Name: Um modelo de endotoxina de unidade de terapia intensiva reprodutível em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo reprodutível de endotoxemia em ratos para pesquisa de sepse em UTI. Este protocolo permite avaliações fisiológicas repetidas, reduzindo o número de animais necessários.

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Os autores gostariam de agradecer a Beatrice Beck-Schimmer (MD) e Erik Schadde (MD) por seu exame crítico e sua valiosa contribuição para este manuscrito.

Todos os experimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelas Autoridades Veterinárias do Cantão de Zurique, Suíça (números de aprovação 134/2014 e ZH088/19). Além disso, todas as etapas realizadas neste experimento foram de acordo com as Diretrizes sobre Experimentos com Animais pela Academia Suíça de Ciências Medianas (SAMS) e Diretrizes da Federação das Associações Europeias de Zootecnia (FELASA).
1. Indução de anestesia e monitoramento animal
<ol><li>Mantenha os ratos Wistar machos com um peso de 250-300 gramas (g) em gaiolas ventiladas sob condições livres de patógenos. Forneça um ciclo claro/escuro de 12-12 horas a uma temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, e acesso gratuito a alimentos e água.</li>
	<li>Induzir anestesia geral por indução volátil com isoflurano (concentração de 3-5%) em uma caixa de indução de anestesia por 30 segundos (Figura 1A) ou, alternativamente, induzir anestesia com uma injeção de tiro único de cetamina/xilazina (10/1 miligrama (mg) por 100 g de peso corporal).</li>
	<li>Transfira o animal para um local de trabalho e coloque o animal em um tapete de aquecimento durante todo o experimento. Mantenha a temperatura corporal entre 36,5 e 37 °C.</li>
	<li>Use um nariz para fornecer oxigênio (600 mL/minuto). Adicione isoflurane 2-3% se a anestesia volátil for escolhida para manutenção da anestesia. Certifique-se de que o animal está respirando espontaneamente.</li>
	<li>Confirme o nível de anestesia pela ausência do reflexo do dedo do dedo antes da instalação de traqueostomia e cateteres arteriais e venosos.</li>
	<li>Verifique uma oxigenação suficiente pelo monitoramento periférico de saturação de oxigênio (saturação normal de oxigênio 98 - 100%).</li>
	<li>Use uma pomada (pomada de vitamina A) para proteger os olhos.</li>
	<li>Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis e cateteres em uma mesa lateral, conforme mostrado na Figura 1B.</li>
	<li>Além disso, prepare o monitoramento de pressão e saturação de oxigênio conforme exibido na Figura 1C.</li>
</ol>2. Acesso intravenoso
<ol><li>Aplique um torniquete na cauda proximal do rato para facilitar o acesso venoso (Figura 2A).</li>
	<li>Desinfete a cauda 3 vezes com álcool.</li>
	<li>Induzir um cateter intravenoso G26 em uma das duas veias laterais da cauda. NOTA: Pela nossa experiência é mais fácil colocar o acesso intravenoso na parte distal da cauda do rato, pois a veia aqui está localizada mais perto da pele. Além disso, no caso de uma cannulação falha, há espaço suficiente para se mover proximicamente.</li>
	<li>Evite estritamente a injeção de ar.</li>
	<li>Desamarre o torniquete depois de colocar o cateter intravenoso.</li>
	<li>Fixar o cateter intravenoso no lugar com fita adesiva (Figura 2B).</li>
	<li>Conecte as bombas de seringa ao acesso intravenoso para aplicação contínua de fluidos e medicamentos.</li>
	<li>Use torneiras de 3 vias para fluido de bolus, aplicação de drogas e amostragem de sangue venoso.</li>
</ol>3. Traqueostomia
<ol><li>Raspe a área anterior do pescoço do animal.</li>
	<li>Desinfete a pele raspada 3 vezes com solução de providone-iodo.</li>
	<li>Realize uma incisão longitudinal de cerca de 2 cm usando um bisturi (com uma lâmina número 10).</li>
	<li>Retraia a pele com suturas de seda 2-0.</li>
	<li>Prepare sem rodeios a laringe e a traqueia com uma tesoura cirúrgica (Figura 3A).</li>
	<li>Certifique-se de abrir a traqueia com micro tesoura cirúrgica no fechotraqueal 3-5.</li>
	<li>Insira uma cânula traqueal estéril na traqueia. Tenha cuidado, não insira a cânula muito profundamente para evitar ventilação unilateral.</li>
