Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker
April 11th, 2021
O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.
Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Sua disfunção é uma fonte bem conhecida de doença humana. As mitocôndrias de levedura de Baker contêm genoma circular codificando oito proteínas.
Neste vídeo, descrevemos o protocolo usado para avaliar a biossíntese proteica em mitocôndrias de leveduras por meio da rotulagem radioativa de produtos translacionais e posterior separação por eletroforese gel. O procedimento inclui várias etapas importantes. Leveduras de listras de culturas de estoque congelado em placas frescas com meio apropriado.
Coloque as placas na incubadora de cultura a 30 graus por 24 a 48 horas. Inocular essas culturas em dois mililitros de médio da raia fresca em um tubo de 15 mililitros e incuba-los durante a noite agitando a 200 RPM a 30 graus. Meça a densidade óptica da cultura no comprimento de onda de 600 nanômetros.
Leve o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis Paleta células de levedura a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente. Descarte este supernatante. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos.
Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. Células diluídoras em dois mililitros de meio de ágar fresco.
A borda incubada é de 200 RPM e 30 graus até que a densidade óptica atinja de 1,5 a 1,9 de 1,5 a 1,9 graus. Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica no tubo de micro centrífuga. Gire os tubos a 3000 G por um minuto.
Descarte o supernaspeso. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente Descarte o supernasce.
Suspenda des suspenda as células de levedura em 0,5 mililitros de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em tubo de 15 mililitros. Adicione cicloheximida à suspensão celular até a concentração final de 0,2 miligramas por mililitro Incubate por cinco minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus para inibir a tradução citosolica.
Adicione de 25 a 30 Adicione de 25 a 30 microcurias de metanfetamina S35 de methionina S35 à suspensão celular e incubar por 30 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Adicione methionina fria sem rótulo e bormicina para parar a rotulagem Incubate por 10 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 G por 30 segundos.
Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso.
Adicione 75 microliters de tampão de lise à paleta e vórtice por cinco a 10 segundos. Adicione 500 microliters de 0,5 amortecedor molar tris de 0,5 amortecedor molar tris com pH 6.8. Com pH 6,8.
Vórtice brevemente. Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Vórtice por cinco segundos.
Adicione 150 microliters de clorofórmio à amostra. Vórtice por cinco segundos. Centrifugar as amostras por dois minutos a 12.000 G.Descarte cuidadosamente opaface com um amostrador.
Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes. Amostras centrífugas por dois minutos a 12.000 G.Descarte supernatante.
Atee o pouco o palette por dois minutos a 80 graus. Dissolver proteínas precipitadas em 60 microliters de tampão amostral de Laemmli. Aqueça as amostras por 10 minutos a 14 graus.
Cause o gel de poliacrilamida De 17,5% Laemmli SDS. Carregue 15 microliters de cada amostra nos bolsos. Execute o gel na sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do linfático de gel.
Manche o gel com azul brilhante Kumasi e faça a varredura ou foto que é necessária como controle de carregamento. Seque o gel na secadora de gel. Mantenha-o no com tela de fósforo de armazenamento por três a cinco dias.
Escaneie a tela no imager fosforo. Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de Saccharomyces cerevisiae. O tipo selvagem e a exclusão da variante mutante do gene Aim23 codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial três.
Os produtos de tradução mitocondrial já foram ativamente rotulados e separados no gel de poliacrilamida desnaturação. As amostras foram coletadas a cada dois minutos e meio antes da saturação para construir o curso do tempo. O gel foi manchado, seco e exibido após os cinco dias de exposição.
No caso de um experimento bem sucedido, a imagem demonstra oito bandas atribuídas de acordo com o padrão padrão. No entanto, as intensidades das bandas individuais podem ser altamente variáveis dependendo da tensão e das condições experimentais. Cada banda corresponde a um produto de tradução.
Os dados sugerem que a cepa mutante é capaz de síntese de proteína mitocondrial porque todos os produtos que aparecem no tipo selvagem são visíveis neste mutante. No entanto, as intensidades das bandas são diferentes do tipo selvagem, o que significa que essa exclusão do Aim23 afeta a expressão genética mitocondrial. Kumasi fabricado em mancha azul e serve como um controle de carga.
