabetes também podem levar a microcirculação de pele perturbada e inadequada para curar feridas5,6. Muitos pacientes diabéticos têm doença arterial periférica concomitante, colocando-os em risco especialmente alto de amputação. A imagem de perfusão do doppler laser (LDPI) é utilizada em situações clínicas para avaliar a microcirculação da pele, bem como em situações de pesquisa para avaliar o fluxo sanguíneo e a recuperação do fluxo sanguíneo após isquemia experimental de retalhos, isquemia-reperfusão e retalhos microcirúrgicos7.
O sistema LDPI projeta um raio laser de baixa potência que é desviado por um espelho de varredura para se mover sobre uma região de interesse. Isso difere da escoamento do Laser Doppler, que fornece uma medição de perfusão para a pequena área do tecido em contato direto com a sonda de esvoaçamento8. Quando o raio laser interage com o sangue em movimento na microvasculatura, ele sofre uma mudança de frequência Doppler, que é fotodesensificada pelo scanner e convertida em unidades arbitrárias de perfusão. Como o LDPI é uma técnica baseada na luz, é limitado em termos de profundidade de penetração a 0,3-1 mm, o que significa que na maior parte a perfusão dérmica é avaliada7. O fluxo dérmico pode ser alterado pela temperatura da pele e pelo sistema nervoso simpático, que pode ser afetado por vários agentes anestésicos9. As medidas do laser óptico também são afetadas por condições de iluminação ambiente, pigmentação da pele, e podem ser bloqueadas por peles oucabelos excessivos 7.
O LDPI é a técnica de pesquisa mais usada para monitorar a recuperação da perfusão após a isquemia porque não é invasiva, não requer administração de contraste, e tem tempos de varredura rápidos permitindo a coleta de dados em vários animais. Isso torna ideal ajudar a determinar se tratamentos voltados para arteriogênese terapêutica ou angiogênese são eficazes em pequenos modelos animais. A recuperação do fluxo sanguíneo após a isquemia de subida traseira medida medida pelo LDPI correlaciona-se bem com o desenvolvimento colateral da artéria quando avaliada por outros meios como fundição de Microfil ou micro-CT10,11. O objetivo deste protocolo é demonstrar a avaliação da perfusão de liminar por meio do LDPI.

<table><tbody><tr>Material <td></td><td></td><td>preto não reflexivo</td><td>Loja de tecidos, neoprene preto recomendado pela empresa</td></tr><tr><td>F/air cannister</td><td>A.M. Bickford Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Manta homeotérmica com sonda de metal rígida</td><td>Aparelho</td><td></td> de Harvard <td>Também vem com sonda flexível, mas esta é menos durável</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia com isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td>Vários fabricantes</td></tr><tr><td>Câmara de indução de isoflurano</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td>câmara de 2 L</td></tr><tr><td>Imageador de perfusão Doppler laser Moor</td><td>Instruments</td><td>MoorLDI2-IR</td><td>Imageador de alta resolução (MoorLDI2-HIR)</td></tr><tr><td>Cone</td><td></td><td></td> nasal de anestesia de camundongo <td>Vários fabricantes</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td><td></td> de oxigênio <td>Vários fabricantes</td></tr><tr><td>Surgilube</td><td>Distribuidores múltiplos</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

A recuperação do fluxo sanguíneo é uma medida crítica após isquemia de subida experimental ou reperfusão de isquemia. A imagem de perfusão do doppler laser (LDPI) é um método comum, não invasivo e repetitivo para avaliar a recuperação do fluxo sanguíneo. A técnica calcula o fluxo sanguíneo geral no tecido amostrado da mudança do Doppler na frequência causada quando um laser atinge glóbulos vermelhos em movimento. As medidas são expressas em unidades arbitrárias de perfusão, de modo que o contralateral não intervindo sobre a perna é geralmente usado para ajudar a controlar as medidas. A profundidade de medição está na faixa de 0,3-1 mm; para isquemia de cetam hind, isso significa que a perfusão dérmica é avaliada. A perfusão dérmica depende de vários fatores — o mais importante é a temperatura da pele e o agente anestésico, que deve ser cuidadosamente controlado para resultar em leituras confiáveis. Além disso, a pigmentação do cabelo e da pele pode alterar a capacidade do laser de alcançar ou penetrar na dermis. Este artigo demonstra a técnica de LDPI no bloco traseiro do mouse.