	<li>Fixar a cânula no lugar usando uma sutura de seda 2-0.</li>
	<li>Conecte a cânula a um ventilador para pressão ou ventilação controlada por volume (Figura 3B).</li>
</ol>4. Acesso arterial
<ol><li>Desinfete a cauda de rato 3 vezes com solução povidone-iodo.</li>
	<li>Corte a pele usando um bisturi (com uma lâmina número 10) cerca de 1 cm longitudinalmente no lado ventral.</li>
	<li>Tome cuidado, não corte muito profundamente para evitar uma lesão na artéria traseira.</li>
	<li>Use um microscópio cirúrgico para expor cuidadosamente a artéria. Corte a fáscia ao redor da artéria com micro tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Ligate a parte distal da artéria usando uma sutura de seda 6-0.</li>
	<li>Prepare uma sutura de seda proximal 6-0, mas não aperte a seda (Figura 4A).</li>
	<li>Introduza um cateter G-26 na artéria entre a sutura de seda distal e proximal.</li>
	<li>Uma vez que o cateter esteja na artéria, aperte a sutura de seda proximal e fixe o cateter no lugar (Figura 4B).</li>
	<li>Conecte o cateter a um transdutor de pressão para fornecer medição contínua da pressão arterial (pressão arterial média normal: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).</li>
	<li>Além disso, coloque uma torneira de 3 vias entre o cateter conectado ao transdutor de pressão e o cateter G-26 para amostragem arterial de sangue.</li>
</ol>5. Medição da linha de base, indução de sepse e medições de seguimento
<ol><li>Depois que o animal atingiu um estado estável, injete o LPS.</li>
	<li>Coletar amostras de sangue quando um estado estável é atingido (geralmente após 15-30 minutos).</li>
	<li>Substitua a perda de fluido das amostras de sangue pela solução de Ringer em uma proporção de 1:4.</li>
	<li>Para induzir a sepse, injete o LPS como um bolus ou como uma aplicação LPS contínua.</li>
	<li>Para a aplicação do bolus, injete 1 mg de LPS/quilograma de peso corporal (kg) dissolvido em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a uma concentração de 1 mg/mL.</li>
	<li>Para aplicação contínua, injete 300 μg de LPS/kg/hora durante todo o experimento usando uma bomba de seringa (solução de estoque de LPS: 1 mg/mL em PBS).</li>
	<li>Evite a injeção de ar o tempo todo para evitar a embolia do ar.</li>
	<li>Defina protocolos de substituição de fluidos, protocolos de aplicação vasoconstritores e critérios de aborto (por exemplo, hipotensão definida como uma pressão arterial média abaixo de 50 mmHg por mais de 30 minutos, apesar da substituição do fluido) antes de configurar o experimento. NOTA: Sugerimos uma infusão contínua da solução de Ringer a uma taxa de 10 mL/kg/hora.</li>
	<li>Subtrair qualquer administração contínua de fluidos (por exemplo, para aplicação contínua de LPS) da quantidade infundida para que os resultados sejam comparáveis com os dos grupos de controle. NOTA: Ao final do experimento, e antes de colher quaisquer órgãos como fígado, rim ou baço para análises posteriores, como animais histológicos ou bioquímicos, podem ser eutanizados por uma incisão da veia cava inferior. O método recomendado de eutanásia é levar os animais a um plano cirúrgico de anestesia antes da incisão da veia cava inferior e injeção de soro fisiológico gelado no coração esquerdo, especialmente se os marcadores inflamatórios nos órgãos forem avaliados. Certifique-se de cumprir os requisitos legais e as diretrizes locais. Para verificar a falência de órgãos relacionada à sepse, pode-se analisar o marcador pró-apoptose como o caspase-3, bem como a α1-microglobulina para verificar danos tubulares nos rins. A análise específica do órgão de marcadores como CINC-1, MCP-1 e IL-6 também pode fornecer informações sobre a resposta inflamatória específica do órgão.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+worldwide+burden+of+critical+illness%3A+the+intensive+care+over+nations+%28ICON%29+audit%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit.</a> Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).</li>
<li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+hypotension+before+initiation+of+effective+antimicrobial+therapy+is+the+critical+determinant+of+survival+in+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock.</a> Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).</li>
