Name: Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a montar e operar um dispositivo acustofluidico para entrega eficiente de biomoléculas às células. Este método mantém a viabilidade celular e possui aplicações promissoras em terapias baseadas em células.

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Este trabalho foi apoiado, em parte, por meio de financiamento da Fundação Nacional de Ciência (#1827521, #1827521, #1450370) e dos Institutos Nacionais de Saúde (U01HL127518). Os serviços de fotolitografia foram prestados pelo Centro de Tecnologia Micro/Nano da Universidade de Louisville.

Doações de sangue foram coletadas de doadores saudáveis seguindo protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Louisville.
1. Fabricação de dispositivo acoustofluido
<ol><li>Obtenha uma fotomasmamama com um design espiral concêntrico contendo canais com um diâmetro de 500 μm. Um arquivo CAD é fornecido nos arquivos suplementares como exemplo. Uma máscara personalizada pode ser encomendada de um fornecedor comercial ou padronizada usando um escritor de máscaras.</li>
	<li>Prepare um molde do design em espiral concêntrico em um wafer de silício revestido de fotoresistista usando técnicas de fotolitografia padrão.<ol>
<li>Adicione aproximadamente 2 Colheres de Sopa (~30 mL) de SU-8 2100 a um wafer de silício de 100 mm.</li>
		<li>Gire o wafer em um spinner a uma velocidade de 150 rpm por 30 s para espalhar o fotoresist, em seguida, aumentar a velocidade para 1.200 rpm para 60 s para produzir uma espessura de 200 μm.</li>
		<li>Cure o wafer revestido de fotoresistista em um forno a vácuo de poliimida com uma rampa de 30 minutos para cima e 30 min residir a 115 °C, depois descer por 30 min.</li>
		<li>Exponha o wafer revestido de fotoresist para 130 s usando um alinhador de máscara com a máscara da etapa 1.1.</li>
		<li>Asse o wafer após a exposição após o mesmo processo descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Desenvolva o fotoresist na solução de desenvolvedor SU-8 por aproximadamente 8 minutos. ATENÇÃO: Use apenas a solução do desenvolvedor em um capô de fumaça química bem ventilado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Silanize o molde para tornar a superfície mais hidrofóbica. Coloque o wafer revestido de fotoresistista em um dessecator e adicione uma gota de 20 μL de cloroilano (C8H4Cl3F13Si). Aplique vácuo na câmara por 30 s, depois sele a câmara e saia durante a noite. ATENÇÃO: A cloroilana é muito perigosa e inflamável. A exposição causa queimaduras graves e danos oculares.</li>
	<li>Combine 54 g de base de polidimethsiloxano (PDMS) e 6 g de agente de cura em um copo e misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos 1 min.</li>
	<li>Coloque o copo contendo a solução PDMS em um dessecador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas da solução.</li>
	<li>Coloque wafer revestido de fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 mm.</li>
	<li>Despeje a solução PDMS sobre o molde dentro da placa de Petri de 150 mm.</li>
	<li>Se necessário, coloque a placa de Petri de 150 mm dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam.</li>
	<li>Transfira a placa de Petri de 150 mm para um forno de laboratório e asse por 2h a 60 °C para curar o PDMS.</li>
	<li>Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer usando uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear.</li>
	<li>Faça furos nas portas de entrada e saída de cada dispositivo usando um soco de biópsia de 2,5 mm.</li>
	<li>Coloque cada dispositivo PDMS em um asher de plasma com canais expostos (voltados para cima). Aplique tratamento de plasma de oxigênio (100 W para 45 s, 500 mbar O2) e coloque imediatamente cada dispositivo PDMS em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo (75 mm x 25 mm x 1 mm) com canais voltados para a superfície do vidro.</li>
	<li>Deixe os dispositivos se unirem durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de 1 cm de diâmetro com uma espessura de ~1-2mm, depois alinhe cuidadosamente o transdutor com a espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro (lado oposto do dispositivo PDMS).</li>
</ol>2. Montagem e operação do sistema acoustofluidic
<ol><li>Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um indicador LED de energia verde (rotulado PWR) deve acender.</li>
	<li>Use o programa associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de 8 MHz. Um programa de exemplo é fornecido nos F iles suplementares . Após o upload do programa, ele será armazenado na memória do microprocessador e não precisará ser carregado novamente.</li>
	<li>Soldar um fio de 1" 22G até a extremidade de cada fio no transdutor PZT.</li>
	<li>Conecte o fio terminal negativo (preto) do transdutor PZT a um pino GND através do fio soldado.</li>
	<li>Conecte o fio terminal positivo (vermelho) do transdutor PZT ao pino de saída (#9 no programa de exemplo fornecido) através do fio soldado.</li>