O LDPI bem-sucedido deve resultar em medidas repetidas consistentes, com variação de unidade de perfusão de 100-150 (correspondente a cerca de 10% da perfusão média usual para o footpad do mouse) entre as três varreduras(Figura 2). Como demonstrado na Figura 2,as repetições ajudam a determinar que o camundongo foi adequadamente equilibrado de modo que a razão isquêmica/controle reflete melhor o fluxo sanguíneo subjacente em oposição à variação da perfusão dérmic...

Aqui, apresentamos um protocolo que demonstra a técnica e os controles necessários para a imagem de perfusão do Doppler laser para medir o fluxo sanguíneo na linha traseira do rato.

Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

A ulceração da pele com cicatrização inadequada da ferida é uma das principais causas de amputação em pacientes humanos. A cicatrização adequada da ferida requer níveis mais elevados de profusão arterial que são necessários para manter a pele intacta, que está comprometida em pacientes com doença arterial periférica. Várias outras condições reumatológicas e diabetes também podem levar a microcirculação de pele perturbada e inadequada para curar feridas.Muitos pacientes diabéticos têm doença arterial periférica concomitante, colocando-os em risco especialmente alto de amputação. A imagem de perfusão do doppler laser ou LDPI é usada em situações clínicas para avaliar a microcirculação da pele, bem como em situações de pesquisa para avaliar o fluxo sanguíneo e a recuperação do fluxo sanguíneo após isquemia experimental de retalhos, reperfusão de isquemia e retalhos microcirúrgicos. O sistema LDPI projeta um raio laser de baixa potência que é desviado por um espelho de varredura para se mover sobre uma região de interesse.Isso difere da escoamento do doppler laser, que fornece uma medição de perfusão para a pequena área do tecido em contato direto com a sonda de esvoaça. Quando o raio laser interage com o sangue em movimento na microvasculatura, ele sofre uma mudança de frequência Doppler que é fotodesensificada pelo scanner e convertida em unidades arbitrárias de perfusão. Como o LDPI é uma técnica baseada na luz, é limitado em termos de profundidade de penetração de 0,3 a 1 milímetro, o que significa que na maior parte a perfusão dérmica é avaliada.O fluxo dérmico pode ser alterado pela temperatura da pele e pelo sistema nervoso simpático, que pode ser afetado por vários agentes anestésicos. As medidas do laser óptico também são afetadas por condições de iluminação ambiente, pigmentação da pele e podem ser bloqueadas por peles ou cabelos excessivamente. O LDPI é a técnica de pesquisa mais usada para monitorar a recuperação da profusão após a isquemia por não ser invasiva, não requer administração de contrastes e tem tempos de varredura rápidos permitindo a coleta de dados em vários animais.Isso torna ideal ajudar a determinar se tratamentos voltados para arteriogênese terapêutica ou angiogênese são eficazes em pequenos modelos animais. A recuperação do fluxo sanguíneo após a isquemia de subida traseira medida medida pelo LDPI correlaciona-se bem com o desenvolvimento da artéria colateral quando avaliada por outros meios, como fundição de microfilme ou microC. O objetivo deste protocolo é demonstrar a avaliação da perfusão de liminar por meio do LDPI. Ajuste a altura do scanner de modo que a distância até o objeto da varredura seja de aproximadamente 30 centímetros.Ligue o imager e inicie o software associado. Abra o programa de medição. Se o software estiver se comunicando corretamente com o scanner, o laser infravermelho ativará o aviso aparecerá.Ajuste as configurações do scanner para ser apropriado para o material de fundo e a configuração de iluminação na sala. Defina o limiar de fundo apontando o feixe de laser para o material de fundo preto e pressione Auto BK Set. Configure a câmara de indução de isoflurane com a limpeza adequada do gás residuado.Colocar a câmara de indução em uma almofada de aquecimento ajudará a evitar a perda de temperatura do rato durante a indução da anestesia. Ligue a manta homeotérmica, que é colocada na área de varredura sob uma superfície não reflexiva. Neste caso, um tecido de neoprene preto.A manta homeotérmica está programada para manter uma temperatura corporal de 37 graus Celsius. Posicione a sonda de temperatura e os lubrificantes para que estejam prontos para inserção. Coloque a máscara facial da anestesia e o sistema de limpeza na área de varredura também.Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano. A taxa de oxigênio é fixada em um litro por minuto de fluxo. E o isoflurane é ajustado para 4% para indução de anestesia.O fluxo é ligado à câmara de indução da anestesia e a taxa de respiração do rato diminuirá. A anestesia adequada é alcançada quando o rato perde o reflexo de redomamento. Transfira o rato para um cone de nariz de máscara anestésico com carniceiro de gás de resíduo ligado e ajuste o isoflurane para 1,5%Este nível de anestesia é geralmente adequado para manter o rato deitado relativamente parado durante a varredura, mas não se destina a fornecer níveis cirúrgicos de anestesia.Assim, a profundidade da anestesia não é verificada. Mudar o nível isoflurane causa alterações na frequência cardíaca, respiração e profusão dérmica. Assim, uma porcentagem consistente deve ser usada em qualquer experiência de curso de tempo e para todos os sujeitos experimentais.Técnicas anestésicas alternativas, como a injeção de IP de xilazina de cetamina também podem ser usadas, mas a mesma técnica anestésica deve ser usada ao longo de qualquer estudo de curso de tempo, pois diferentes anestésicos afetam a profusão dérmica de forma diferente. Se a região de interesse do plano a ser escaneada for coberta por peles, use um pequeno aparador elétrico e/ou creme depilatório para remover os cabelos da região de interesse. Os cremes depilatórios devem ser completamente removidos e a pele do rato seca antes da varredura, pois a pele molhada pode causar reflexos do laser Insira a sonda de temperatura retal lubrificada associada à manta homeotérmica no reto do rato.Equilibre a temperatura do mouse para desejar temperatura de varredura, 37 graus Celsius. Isso pode levar de cinco a 10 minutos. Selecione A configuração do scanner que pode ser acessada no menu superior ou no ícone de configuração do scanner.A área de varredura deve ser ajustada alterando as coordenadas X, Y para acomodar a região de interesse. A velocidade do scan dependerá da resolução do scan. Uma resolução mais alta resultará em tempos de varredura mais longos.Para a repetição da varredura, com foco na profusão global, em oposição à maior resolução com foco na perfusão anatômica, a maior velocidade de varredura de quatro milissegundos por pixel é adequada. Se realizar varreduras repetidas, selecione a guia 'Verificar repetição e de linha'. O número de exames pode ser alterado.Neste caso, três varreduras, bem como o intervalo de repetição. O tempo mínimo para o intervalo de repetição seria o tempo estimado de varredura mostrado na área acinzentado à direita da caixa, determinado pela área de varredura e resolução de varredura. Adicionar alguns segundos permite ao usuário pausar e potencialmente reposicionar o mouse se necessário entre as varreduras.O tempo total de varredura neste caso é de três minutos e 21 segundos. Selecione a guia Varredura de imagens e selecione o botão Marcar. Isso fará com que o laser delineie a área de varredura.Ajuste a posição do mouse para que o alvo a ser escaneado esteja dentro da área marcada. Inicie a medição repetida selecionando o ícone "Repetindo" e pressionando o botão Reproduzir para iniciar a varredura. Uma janela pop-up confirmando a distância de varredura aparecerá.Clique em OK para iniciar a digitalização. A varredura inicial de um rato antes da indução da isquemia de subida traseira é mostrada em tempo real. A segunda e terceira repetições são aceleradas para 16x de velocidade.A janela principal mostra os resultados da varredura como ela é gerada pelo software. O inset no canto inferior direito mostra o laser escaneando os footpads do mouse. Para o footpad ou footpad e a varredura dorsal da panturrilha, o posicionamento propenso com os blocos traseiros estendidos em direção à cauda fornece uma região mais consistente de interesse em posicionamento supino.A artéria femoral, artéria safena e as garantias estão muito próximas da superfície ventral da coxa e da panturrilha. Assim, o posicionamento supino é preferido se usar essas regiões de interesse. Monitore o mouse durante a varredura para obter o movimento do mouse.Se o mouse se mover o suficiente para que os footpads não estejam mais na região de varredura no meio de uma varredura, reinicie a varredura. Pequenas variações na posição do footpad do mouse podem ser acomodadas para o software de análise. Além disso, monitore a temperatura do mouse durante o processo de varredura, pois ele pode flutuar mesmo com o uso da manta homeotérmica.Se houver muita variação na temperatura do mouse, isso pode resultar em uma variação significativa entre os scans. Geralmente, uma faixa de temperatura de 36,8 a 37,2 resultará em dados aceitáveis. Salve a varredura capturada sob a janela Salvar Como com um nome de arquivo que inclui identificador do mouse e ponto de tempo para facilitar a análise de dados.Digite os detalhes do mouse e do ponto de tempo, se desejar na janela Detalhes do assunto. A varredura de subida ventral com o mouse na posição supina é mostrada aqui após ajuste da área de varredura. Observe que a proposição com o supino do mouse resulta em uma porção variável do lado do pé sendo escaneado.Remova a sonda de temperatura retal e desinfete-a com 70% de etanol para que esteja pronto para o próximo mouse. Diminuir a isoflurano para 0%O rato se recuperará mais rápido se continuar recebendo oxigênio, mas também pode ser recuperado sem oxigênio suplementar. Deixe que o mouse se recupere da anestesia até o ponto