<li>Gotts, J. E., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sepsis: pathophysiology and clinical management.</a> British Medical Journal. 353, (2016).</li>
<li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Urner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+beneficial+immunomodulatory+mechanism+of+the+sevoflurane+metabolite+hexafluoro-2-propanol+in+a+rat+model+of+endotoxaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insight into the beneficial immunomodulatory mechanism of the sevoflurane metabolite hexafluoro-2-propanol in a rat model of endotoxaemia.</a> Clinical and Experimental Immunology. 181 (3), 468-479 (2015).</li>
<li>Beck-Schimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+Anesthesia+Regimen+Is+Best+to+Reduce+Morbidity+and+Mortality+in+Lung+Surgery%3F%3A+A+Multicenter+Randomized+Controlled+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Which Anesthesia Regimen Is Best to Reduce Morbidity and Mortality in Lung Surgery?: A Multicenter Randomized Controlled Trial.</a> Anesthesiology. 125 (2), 313-321 (2016).</li>
<li>Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeitch%2C+EA+%22Shock%22">Shock</a>. 9 (1), 1-11 (1998).</li>
<li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%3A+setting+the+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis: setting the stage.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).</li>
<li>Perretti, M., Duncan, G. S., Flower, R. J., Peers, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+corticosterone%2C+interleukin-1+and+tumour+necrosis+factor+in+rat+experimental+endotoxaemia%3A+comparison+between+Lewis+and+Wistar+strains%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Serum corticosterone, interleukin-1 and tumour necrosis factor in rat experimental endotoxaemia: comparison between Lewis and Wistar strains.</a> British Journal of Pharmacology. 110 (2), 868-874 (1993).</li>
<li>Marechal, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+damage+during+endotoxemia+coincides+with+microcirculatory+dysfunction+and+vascular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress.</a> Shock. 29 (5), 572-576 (2008).</li>
<li>Thiemermann, C., Ruetten, H., Wu, C. C., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+organ+dysfunction+syndrome+caused+by+endotoxin+in+the+rat%3A+attenuation+of+liver+dysfunction+by+inhibitors+of+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase.</a> British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).</li>
<li>Osuchowski, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+quality+threshold+in+pre-clinical+sepsis+studies+%28MQTiPSS%29%3A+an+international+expert+consensus+initiative+for+improvement+of+animal+modeling+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine+Experimental%22%5BJournal%5D)">Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis.</a> Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26(2018).</li>
<li>Fink, M. P., Heard, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+models+of+sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Laboratory models of sepsis and septic shock.</a> Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).</li>
<li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%3A+Setting+the+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis: Setting the stage.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).</li>
<li>Balls, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+humane+experimental+technique%3A+timeless+insights+and+unheeded+warnings%5BTitle%5D)+AND+%22Altex-Alternatives+to+Animal+Experimentation%22%5BJournal%5D)">The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings.</a> Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses em relação ao estudo apresentado. Martin Schläpfer apresentou uma patente para mitigar os efeitos negativos da cirurgia e/ou anestesia para pacientes que usam gases médicos, particularmente oxigênio (O2) e dióxido de carbono (CO2). Ele recebeu bolsas de pesquisa irrestritas da Sedana Medical, suécia, e da Roche, Suíça, não relacionadas a este trabalho.

