Usando imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5em corações embrionários de zebrafish
15 de fevereiro de 2021
Este protocolo usa um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5nos corações dissecados de embriões de zebrafish.
Este método pode ser usado para detectar com precisão e facilidade a expressão de proteínas-alvo no coração de zebrafish. A mudança na proteína alvo é detectada diretamente pela medição da imunofluorescência. Realize a coleta e tratamento de embriões de zebrafish, conforme descrito no manuscrito do texto.
Às 72 horas após a fertilização, transfira os embriões para lâminas de vidro e observe-os sob um microscópio estéreo. Registra-lo malformações cardíacas, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho. Calcular taxas de malformação e analisar diferenças entre grupos usando uma forma ANOVA, seguido pelo teste de comparação múltipla da Turquia.
Depois de anestesiar os embriões com 0,6 miligramas por mililitro MS222, registos cardíacos por 30 segundos e quantificar as frequências cardíacas usando o software Image J. Dissecar cuidadosamente corações dos embriões de peixe zebra com uma agulha de seringa descartável sob um microscópio estéreo. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador de vidro limpo.
Adicione 50 microlitres de 4%de paraformaldeído a 1,25 microlitres de PBS para fazer uma solução fixa, em seguida, coloque três corações dissecados em um círculo de barreira hidrofóbica e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Decante a solução sob o microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Lave os slides três vezes em PBST por cinco minutos por lavagem.
Adicione 50 microliters de BSA a 1.000 microliters de PBST para obter uma solução BSA de 5% e incubar os slides em uma câmara úmida por uma hora para bloquear a ligação de anticorpos não específicos. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Diluir dois microliters de anticorpo monoclonal de camundongos contra 8 hidroxideoxyguanosine e dois microliters de anticorpo policlonal de coelho contra gama-H2AX em 296 microliters de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos primário funcionando.
Incubar as amostras cardíacas com 50 microliters da solução primária de coquetel de anticorpos em uma câmara umidificada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem. Diluir um microliter de anticorpo secundário anti-rato de cabra com rótulo FITC e um microliter de anticorpo secundário anti-coelho psy-3 em 500 microliters de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos secundários em funcionamento.
Incubar as amostras com os anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Adicione 20 microliters de DAPI às amostras para coloração nuclear e incuba-os por 30 minutos à temperatura ambiente.
Aplique um deslizamento de tampa no slide e sele-o com esmalte para evitar a secagem e o movimento. Imagem as amostras sob um microscópio de fluorescência e quantificar o sinal fluorescente da área cardíaca usando o software ImageJ. Calcule as alterações relativas utilizando a média das amostras de controle do DMSO e determine a significância estatística dos dados.
Os embriões expostos à PM 2.5 na ausência ou presença do antioxidante, N-acetil-L-cisteína, ou NAC, foram avaliados para a presença de malformações cardíacas. O EOM da PM 2.5 custou um aumento significativo na teratogênese cardíaca, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho, em comparação com corações tratados com controle de DMSO. A frequência cardíaca também foi significativamente diminuída em embriões expostos ao EOM.
Adição de defeitos cardíacos induzidos pelo EOM no NAC. Um ensaio de imunofluorescência foi utilizado para avaliar a extensão dos danos de DNA nos tecidos tratados com EOM. Os níveis de 8-hidroxideoxyguanosina e expressão gama-H2AX foram significativamente aumentados nos corações dos embriões de zebrafish tratados com EOM, indicando um aumento nos danos oxidativos do DNA e quebras duplas de DNA, respectivamente.
O dano de DNA induzido pelo EOM foi parcialmente neutralizado pela suplementação do NAC. Ao tentar este protocolo, tome cuidado ao lavar as amostras com PBS, pois o coração de zebrafish pode descascar o slide.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo utiliza um ensaio de imunofluorescência para detectar danos no DNA induzidos por PM 2,5 nos corações dissecados de embriões de peixe-zebra. O método permite a detecção precisa da expressão da proteína-alvo no coração do peixe-zebra.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Toxicologia
Contexto
- A imunofluorescência é uma técnica poderosa para visualizar a expressão proteica.
- Os embriões de peixe-zebra são um modelo valioso para estudar processos de desenvolvimento.
- A exposição ao PM 2,5 é conhecida por causar diversos problemas de saúde, incluindo danos ao DNA.
- Compreender os efeitos de toxinas ambientais no desenvolvimento é crucial para a saúde pública.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto das PM 2,5 na integridade do DNA nos corações de peixes-zebra.
- Utilizar imunofluorescência para detectar alterações na expressão proteica.
