Name: ネズミ星状神経節の位置、解剖、分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶ マウス星状神経節の位置特定と解剖法。心臓自律神経系の変化と不整脈メカニズムを理解し、治療法開発への洞察を得るための手法を解説します。

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著者らは、ハートウィグ・ヴィーボルトの優れた技術支援と、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのUKE顕微鏡イメージング施設(Umif)に、顕微鏡とサポートを提供してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)[FKZ 81Z4710141]によって資金提供されました。

著者らは開示するものは何もない。

突然の心停止が世界的に最も一般的な死因であり続けるため、VAの発症に先立つ交感神経系のニューロンおよびグリア細胞における細胞および分子プロセスの理解は高い関心を持つ。そこで、現在の原稿では、このネットワーク内のマウスエレメントであるマウスSGを同定し、RNA、タンパク質、細胞レベルでのその後の分析を行う方法の基本的なレパートリーを提供しています。
マウスSGの1つの課題は、そのサイズと細胞数が限られている39です。このため、ラット40、イヌ22、ブタ41などの異なる動物モデルがSGに関する研究に使用される。それでも、マウスには様々な確立された疾患モデルが利用可能であり、これらのいくつかは、糖尿病23、心筋梗塞42、または心筋炎<sup class="x...

心臓自律神経系は、交感神経、副交感神経、感覚成分の緊密に調整された平衡であり、心臓が適切な生理学的応答を有する環境変化に適応することを可能にする1,2。この平衡における障害は、例えば、交感神経活動の増加、心室性不整脈(VA)3、4の維持と同様に発症の重要な促進要因として確立されている。従って、自律的変調は、β遮断薬による交感神経活性の薬理学的減少を通じて達成され、数十年5、6年のVA患者の治療の基礎となっている。しかし、薬理学的およびカテーテルベースの介入にもかかわらず、関連する数の患者はまだ再発VA7に苦しんでいる。
心臓への交感神経入力は、主に星状神経節(SG)の神経細胞体を介して媒介され、交感神経鎖の両側の星形構造は、脳幹から心臓8、9、10に多数の胸腔内神経を介して情報を中継する。傷害後にSGから発芽した神経はVAと突然心死11、12に関連し、自律変調13、14の標的としてSGを強調する。心臓への交感神経入力の減少は、局所麻酔薬の経皮的注入を介して一時的に、またはビデオ支援胸腔鏡15、16を介してSGの部分的除去によって永久に達成することができる。心臓交感神経脱用は、有望な結果を有する治療難治性VA患者のためのオプションを提示する14,16,17.我々は、神経および神経化学的リモデリング、神経炎症およびグリア活性化が自律神経機能障害18、18を寄与または悪化させる可能性のある交感神経リモデリングの特徴であることを、これらの患者の植え付けられたSGから学んだ。それでも、これらのニューロンにおける基礎となる細胞および分子プロセスは、現在まで不明瞭なままであり、例えば、コリン作動性表現型20,21へのニューロントランス分化の役割。実験研究は、VAを治療するための新しいアプローチを提示し、例えば、光遺伝学22を介した交感神経活性の減少であるが、SGの詳細な特徴付けは、VAと手をつないで行く多くの心臓病理に依然として欠けている。これらの病理を模倣するマウスモデルは、潜在的に不整脈12、23の発症に先行する神経リモデリングを研究することを可能にする。これらは、心臓および神経系の自律神経特性解析のための更なる形態学的および機能的分析によって完了することができる。本プロトコルでは、VAの理解を深めるためにマウスSGを解剖し特徴付けできる方法の基本的なレパートリーを提供する。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>接着スライド SuperFrost plus&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0060</td><td>顕微鏡検査</td></tr><tr><td>ウシアルブミンフラクションV受容体グレードの凍結球。</td><td>Serva</td><td>11924.03</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 三塩酸塩 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>B2261</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>チキン抗ニューロフィラメント</td><td>EMD ミリポア</td><td>AB5539</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Merck, KGA, Darmstadt,</td><td>Germany D8418</td><td>ホールマウント染色ロ</td></tr><tr><td>バ アンチチキンIgY Alexa 647&nbsp;</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td><td>AP194SA6</td><td>Whole mount staining</td></tr><tr><td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11057</td><td>ホールマウント染色ロ</td></tr><tr><td>バ抗ウサギ IgG Alexa 488&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21206</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>乾燥ブロック 37-100 mm</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)</td><td>WHA10310992&nbsp;</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>エタノール 99 % MEK、IPA、Bitrex で変性 (最小 99,8%)</td> <td>Th.Geyer</td><td>2212.5000</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Eukitt 封入剤</td><td>AppliChem</td><td>253681.0008</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Fluoromount-G + DAPI</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td>ホール マウント染色ヤ</td></tr><tr><td>ギ抗コリン アセチルトランスフェラーゼ</td><td>EMD ミリポア</td><td>AP144P</td><td>ホール マウント染色</td></tr><tr><td>H2O2 30% (w/w)</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td><td>H1009</td><td>ホール マウント染色</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム 25.000 UI / 