O protocolo descrito aqui permite um modelo de sepse altamente reprodutível, mas simples de aprender, que pode ser adaptado de acordo com a questão da pesquisa. Dados in vivo essenciais referentes à função do órgão, como frequência cardíaca, pressão arterial e saturação de oxigênio arterial periférico podem ser coletados continuamente, e a amostragem de sangue pode ser realizada repetidamente durante todo o experimento. Além disso, podem ser instaladas modificações em relação aos protocolos de substituição de fluidos e s...

A sepse e sua forma mais grave, choque séptico, são síndromes no terreno de uma infecção, resultando em uma reação inflamatória exagerada com a liberação de citocinas, levando a alterações fisiológicas e bioquímicas com defesa imunológica suprimida e resultados fatais 1,2. Essa reação inflamatória desequilibrada resulta em disfunção de órgãos e falência de órgãos em vários órgãos vitais, como pulmão, rim e fígado. Com 37%3, a sepse é um dos motivos mais comuns para o paciente ser internado em uma unidade de terapia intensiva (UTI). A mortalidade por sepse atualmente varia em torno de 20-30%4. O tratamento precoce e eficaz com antibióticos é de extrema importância5. A ressuscitação do fluido e vasopressor precisa ser instalada precocemente, fora isso, o tratamento é puramente favorável6.
A sepse é definida como uma infecção comprovada ou suspeita com bactérias, fungos, vírus ou parasitas, que é acompanhada de disfunção de órgãos. Os critérios de choque séptico são atendidos quando um novo colapso cardiovascular irresponsável apenas ao tratamento de fluidos, e um nível de lactato de mais de 2 milmole/litro está presente2. A falência de órgãos relacionada à sepse pode ocorrer em qualquer órgão, mas é muito comum no sistema cardiovascular, no cérebro, no rim, no fígado e no pulmão. A maioria dos pacientes que sofrem de sepse requer intubação endotraqueal para proteger as vias aéreas do paciente, proteger da aspiração e aplicar ventilação expiratória final positiva com uma alta fração de oxigênio inspirado para prevenir ou superar a hipóxia. Para tolerar um tubo traqueal e ventilação mecânica, os pacientes geralmente requerem sedação.
Endotoxinas, como lipopólises (LPS) como componente da membrana de bactérias gram negativas induzem uma forte reação inflamatória através do receptor de pedágio (TLR)47. A ativação de uma via definida garante uma reação inflamatória estável. Citocinas como citocina induzida pela quimiato 1 (CINC-1), proteína quimiofos de monocito 1 (MCP-1) e interleucina 6 (IL-6) são conhecidas como fatores prognósticos para gravidade e desfecho neste modelo8. A aplicação LPS intravenosa tem sido usada com sucesso para estudar vários aspectos da sepse em ratos 8,9.
O tratamento da sepse ainda é um desafio, principalmente pela falta de modelos preditivos de animais. Se a endotoxemia com ativação da inflamação sistêmica é um modelo adequado para o desenvolvimento de terapias farmacológicas é discutível. No entanto, com o conhecido caminho TLR 4 induzido pelo LPS, importantes conhecimentos podem ser adquiridos.

<table><tbody><tr><td>Suturas de seda 2-0</td><td>Ethicon, Sommerville, NJ</td><td>K833</td><td></td></tr><tr><td>Cateter intravenoso cirúrgico padrão 26</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>391349</td><td>Equipamento de anestesia padrão</td></tr><tr><td>6-0 Seda trançada preta LOOK</td><td>Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA</td><td>SP114</td><td>Bomba de</td></tr><tr><td>seringa Alaris</td> cirúrgica padrão <td>Bencton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma, Basel, Suíça</td><td>7.68034E+12</td><td>Número GTIN</td></tr><tr><td>Micropinças de pontas finas curvas</td><td>Instrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL</td><td>504513</td><td>Facilita a preparação vascular</td></tr><tr><td>Micropinças de pontas finas</td><td>Instrumentos de precisão mundial (WPI), Sarasota, FL</td><td>501976</td><td>As pontas precisam ser polidas regularmente</td></tr><tr><td>Infinity Delta XL Monitoramento de anestesia</td><td>Draeger, L&uuml; beck, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, frascos de 250 mL</td><td>Attane, Piramal, Mumbai, Índia</td><td>LDNI 22098</td><td>Equipamento veterinário padrão</td></tr><tr><td>Cetamina (Ketalar)</td><td>Pfitzer, Nova York, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli, sorotipo 055:B5</td><td>Sigma, Buchs, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-tips small</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>EH11.1</td><td></td></tr><tr><td>Ringerfundin</td><td>cirúrgico padrão Bbraun, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isofluorano Tec-3</td><td>Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL</td><td>não está mais disponível</td><td>Equipamento veterinário padrão</td></tr><tr><td>Xylazine (Xylazin Streuli)</td><td>Streuli AG, Uznach, Suíça</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de endotoxina de unidade de terapia intensiva reprodutível em ratos

