Name: Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a rotular e visualizar oito polipeptídeos codificados pelo genoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae usando marcação radioativa e eletroforese em gel. Este método permite estudar a biossíntese de proteínas mitocondriais.

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Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Russa de Pesquisa Básica, bolsa número 18-29-07002. P.K. foi apoiado pela Atribuição Estadual do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, número de subvenção AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, bolsa número 075-15-2019-1659 (Programa do Centro Kurchatov de Pesquisa de Genoma). O trabalho foi parcialmente feito no equipamento adquirido no quadro do Programa de Desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou. I.C., S.L., e M.V.B. foram apoiados adicionalmente pela bolsa da Universidade Estadual de Moscou "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Preparação da cultura da levedura
<ol><li>Leveduras de listras das culturas de estoque congelado em placas frescas com o meio apropriado. Coloque as placas em uma incubadora de cultura a 30 °C para 24-48 h. NOTA: Deixe os mutantes sensíveis à temperatura crescerem na temperatura permissiva.</li>
	<li>Culturas de levedura inoculada em 2 mL de meio YPGal (2% peptone, 1% extrato de levedura, 2% galactose) da raia fresca em tubos de 15 mL e incubar-as durante a noite agitando a 200 rpm a 30 °C.</li>
	<li>Meça a densidade óptica da cultura em um comprimento de onda de 600 nm (OD600).</li>
	<li>Pegue o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis, células de levedura de pelotização a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente e descarte o supernasce.</li>
	<li>Lave células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células diluís em 2 mL de meio YPGal fresco.</li>
	<li>Incubar agitação a 200 rpm e 30 °C até OD600 atingir 1,5-1,9 valores. NOTA: As taxas de crescimento da levedura variam, por isso esteja preparado para esperar. É razoável fazer as etapas 1.3-1.6 no início da manhã. Geralmente leva de 4 a 5 h, mas pode demorar mais.</li>
</ol>2. Incorporação de isótopos radioativos
<ol><li>Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica em um tubo de microcentrifuuagem. Gire os tubos a 3.000 x g por 1 min e descarte o supernaspe. Lave com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s.<ol>
<li>Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células de levedura resuspend em 0,5 mL de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em um tubo de 15 mL. NOTA: O buffer de tradução é uma solução que contém 2% de galactose (c/v) e fosfato de potássio de 50 mM com pH 6.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione cicloheximida à suspensão celular até uma concentração final de 0,2 mg/mL. Incubar por 5 min agitando a 200 rpm e 30 °C para inibir a tradução citosolica. NOTA: A solução de cicloheximida (20 mg/mL, no etanol) deve ser preparada fresca antes do experimento. O clorofenicol pode ser substituído com sucesso por anisomicina na mesma concentração7.</li>
	<li>Adicione 25-30 μCi de 35S-methionine à suspensão celular e incubar por 30 min agitando a 200 rpm e 30 °C. NOTA: A mistura de 35S-methionine e 35S-cisteína também pode ser usada. Pure 35S-methionine resulta no sinal mais forte e na melhor relação sinal-ruído. Geralmente, a methionina é mais eficaz que a cisteína porque o conteúdo deste aminoácido em proteínas mitocondriais é maior. No entanto, a mistura EasyTag de 35S-methionina e cisteína é menos cara e dá resultados comparáveis7. ATENÇÃO: 35S-methionina é radioativa. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de materiais radioativos. NOTA: É sabido que a incorporação da radioatividade atinge um limite devido ao qual o nível total de sinais se nivela ao longo do tempo. Uma vez alcançado esse limite, é quase impossível determinar as taxas pelas quais os diferentes produtos de tradução são sintetizados. Para analisar a taxa de tradução mitocondrial, é imprescindível estar em uma condição em que a intensidade do sinal aumenta com o tempo de incubação com 35S-metionina de forma linear. Para cepas de laboratório comuns, o sinal já está saturado para tempos de incubação muito mais curtos do que os 30 minutos. Mutantes translacionais podem se comportar de forma muito diferente. Um curso-período deve ser realizado para estabelecer a cinética da incorporação da radioatividade e, portanto, a taxa de tradução, pelo menos quando se trabalha com uma nova cepa. Para isso, sugerimos a coleta de amostras com um intervalo de vários minutos (por exemplo, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 min).</li>