em que exibe um reflexo de direita, invertendo da posição supina para a posição propensa antes de devolvê-lo à gaiola.A recuperação pode ser realizada em um cobertor de aquecimento para isoflurane, uma vez que a recuperação é muito rápida ou em uma gaiola de recuperação quente para xilazina de cetamina. Abra o programa de software de revisão de imagens. Uma nova janela para revisar as varreduras será aberta.Vá para o menu Arquivo, Abra e localize o arquivo salvo. Selecione o ícone ROI na barra de ferramentas. Selecione o ícone Adicionar polígono.Rastreie uma área ao redor da região de interesse usando o mouse. Quando terminar, volte para a barra de ferramentas e selecione o ícone Estatísticas. Isso trará uma janela mostrando estatísticas da região de interesse.Na revisão dos dados, a unidade de profusão média, ou PU, os valores não variam mais de 100 a 150 PUs sobre as varreduras repetidas para cada footpad. Esta é uma varredura aceitável e indica que o mouse foi bem equilibrado durante a varredura. Valores médios de PU com variação superior a 100 a 150 UIs, o que corresponde a mais de 10% da perfusão média para um footpad de rato não operado sobre os scans repetidos indicaria que o mouse não estava bem equilibrado e uma repetição é fortemente sugerida.Realizar uma análise rápida imediatamente após a conclusão da varredura permite que uma varredura repetida seja realizada enquanto o mouse ainda está anestesiado e evitar a perda de um ponto de dados que poderia ocorrer se as varreduras forem analisadas posteriormente e uma varredura for considerada inaceitável devido à variação significativa entre os scans repetidos. Os resultados são expressos como uma razão de profusão de hindlimb cirúrgico sobre a perfusão de subida traseira de controle como camundongos inicialmente vasodilatados e, em seguida, desenvolver suas garantias intrínsecas, a recuperação do fluxo sanguíneo pelo LDPI deve ser vista ao longo de um curso de tempo pós-operatório. O grau de recuperação depende da tensão do camundongo e da gravidade do modelo de isquemia de cetameira.Esta figura mostra um experimento de curso de tempo completo ao longo de 28 dias onde o LDPI foi usado para medir a recuperação do fluxo sanguíneo do footpad ao longo do tempo após a ligadura da artéria femoral e o nocaute P27 e ratos do tipo selvagem C57Bl/6. Ambos os nocautes P27 em camundongos do tipo selvagem tiveram a recuperação do fluxo sanguíneo prejudicada quando tratados com doxiciclina oral, um inibidor de metaloproteinases matriz generalizada, sugerindo que a atividade de MMP facilita a arteriogênese. A configuração de ganhos e o limiar de fundo devem ser mantidos constantes durante todo o experimento do curso de tempo.Se o limiar de fundo for definido muito baixo, a digitalização do material de fundo resultará em baixos valores de profusão. Isso resultará na média dos valores de profusão de fundo na região de interesse durante a seleção do polígono. Para eliminar esse problema, o limiar de fundo pode ser ajustado na janela Configuração do scanner sob a guia Geral.Neste caso, o aumento do limiar de fundo para 118 unidades de profusão resulta no fundo cinza que não será incluído em nenhuma análise. A paleta ou escala de cores para a imagem de fluxo pode ser ajustada tanto no software de medição quanto no software de revisão de imagem. Todos os valores de profusão maiores que o valor máximo na escala serão exibidos como a cor de profusão mais alta.Neste caso, vermelho. O aumento do alcance dinâmico, por exemplo, mudando a escala para variar de zero a 1500, tornará a variação de varredura repetida mais óbvia aos olhos, pois áreas que medem entre 1000 e 1500 unidades de profusão serão agora exibidas usando o gradiente de cor em vez de todas serem mostradas como vermelhas. A varredura mostrada aqui foi obtida em um rato cuja temperatura corporal principal estava inicialmente abaixo de 36,8 no início do exame repetido e, em seguida, aumentou ao longo dos scans repetidos.Note que a profusão média do footpad de controle foi mais efetuada pela temperatura corporal do núcleo mais frio do que o footpad isquêmico. Uma única varredura da temperatura corporal mais fria teria resultado em uma maior proporção de profusão sendo registrada para este ponto de dados. A variação na pigmentação da pele do camundongo, como pode ser vista com camundongos C57Bl/6, pode resultar na área de varredura estar abaixo do valor do limiar de fundo, o que dificultará a análise de regiões de interesse contendo áreas pigmentadas.Os footpads do mouse em geral não têm hiperpigmentação, tornando esta a área mais conveniente para digitalizar esta cepa do mouse. Se o pesquisador deseja estudar o retrocesso ventral, então uma cepa de rato branco deve ser selecionada. O LDPI é um método eficaz, facilmente realizado e repetível para medir a profusão dérmica de medida hindlimb como reflexo da perfusão arterial geral.Técnica consistente é necessária ao usar LDPI para obter dados confiáveis.