A Reproducible Intensive Care Unit-Oriented Endotoxin Model in Rats

A sepse e o choque séptico continuam sendo a principal causa de morte nas unidades de terapia intensiva. Apesar de melhorias significativas no manejo da sepse, a mortalidade ainda varia entre 20 e 30%. Novas abordagens de tratamento para reduzir a falha multiórgão relacionada à sepse e a morte são urgentemente necessárias. Modelos robustos de animais permitem uma ou múltiplas abordagens de tratamento, bem como para testar seu efeito em parâmetros fisiológicos e moleculares. Neste artigo, é apresentado um modelo animal simples.
Em primeiro lugar, a anestesia geral é induzida em animais com o uso de anestesia volátil ou por anestesia intraperitoneal. Após a colocação de um cateter intravenoso (veia da cauda), traqueostomia e inserção de um cateter intraarterial (artéria traseira), inicia-se a ventilação mecânica. Os valores básicos da pressão arterial média, da saturação do oxigênio arterial e da frequência cardíaca são registrados.
A injeção de lipopólises (1 miligrama/quilograma de peso corporal) dissolvida em soro fisiológico tamponado por fosfato induz uma resposta inflamatória forte e reprodutível através do receptor 4. As correções de fluidos, bem como a aplicação da norepinefrina são realizadas com base em protocolos bem estabelecidos.
O modelo animal apresentado neste artigo é de fácil aprendizado e fortemente orientado para o tratamento clínico da sepse em uma unidade de terapia intensiva com sedação, ventilação mecânica, monitoramento contínuo da pressão arterial e amostragem repetitiva do sangue. Além disso, o modelo é confiável, permitindo dados reprodutíveis com um número limitado de animais de acordo com os princípios 3R (reduzir, substituir, refinar) da pesquisa animal. Embora experimentos com animais em pesquisas de sepse não possam ser facilmente substituídos, medições repetitivas permitem uma redução dos animais e manter animais sépticos anestesiados diminui o sofrimento.

O sistema apresentado permite a endotoxemia com animais hemodinamicamente estáveis, conforme relatado anteriormente9. Enquanto a pressão arterial média permanece estável em animais com, e sem estimulação LPS LPS animais tratados desenvolvem características de sepse, como um excesso de base negativa e uma forte reação inflamatória medida por citocinas plasmáticas (6 horas após a aplicação) como CINC-1 (867 ng/mL), MCP-1 (5027 ng/mL) e IL-6 (867 ng/mL)8, <strong class="xfig"...

Aqui, apresentamos um modelo de endotoxina de terapia intensiva reprodutível em ratos.

Um modelo de endotoxina de unidade de terapia intensiva reprodutível em ratos

Sepsis and septic shock remain the leading cause of death in intensive care units. Despite significant improvements in sepsis management, mortality still ...