	<li>Adicione methionina "fria" sem rótulo (concentração final deve ser de 20 mM) e puromycine (concentração final deve ser de 1-10 μg/mL) para parar a rotulagem. Incubar por 10 min agitando a 200 rpm e 30 °C. NOTA: Este passo é fundamental para dar tempo aos ribossomos para terminar a tradução dos peptídeos. Caso contrário, todos os polipeptídeos mais curtos do que o comprimento total serão detectados em um tamanho diferente. Um experimento de curso de tempo (pulse-chase) pode ser feito nesta etapa para determinar a estabilidade dos produtos de tradução mitocondrial. Para isso, continue a incubação coletando amostras com um intervalo de 30 minutos (por exemplo, 30, 60, 90 e 120 min).</li>
</ol>3. Lise celular de levedura e extração de proteínas
<ol><li>Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 x g para 30 s. Lave as células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. nota. O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as amostras a -20 °C.</li>
	<li>Adicione 75 μL de tampão de lise à pelota e vórtice para 5-10 s. NOTA: O tampão de lise é uma solução de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol e 1 mM PMSF na água. Evite a incubação excessiva com tampão de lise levando à hidrólise alcalina das proteínas. Imediatamente prossiga para a etapa 3.3.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 0,5 M Tris-HCl buffer com pH 6.8. Vórtice brevemente.</li>
</ol>4. Precipitação de proteínas
ATENÇÃO: Metanol e clorofórmio são solventes orgânicos. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de substâncias orgânicas.
<ol><li>Adicione 600 μL de metanol à amostra. Vórtice para 5 s.</li>
	<li>Adicione 150 μL de clorofórmio à amostra. Vórtice para 5 s.</li>
	<li>Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte cuidadosamente a fase superior com um sampler.</li>
	<li>Adicione 600 μL de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes.</li>
	<li>Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Seque a pelota por 2 min a 80 °C. NOTA: Todo o líquido deve evaporar. Há o risco de ter uma separação aberrante de proteínas no gel se a pelota foi seca insuficientemente. No entanto, não é possível secar demais a pelota, por isso pode até ser armazenada durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Dissolver proteínas precipitadas em 60 μL de 1x tampão amostral de Laemmli.</li>
	<li>Aqueça por 10 min a 40 °C. NOTA: Evite ferver as amostras a 95 °C, pois isso causa agregação. Se os agregados ainda se formarem, gire as amostras a 12.000 x g por 2 min e colete o supernaspeso. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C. O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>5. SDS-PAGE
<ol><li>Elenco o gel de 17,5% Laemmli SDS-poliacrilamida. NOTA: 6 M de ureia pode ser adicionada ao gel para resolver melhor ATP8 e ATP9. Gradient 15%-20% géis também podem dar melhor resolução.</li>
	<li>Carregar 15 μL (40-50 μg) de cada amostra nos bolsos. NOTA: Não é necessário medir a concentração proteica se os valores de600 OD estavam próximos na etapa 1.6. Caso não, meça as concentrações proteicas utilizando o ensaio com reagentes compatíveis com detergente.</li>
	<li>Execute o gel em uma sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do comprimento do gel. NOTA: Para o sistema utilizado (por exemplo, célula Protean II xi), usamos qualquer um dos dois modos: 16-17 h a 5 V/cm ou 5 h a 15 V/cm. Nenhuma proteína corre mais rápido que o corante azul bromofenol, mas longas corridas podem resultar em borrão de sinais atp8 e atp9.</li>
	<li>Manche o gel com coomassie azul brilhante e faça uma varredura ou foto, que é necessária como um controle de carregamento. NOTA: Uma maneira alternativa de fazer um controle de carregamento é a imunoblotação com um anticorpo para o gene mitocondrial "house-keeping", por exemplo, porin 1.</li>
</ol>6. Autordiografia
<ol><li>Seque o gel em uma secadora de gel. Mantenha-o no com uma tela de fósforo de armazenamento por 3-5 dias. NOTA: Uma alternativa para a triagem do gel seco é a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose por eletro-mancha e triagem posteriormente. Resulta em sinais mais fortes e bandas mais nítidas.</li>
	<li>Escaneie a tela em um fósforo. NOTA: Como alternativa à imagem de fósforo, a película de raios-X também pode ser usada para revelar os sinais.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos básicos que os pesqui...

Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana1. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas2. O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expressão genética mitocondrial devido a várias razões. Primeiro, seu genoma é completamente sequenciado3, bem anotado, e uma grande soma de dados já está disponível na literatura graças à longa história de investigações realizadas com esse organismo. Em segundo lugar, as manipulações com seu genoma nuclear são relativamente rápidas e fáceis devido à sua taxa de crescimento rápido e sistema de recombinação homólogo altamente eficiente. Em terceiro lugar, a levedura de padeiro S. cerevisiae é um dos poucos organismos para os quais as manipulações com genomas mitocondriais são desenvolvidas. Finalmente, a levedura do padeiro é um organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite o isolamento e o estudo de mutantes com defeito respiratório, uma vez que eles podem crescer em mídia contendo fontes de carbono fermentáveis.
Descrevemos o método para estudar a expressão genética mitocondrial da levedura de padeiro S. cerevisiae no nível translacional4. Seu princípio principal vem de várias observações. Primeiro, o genoma mitocondrial da levedura codifica apenas oito proteínas: três subunidades do citocromo c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb), e proteína ribossômica mitocondrial Var1p5. Este número é pequeno, e todos eles podem ser separados por eletroforese em um único gel nas condições apropriadas. Em segundo lugar, ribossomos mitocondriais pertencem à classe procariótica em vez de eucariótico6, e, portanto, a sensibilidade aos antibióticos é diferente para ribossmos citoplasmáticos e mitocondriais de levedura. Permite a inibição da tradução citoplasmática com cicloheximida, proporcionando as condições quando o aminoácido rotulado (35S-methionina) é incorporado apenas em produtos de tradução mitocondrial. Como resultado, o experimento fornece informações sobre a taxa de incorporação de aminoácidos em proteínas mitocondriais sintetizadas de novo, refletindo a eficiência global da tradução mitocondrial para cada um dos oito produtos