- Estabelecer um método confiável para avaliar malformações cardíacas em embriões de peixes-zebra.
Métodos Utilizados
- Coleta e tratamento de embriões de peixe-zebra.
- Ensaio de imunofluorescência para detectar proteínas-alvo.
- Observação de embriões sob microscópio estereoscópico 72 horas após a fertilização.
- Análise estatística utilizando ANOVA a um fator e o teste de comparação múltipla de Tukey.
Principais Resultados
- Detecção de danos no DNA em corações de peixes-zebra devido à exposição ao MP 2,5.
- Identificação de malformações cardíacas, como edema pericárdico e alterações no dobramento.
- Quantificação das taxas de malformação entre diferentes grupos tratados.
- Significância estatística dos resultados confirmada por meio de análise.
Conclusões
- A exposição a PM 2,5 leva a danos significativos no DNA dos corações de peixes-zebra.
- O ensaio de imunofluorescência é eficaz para estudar alterações na expressão proteica.
- Este modelo pode ser utilizado em pesquisas futuras sobre toxinas ambientais e biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo de imunofluorescência permite a redução de riscos mecanicistas de agentes tóxicos ambientais mediante a quantificação de biomarcadores de dano ao DNA em corações de embriões de peixe-zebra, um modelo preditivo para cardiotoxicidade no desenvolvimento. O ensaio apoia fluxos de trabalho de validação de alvos e triagem fenotípica ao associar a exposição a PM2.5 às vias de estresse oxidativo e de quebras da dupla fita do DNA. Ele fornece dados translacionais de biomarcadores para avaliação de riscos na fase inicial de descoberta, auxiliando na triagem de portfólios de bibliotecas químicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da detecção de 8-OHdG e γH2AX como indicadores mecanicistas de dano oxidativo ao DNA e quebras de dupla fita.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica por meio de leituras quantitativas de imunofluorescência que esclarecem a ativação de vias no tecido cardíaco.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao correlacionar alterações de biomarcadores induzidas por PM2.5 com fenótipos de malformação cardíaca.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara tecido cardíaco de peixe-zebra validado para triagem subsequente de compostos genotóxicos utilizando detecção de expressão proteica baseada em imunofluorescência.
- Valor Operacional: Fornece saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis por meio da análise no ImageJ de sinais fluorescentes em corações dissecados.
- Valor de Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma para avaliar alterações na expressão proteica induzidas por produtos químicos ambientais em um sistema relevante para doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Demonstra a relevância da doença ao detectar danos no DNA nos corações de embriões de peixe-zebra, um modelo com vias conservadas de desenvolvimento cardíaco.
- Valor Operacional: Garante a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, ao fornecer subsídios mecanicistas sobre a cardiotoxicidade induzida por PM2.5.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não ao quantificar a atenuação dos danos no DNA mediante tratamento coadjuvante com antioxidantes (por exemplo, NAC).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo leituras mecanicistas que reforçam a confiança preditiva em campanhas de triagem em estágios iniciais.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao quantificar biomarcadores de dano ao DNA em resposta à exposição a agentes tóxicos ambientais.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e resultados quantitativos por meio de coloração padronizada por imunofluorescência e quantificação da fluorescência baseada no ImageJ em corações de peixe-zebra.
- Análise: Gera resultados estatísticos (por exemplo, alterações relativas na fluorescência, significância derivada de ANOVA) que permitem comparação entre condições e validação de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica utilizando um modelo de peixe-zebra com vias de desenvolvimento relevantes para a avaliação da cardiotoxicidade humana.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para triagem de diversas bibliotecas químicas quanto ao potencial genotóxico em um modelo de coração vertebrado.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva por meio da redução de riscos mecanicistas das vias de dano ao DNA na triagem de toxicidade do desenvolvimento.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos fixos de dissecação, coloração e imagem, utilizando barreiras hidrofóbicas e microscopia de fluorescência.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao associar alterações de biomarcadores a desfechos fenotípicos, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados nos programas de toxicologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base no potencial de dano ao DNA em um modelo de coração em desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de embriões de peixe-zebra, dissecação cardíaca e técnicas de imunofluorescência.
- Depende de microscopia de fluorescência e do software ImageJ para quantificação do sinal e análise estatística.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de dissecação, incubação com anticorpos e procedimentos de lavagem para prevenir perda tecidual.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o ensaio a outros tecidos de peixe-zebra ou modelos de doenças.
- Inclui limitações práticas, como o desprendimento do tecido cardíaco durante a lavagem, exigindo manuseio cuidadoso com PBS, conforme observado no material original.