Este protocolo é um modelo robusto e reprodutível de endotoxemia no qual parâmetros fisiológicos e moleculares podem ser avaliados repetidamente. Essa abordagem pode ajudar a responder perguntas em pesquisas sobre sepse. Embora nosso modelo não substitua experimentos com animais, ele refina modelos de sepse através da sedação contínua e reduz o número de animais através de amostragem repetida.Os iniciantes podem lutar com a inserção de cateteres arteriais e venosos, mas apenas treinamento limitado é necessário para dominar essas técnicas. A visualização de toda a configuração experimental facilita que os pesquisadores configurem ou adaptem seus modelos para imitar mais de perto uma situação na UTI. Comece transferindo o animal anestesiado para um tapete de aquecimento.Mantendo a temperatura corporal entre 36,5 e 37 graus Celsius. Certifique-se de que o animal está respirando espontaneamente fornecendo oxigênio com um cone de nariz. Confirme o nível de anestesia pela ausência do reflexo do dedo do dedo do dedo antes da instalação de traqueostomia e cateteres arteriais e venosos.Use uma pomada para proteger os olhos. Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis e cateteres, juntamente com o monitoramento de pressão e saturação de oxigênio para oxigenação suficiente. Aplique um torniquete na cauda proximal do rato para facilitar o acesso venoso e desinfetar a cauda três vezes com álcool.Introduza um cateter intravenoso de 26 bitolas em uma das duas veias laterais da cauda evitando a injeção de ar. Desamarre o torniquete depois de colocar o cateter intravenoso e fixar o cateter intravenoso no lugar com fita adesiva. Conecte bombas de seringa com torneiras de três vias ao acesso intravenoso para aplicação contínua de fluidos e medicamentos.Comece a traqueostomia raspando a área anterior do pescoço do animal e, em seguida, desinfete a pele raspada três vezes com solução de iodo povidone. Realize uma incisão longitudinal de dois centímetros usando uma lâmina de bisturi número 10. Retraia a pele com suturas de seda 2-0.Em seguida, preparou sem rodeios a laringe e a traqueia para abrir com uma tesoura cirúrgica. Insira uma cânula traqueal estéril na traqueia, tomando cuidado para não penetrar muito profundamente para evitar ventilação unilateral. Fixar a cânula no lugar usando uma sutura de seda 2-O e, em seguida, conectar a cânula a um ventilador para pressão ou ventilação controlada por volume.Defina protocolos de substituição de fluidos, protocolos de aplicação vasoconstritores e critérios de aborto antes de configurar o experimento. Desinfete a cauda do rato três vezes com solução de iodo povidone e, em seguida, corte o círculo de pele um centímetro longitudinalmente no lado ventral usando um bisturi, tomando cuidado para não cortar muito profundamente para evitar uma lesão da artéria traseira. Use um microscópio cirúrgico para expor cuidadosamente a artéria.Corte a fáscia ao redor da artéria com micro tesoura cirúrgica. Em seguida, ligar a parte distal da artéria realizando sutura de seda proximal 6-0, mas não aperte a seda. Introduza um cateter de 26 bitolas na artéria entre a sutura de seda distal e proximal e, em seguida, aperte a sutura de seda proximal para fixar o cateter no lugar.Conecte o cateter a um transdutor de pressão para fornecer medição contínua da pressão arterial. Além disso, coloque uma torneira de três vias entre o cateter conectado ao transdutor de pressão e o cateter de 26 medidores para amostragem arterial. Após o animal atingir um estado estável, induziu a sepse injetando LPS e coletando amostras de sangue.Substitua a perda de fluido das amostras de sangue pela solução de Ringer em uma proporção de um a quatro, evitando a injeção de ar o tempo todo, a fim de evitar a embolia do ar. A pressão arterial média permanece estável em animais com e sem estimulação de LPS. Animais tratados com LPS desenvolvem características de sepse, como o excesso de base negativa.Os animais tratados com LPS também desenvolveram uma forte reação inflamatória, medida por citocinas plasmáticas, como quimioattractant protein-1, proteína quimiofos de monociclita-1 e interleucina-6. Ao tentar este protocolo, lembre-se de pré-predefine regimes fluidos e vasopressores, bem como definir critérios de rescisão a fim de obter dados de pesquisa sólidos e reprodutíveis. Este protocolo pode ser adaptado a outros modelos de sepse.Assim, uma pergunta de pesquisa é respondida com a abordagem mais adequada e de acordo com os princípios de redução, refinanciamento, substituição do bem-estar animal.

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A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

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A administração intravenosa de endotoxina provoca de forma confiável alterações fisiológicas e imunológicas dependentes da dose consistentes com vários estados patológicos. Essa abordagem reducionista permite a investigação, modelagem e modificação experimental da inflamação sistêmica e seus efeitos a jusante no homem.

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Um método para estabelecer infecções pulmonares em roedores imunocompetentes é descrito. Com proficiência, este método pode ser realizado de forma rápida e fácil para induzir infecção estável com muitos isolados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

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Este protocolo descreve um modelo de camundongo cateterizado centralmente de doença crítica prolongada. Combinamos o método de ligadura e punção cecal para induzir sepse com o uso de uma linha venosa central para administração de fluidos, medicamentos e nutrientes para mimetizar o ambiente clínico humano.

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Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de leitões neonatais de lesão pulmonar aguda que modela eventos patogênicos precoces que ocorrem no pulmão prematuro, incluindo quantidade de surfactante subadequada, hiperóxia, ventilação de alta pressão e inflamação, para facilitar a compreensão dos gatilhos moleculares da displasia broncopulmonar e melhorar a tradução terapêutica.

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Aprenda a desenvolver um modelo reprodutível de endotoxemia em ratos para pesquisa de sepse em UTI. Este protocolo permite avaliações fisiológicas repetidas, reduzindo o número de animais necessários.

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