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de Densidade Celular Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>Marca cubetas descartáveis padrão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>aquecedor de bloco digital</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&micro; Ci (18.5MBq), Solução Aquosa Estabilizada</td> Centrífuga <td>Eppendorf NEG709A500UC</td><td></td><td>Perkin Elmer</td></tr><tr><td>5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metilenobisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Incubadora Shaker</td> New <td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptona de carne, bacteriológica</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína Pierce 660nm</td><td>Fonte de Alimentação Básica Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de Puromicina de Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 gerador de imagens de fósforo</td><td>Base Trizma da GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Secador de Gel Aquecido a Vácuo</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem e visualização de produtos de expressão do genoma mitocondrial no saccharomyces cerevisiae de levedura de baker

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina 35S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina 35S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.

Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de S. cerevisiae: o tipo selvagem(WT) e uma exclusão de rolamento mutante do gene AIM23 (AIM23Δ),codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial 3(Tabela 1)8. Os produtos de tradução mitocondrial foram rotulados radioativamente e separados em SDS-PAAG9. As amostras foram coletadas a cada 2,5 minutos antes da saturação para a construção de um...

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Sua disfunção é uma fonte bem conhecida de doença humana. As mitocôndrias de levedura de Baker contêm genoma circular codificando oito proteínas.Neste vídeo, descrevemos o protocolo usado para avaliar a biossíntese proteica em mitocôndrias de leveduras por meio da rotulagem radioativa de produtos translacionais e posterior separação por eletroforese gel. O procedimento inclui várias etapas importantes. Leveduras de listras de culturas de estoque congelado em placas frescas com meio apropriado.Coloque as placas na incubadora de cultura a 30 graus por 24 a 48 horas. Inocular essas culturas em dois mililitros de médio da raia fresca em um tubo de 15 mililitros e incuba-los durante a noite agitando a 200 RPM a 30 graus. Meça a densidade óptica da cultura no comprimento de onda de 600 nanômetros.Leve o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis Paleta células de levedura a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente. Descarte este supernatante. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos.Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. Células diluídoras em dois mililitros de meio de ágar fresco.A borda incubada é de 200 RPM e 30 graus até que a densidade óptica atinja de 1,5 a 1,9 de 1,5 a 1,9 graus. Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica no tubo de micro centrífuga. Gire os tubos a 3000 G por um minuto.Descarte o supernaspeso. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente Descarte o supernasce.Suspenda des suspenda as células de levedura em 0,5 mililitros de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em tubo de 15 mililitros. Adicione cicloheximida à suspensão celular até a concentração final de 0,2 miligramas por mililitro Incubate por cinco minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus para inibir a tradução citosolica.Adicione de 25 a 30 Adicione de 25 a 30 microcurias de metanfetamina S35 de methionina S35 à suspensão celular e incubar por 30 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Adicione methionina fria sem rótulo e bormicina para parar a rotulagem Incubate por 10 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 G por 30 segundos.Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso.Adicione 75 microliters de tampão de lise à paleta e vórtice por cinco a 10 segundos. Adicione 500 microliters de 0,5 amortecedor molar tris de 0,5 amortecedor molar tris com pH 6.8. Com pH 6,8.Vórtice brevemente. Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Vórtice por cinco segundos.Adicione 150 microliters de clorofórmio à amostra. Vórtice por cinco segundos. Centrifugar as amostras por dois minutos a 12.000 G.Descarte cuidadosamente opaface com um amostrador.Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes. Amostras centrífugas por dois minutos a 12.000 G.Descarte supernatante.Atee o pouco o palette por dois minutos a 80 graus. Dissolver proteínas precipitadas em 60 microliters de tampão amostral de Laemmli. Aqueça as amostras por 10 minutos a 14 graus.Cause o gel de poliacrilamida De 17,5% Laemmli SDS. Carregue 15 microliters de cada amostra nos bolsos. Execute o gel na sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do linfático de gel.Manche o gel com azul brilhante Kumasi e faça a varredura ou foto que é necessária como controle de carregamento. Seque o gel na secadora de gel. Mantenha-o no com tela de fósforo de armazenamento por três a cinco dias.Escaneie a tela no imager fosforo. Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de Saccharomyces cerevisiae. O tipo selvagem e a exclusão da variante mutante do gene Aim23 codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial três.Os produtos de tradução mitocondrial já foram ativamente rotulados e separados no gel de poliacrilamida desnaturação. As amostras foram coletadas a cada dois minutos e meio antes da saturação para construir o curso do tempo. O gel foi manchado, seco e exibido após os cinco dias de exposição.No caso de um experimento bem sucedido, a imagem demonstra oito bandas atribuídas de acordo com o padrão padrão. No entanto, as intensidades das bandas individuais podem ser altamente variáveis dependendo da tensão e das condições experimentais. Cada banda corresponde a um produto de tradução.Os dados sugerem que a cepa mutante é capaz de síntese de proteína mitocondrial porque todos os produtos que aparecem no tipo selvagem são visíveis neste mutante. No entanto, as intensidades das bandas são diferentes do tipo selvagem, o que significa que essa exclusão do Aim23 afeta a expressão genética mitocondrial. Kumasi fabricado em mancha azul e serve como um controle de carga.Seu resultado em dados pode ser quantificado para identificar diferenças entre cepas ou condições experimentais usando o software Image G ou Image Quan. Para estes, a razão do sinal correspondente a cada produto é calculada para o sinal total. Valores médios e desvios padrão são calculados em pelo menos três experimentos independentes.A cinética da proteína sintetizada virada é estudada em um experimento do ano passado. As amostras são coletadas nos pontos de tempo indicados após a reação de rotulagem ser interrompida por metoionina fria e boromicina. Este controle é necessário para estimar a estabilidade do produto.A imuno-coloração com anticorpos anti-porin é um controle de carga. Descrevemos o método, que é frequentemente usado para estudar biossíntese de proteínas em mitocôndrias de levedura. Este protocolo é relativamente simples e rápido de executar.Ao mesmo tempo, permite obter informações valiosas sobre a taxa de tradução de quatro mRNAs mitocondrial de levedura, o que é altamente vantajoso. No entanto, possui várias limitações que requerem experimentos adicionais e está nestes níveis interestaduais de proteínas e mRNAs. Ele pode fornecer as informações sobre essas funções no sistema de tradução mitocondrial, mas técnicas mais avançadas devem ser usadas para descobrir o mecanismo.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

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Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

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O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

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Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

O peróxido de hidrogênio (H2 O2) é uma fonte de dano oxidativo e uma molécula sinalizadora. Este protocolo descreve como medir mitocondrial H 2 O2usando HyPer7 mitocondrial (mtHyPer7), um biossensor ratiométrico codificado geneticamente, em leveduras vivas. Ele detalha como otimizar as condições de imagem e realizar análises quantitativas celulares e subcelulares usando software disponível gratuitamente.

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Transformação mitocondrial em Baker

Aprenda a rotular e visualizar oito polipeptídeos codificados pelo genoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae usando marcação radioativa e eletroforese em gel. Este método permite estudar a biossíntese de proteínas mitocondriais.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

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