laser-doppler-perfusion-imaging-in-the-mouse-hindlimb

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O procedimento cirúrgico para a indução de isquemia hindlimb unilateral é demonstrada, com a confirmação de isquemia por laser Doppler imagens de perfusão.

Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

A indução cirúrgica de isquemia de membros posteriores no camundongo é útil para examinar a angiogênese, no entanto, isso está comprometido em certas linhagens de camundongos que exibem necrose tecidual induzida por isquemia acentuada. São descritos métodos para induzir isquemia subaguda de membros usando constritores ameróides para contornar esse problema por meio da indução de oclusão arterial gradual.

Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

Vasodilatação induzida por insulina regula a perfusão muscular e aumenta o microvascular superfície (recrutamento microvascular) disponível para troca de soluto entre sangue e tecido do interstício. Combinado de microscopia intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado é apresentado para avaliar simultaneamente a ação da insulina em vasos maiores e a microcirculação in vivo.

Combinado de microscopia Intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado do membro posterior Mouse para estudar a vasodilatação induzida por insulina e perfusão muscular

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

Aqui apresentamos uma combinação de perfusão de Doppler laser de imagem (LDPI) e do laser Doppler perfusão monitoramento (LDPM) para medir spinal cord fluxos de sangue local e saturação de oxigênio (SO2), bem como um procedimento padronizado para a introdução da medula espinhal trauma no rato.

Usando Laser Doppler Imaging e acompanhamento para analisar a microcirculação na medula espinhal em ratos

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

A ultrassonografia Doppler ultrarrápida (UFUS) com alta resolução espacial (100 μm) e sensibilidade representa uma modalidade de imagem não invasiva adequada para obter uma visão qualitativa abrangente da vasculatura hepática. O UFUS também facilita as medições quantitativas da microvasculatura, com o objetivo de melhorar nossa compreensão dos mecanismos das doenças vasculares.

Imagem e quantificação da vasculatura hepática de camundongos usando ultrassom Doppler ultrarrápido

Um procedimento cirúrgico minimamente invasivo é mostrado aqui, que envolve a colocação da sonda Doppler a laser no crânio sobre a região distal da artéria cerebral média (ACM), um local periorbital adequado para ratos e camundongos, para avaliar o fluxo sanguíneo durante a oclusão transitória da ACM.

Colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral antes da oclusão da artéria cerebral média em modelos de roedores

Um sistema de imagem de contraste a laser foi utilizado para monitorar as mudanças no fluxo sanguíneo microvascular renal durante a isquemia-reperfusão unilateral renal após a resseção do rim direito em camundongos.

Perfusão Microvascular Monitorada por Imagem de Contraste Speckle-Laser durante Lesão por Isquemia-Reperfusão Renal em Camundongos

Aprenda a técnica de imagem de perfusão por laser Doppler para avaliar o fluxo sanguíneo no membro posterior de camundongos. Este método não invasivo auxilia pesquisadores a estudar a microcirculação cutânea e a cicatrização de feridas.

Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

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