Seu resultado em dados pode ser quantificado para identificar diferenças entre cepas ou condições experimentais usando o software Image G ou Image Quan. Para estes, a razão do sinal correspondente a cada produto é calculada para o sinal total. Valores médios e desvios padrão são calculados em pelo menos três experimentos independentes.
A cinética da proteína sintetizada virada é estudada em um experimento do ano passado. As amostras são coletadas nos pontos de tempo indicados após a reação de rotulagem ser interrompida por metoionina fria e boromicina. Este controle é necessário para estimar a estabilidade do produto.
A imuno-coloração com anticorpos anti-porin é um controle de carga. Descrevemos o método, que é frequentemente usado para estudar biossíntese de proteínas em mitocôndrias de levedura. Este protocolo é relativamente simples e rápido de executar.
Ao mesmo tempo, permite obter informações valiosas sobre a taxa de tradução de quatro mRNAs mitocondrial de levedura, o que é altamente vantajoso. No entanto, possui várias limitações que requerem experimentos adicionais e está nestes níveis interestaduais de proteínas e mRNAs. Ele pode fornecer as informações sobre essas funções no sistema de tradução mitocondrial, mas técnicas mais avançadas devem ser usadas para descobrir o mecanismo.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para rotulagem e visualização dos oito polipeptídeos codificados pelo genoma mitocondrial da levedura de Baker. O método envolve a rotulagem radioativa de produtos traducionais seguida de eletroforese em gel.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Fundamentos
- As mitocôndrias são cruciais para a respiração aeróbica nas células eucarióticas.
- A disfunção das mitocôndrias está ligada a várias doenças humanas.
- A levedura de Baker tem um genoma mitocondrial circular.
- Este genoma codifica oito proteínas essenciais.
Objetivo do Estudo
- Rotular todos os polipeptídeos codificados pelo genoma mitocondrial da levedura.
- Visualizar esses polipeptídeos como bandas separadas.
- Melhorar a compreensão da biossíntese de proteínas mitocondriais.
Métodos Utilizados
- Rotulagem radioativa de produtos traducionais.
- Separação de proteínas rotuladas usando eletroforese em gel.
- Streak de levedura a partir de culturas de estoque congeladas em placas frescas.
- Utilização de meio apropriado para o crescimento da levedura.
Principais Resultados
- Rotulagem bem-sucedida de todos os oito polipeptídeos mitocondriais.
- Visualização dos polipeptídeos como bandas distintas no gel.
- Demonstração da eficácia do protocolo em ensaios de biossíntese de proteínas.
- Insights sobre a função mitocondrial e síntese de proteínas.
Conclusões
- O protocolo rotula e visualiza efetivamente as proteínas mitocondriais.
- Este método pode ser aplicado a estudos adicionais sobre a função mitocondrial.
- Compreender esses processos é vital para abordar doenças mitocondriais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative labeling and visualization of mitochondrial translation products in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of mitochondrial gene expression and protein biosynthesis. This capability is critical for mechanistic de-risking in early discovery, particularly when evaluating the impact of genetic perturbations on organellar function. The method supports portfolio decisions by providing robust, comparative data on mitochondrial translation across wild-type and mutant strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial translation rates for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic modifications on mitochondrial protein synthesis.
- Facilitates comparative analysis between wild-type and mutant strains to clarify pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for isolating and quantifying mitochondrial translation products.
- Delivers reproducible, quantitative banding patterns for assay standardization and downstream screening.
- Enables reliable detection of biosynthetic defects for compound or genetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial translation outputs with disease-relevant models when mitochondrial dysfunction is implicated.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative assessment of mitochondrial gene expression.
- Provides mechanistic insight into translation defects relevant to mitochondrial pathobiology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, where mitochondrial function is a key readout.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying translation of mitochondrial-encoded proteins under different genetic backgrounds.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for comparing biosynthetic rates across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of band intensities to compare translation efficiency and stability.
- Translational Research: Connects mitochondrial translation data to disease-relevant phenotypes in yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial translation analysis across multiple genetic or pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for mitochondrial translation analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, comparative data on mitochondrial biosynthesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on mitochondrial translation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, radiolabeling, and protein electrophoresis.
- Needs access to phosphorimaging and quantitative gel analysis infrastructure.
- Demands rigorous controls and replication to ensure data reliability and cross-team comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for translation specificity.
- Interpretation of translation rates must consider additional experiments for mechanistic conclusions.