5ml</td><td>Rotexmedica</td><td>PZN: 3862340</td><td>Preparation SG</td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット</td><td>Life technologies</td><td>&nbsp;4368813</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>イソフルラン(フォレン)</td><td>Abbott Laboratories</td><td>2594.00.00</td><td>調製 SG</td></tr><tr><td>マイヤーのヘマラム溶液</td><td>メルク</td><td>1.09249.0500</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 20x20 mm以下</td><td>マリエンフェルド</td><td>0101040</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA isolation</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>RNA isolation</td></tr><tr><td>Opal 570 試薬パック</td><td>アコヤ バイオサイエンス</td><td>FP1488001KT</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln.、メタノールフリー&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>パスツールピペット、LDPE、非滅菌、3 ml、154 mm</td><td>Th.Geyer</td><td>7691202</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont SS 鉗子</td><td>FineScienceTools</td><td>11203-25</td><td>調製 SG</td></tr><tr><td>QIAzol 溶解試薬</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79306</td><td>RNAの分離</td></tr><tr><td>のウサギの反チロシン水酸化酵素</td><td>EMDのMillipore</td><td>AB152</td><td>全山の染色</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Merck</td><td>R0901-100ML</td><td>RNAの分離(任意)</td></tr><tr><td>RNAscopeの多重の蛍光試薬のキットv2</td><td>biotechne（ACD）</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope RNAscopeのProbe-Mm-S100b-C2</td>の<td>biotechne（ACD)</td><td>431738-C2</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td><td>biotechne (ACD)</td><td>423391</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>ステンレススチールビーズ 7 mm&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>69990</td><td>RNA 単離</td></tr><tr><td>スーダン ブラック B</td><td>Roth</td><td>0292.2</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay コリンアセチルトランスフェラーゼ (Mm01221880_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay チロシンヒドロキシラーゼ (Mm00447557_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>遺伝子発現解析</td></tr><tr><td>TaqMan mastermix</td><td>Applied biosystems</td><td>4370074</td><td>Gene Expression analysis&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue Lyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>Triton X-100 10%溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ml</td><td>ホールマウント染色</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>Wacom 竹ペン</td><td>Wacom</td><td>CTL-460/K</td><td>細胞サイズ測定</td></tr><tr><td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10311647</td><td>全マウント染色</td></tr><tr><td>小麦胚芽凝集素、Alexa Fluor 633 コンジュゲート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>RNAscope</td></tr></tbody></table>

ネズミ星状神経節の位置、解剖、分析

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

自律神経系は心臓電気生理学の実質的な原動力である。特にその交感神経枝の役割は、心室性不整脈(VA)の病態生理学における継続的な調査の問題である。星状神経節(SG)のニューロン   は、交感神経鎖の両側の星形構造であり   、交感神経系の重要な要素です。SGは、治療難治性VA患者における心交感神経変性による治療のための認識された標的である。SGにおける神経細胞リモデリングおよびグリア活性化はVA患者に記載されているが、不整脈の発症に先立つ可能性のある基礎となる細胞および分子プロセスは十分に理解されておらず、自律神経変調を改善するために解明されるべきである。マウスモデルは交感神経リモデリングを研究することができますが、マウスSGの同定は経験の浅い研究者にとって困難です。したがって、マウスSGの詳細な細胞および分子生物学的研究は、多くの一般的な心疾患に欠けている。ここでは、RNAレベル(遺伝子発現解析のためのRNA単離、その際のハイブリダイゼーション)、タンパク質レベル(免疫蛍光全体実装染色)、および細胞レベル(基本的形態、細胞サイズ測定)での分析のために成体マウスのSGを解剖および研究するための基本的なレパートリーについて説明します。調製技術の課題を克服するための潜在的な解決策と、自己蛍光の消光による染色の改善方法を提示します。これにより、細胞組成およびリモデリングプロセスを決定するために、確立されたマーカーを介して神経細胞とグリア細胞を可視化することができます。ここで示す方法は、VAになりやすいマウスの自律神経機能不全に関するさらなる情報を得るためにSGを特徴付けることを可能にし、心臓の自律神経系の神経およびグリア成分を調査する追加の技術によって補完することができる。

図 1は、SG を識別して解剖する方法を視覚化します。 左右の長角のコリ筋肉はSGとリブケージから内側に入る方向の重要なランドマークです。解剖は、筋肉と最初の肋骨の間の点線に沿って行われる。SGと交感神経鎖は白い構造として見えるようになります(図1C)。図1Dは、左の長いコリ筋と第1肋骨との間の領域の拡大率を示し、左SGが位置する。SGの形態は個人によって異なる。それはしばしば、下頸部と第3胸部神経節24への第1の融合から成る。実験者がマウスSGで期待できるいくつかの種類は、5匹の雄C57Bl6野生型マウスの左右SGが撮影されている図1E,Fに描かれている。
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心臓自律神経系、特に交感神経の神経系における病態生理学的変化は、心室性不整脈の発症および維持に寄与する。本プロトコルでは、マウスの星状神経節を特徴付け、基礎となる分子および細胞プロセスの理解を深める方法を示す。

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

すべての心拍は交感神経系の緊密な制御下にあります。心臓神経制御内のほとんどのニューロンは、星状神経節と相互作用します。私たちのプロトコルは、根本的なプロセスを研究することを可能にします。手元にあるビデオと画像があれば、経験の浅い研究者でもマウスの星状神経節を見つけ、その技術をさまざまな疾患モデルに適用することができます。交感神経系は、心不整脈形成の重要な要素です。星状神経節の調節は、生命を脅かす心室性不整脈患者の治療に有望であるようです。ニューロンとグリア細胞の細胞および分子プロセスを理解することは、標的療法への道を開く可能性があります。このプロトコルの主な課題は、星状神経節を特定することです。調製の品質を評価するために、最初にチロシンヒドロキシラーゼのコントロール染色を行うことをお勧めします。心臓と肺を摘出した後、マウスの胴体を実体顕微鏡下に置きます。外部光源で良好な照明を確保し、胸部をPBSで洗い流します。最初の肋骨を長筋に位置付け、次にデュモン鉗子の先端を使用して結合組織を長筋の外側にそっと露出させます。このプロセスを反対側で繰り返して2番目の星状神経節を見つけ、次に鉗子を180度回転させ、平らな面を使用して星状神経節をつかみ、最小限の圧力で引き出します。両方の星状神経節をPBSで満たされた皿に入れ、適切な倍率でそれらを検査します。余分な血管、脂肪組織、およびより大きな神経を取り除きます。星状神経節を4%メタノールフリーのパラホルムアルデヒドで室温で2時間固定します。自家蛍光の低減とシグナルバックグラウンド比の改善のために、スーダンブラックストック溶液を調製します。室温のマグネチックスターラーで2〜3時間溶解します。次に、ストック溶液を13, 000倍Gで30分間遠心分離してスーダンブラックワーキングソリューションを調製し、破片を除去します。ストックを70%エタノールで最終濃度0.25%スーダンブラックに希釈します。メタノール、30%過酸化水素、およびジメチルスルホキシドを4対1対1の割合で混合することにより、濃厚な漂白剤を調製します。星状神経節ごとに200マイクロリットルの漂白剤を添加して抗体の透過性を改善し、プレートを室温で1時間シェーカーに置きます。100、75、50、および25%メタノールをシェーカーで使用して、各溶液で10分間インキュベートしながら、下降する一連の水分補給を行います。透過処理のために、星状神経節をPBSで2回、1%Tritonと共に室温で60分間インキュベートします。星状神経節から透過処理溶液を取り出し、スーダンブラックワーキング溶液を加え、シェーカーで2時間インキュベートします。プレートを傾けて直立した側からピペッティングして、スーダンブラック溶液を慎重に取り出し、200マイクロリットルのPBSTを追加します。シェーカーで5

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ネズミ星状神経節の位置、解剖、分析

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