	<li>Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa em 3D. Os arquivos CAD são fornecidos nos Files upplemental Scomo exemplos. Fios adicionais podem ser conectados a outros pinos microcontroladores para controlar um indicador LED externo e botão de pressão liga/desliga, se desejar.</li>
	<li>Corte seções de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação para as portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura. Opcionalmente, após inserir o tubo em cada porta, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação.</li>
	<li>Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Corte uma seção de 3-6" do tubo de plástico macio tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) e empurre a tubulação sobre a tubulação de 1/32" de ID da tubulação de saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos.</li>
	<li>Encha uma seringa de 60 mL com ar ambiente (opcionalmente, filtre o ar com um filtro de 0,2-μm) e conecte-o à tubulação de PVC tygon (1/16" ID, 1/8" OD) na lateral do reservatório microfluido.</li>
	<li>Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mL/h para empurrar as soluções do agente de contraste celular/ultrassom através do dispositivo acoustofluidic a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mL/h e colete as amostras da saída do dispositivo acoustofluidic em um tubo de centrífuga de 50mL. Opcionalmente, enxágue o canal antes do tratamento acoustofluido com 15 mL de solução de 70% de etanol para aumentar a esterilidade dos canais fluidos. Além disso, os canais podem ser enxaguados com 15 mL de água desionizada para remover etanol residual no dispositivo antes de bombear células através do sistema.</li>
</ol>3. Preparação de agentes de contraste de ultrassom
NOTA: Os agentes de contraste do ultrassom aumentam significativamente a entrega acoustofluidic de compostos moleculares, aumentando transitoriamente a permeabilização das membranas celulares próximas19. A entrega molecular é muito limitada sem agentes de contraste de ultrassom neste sistema.
<ol><li>Prepare uma solução fosfolipílica em um frasco de cintilação de 20mL contendo a seguinte mistura:<ol>
<li>Adicione 25 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfocholina (DSPC).</li>
		<li>Adicione 11,6 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-etilfosforcholina (DSEPC).</li>
		<li>Adicione 0,26 mg de 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-fosfoglycerol (DSPG).</li>
		<li>Adicione 0,88 mg de estearato de polioximetileno40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos (por exemplo, 3 mL de clorofórmio).</li>
	<li>Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 h para formar uma película lipídica seca (evaporação sob argônio ou com um evaporador rotativo pode ser usado para acelerar o processo de secagem).</li>
	<li>Reidratar o filme lipídico com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS).</li>
	<li>Sonicar a solução lipídica por 3 min a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica.</li>
	<li>Após a sonicação armazenar a solução fosfolipídida a 2-6 °C por até 1 mês.</li>
	<li>Para preparar os agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 μL de solução micelar cônica e 600 μL de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de 2 mL.</li>
	<li>Sele o frasco acariciando a tampa.</li>
	<li>Use uma agulha de 1,5" 20G para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano para 30 s.</li>
	<li>Amalgamar o frasco para 45 s a 4.350 cpm para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom por 1 mL de solução celular imediatamente antes de bombear a mistura de agente de contraste combinado/célula através do dispositivo acoustofluidic. A solução celular pode ser modificada conforme desejado pelo usuário, mas em nossos estudos a solução celular consistiu em células T primárias na etapa 4.21, e células cancerígenas pulmonares A549 na etapa 5.7, respectivamente.</li>
</ol>4. Preparação de Tcélulas primárias
<ol><li>Isole as células mononucleares periféricas (PBMCs) de soluções de sangue inteiros e armazene a -150 °C. A separação de gradiente de densidade contendo um substrato é comumente utilizada para separar os PBMCs do sangue inteiro24,25,26.</li>
	<li>Descongele o frasco congelado em banho-maria de 37 °C.</li>
	<li>PbMCs descongelados diluídos 1:10 com PBS em um tubo de centrífuga de 15mL. Cada frasco 1mL contém aproximadamente 10 milhões de PBMCs.</li>
	<li>A centrífugas diluídas PBMCs a 580 x g para 11 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o supernasciente e adicione 13 mL de MACs executando buffer para resuspensar as células.</li>
	<li>Conte os PBMCs com um contador celular automatizado ou hemócito.</li>
	<li>Centrifugar os PBMCs novamente a 580 x g por 11 min a 4 °C e aspirar o supernasciente.</li>
	<li>Adicione 40 μL de tampão de corrida refrigerado por 10 milhões de PBMCs.</li>
	<li>Para isolar as células T, adicione 10 μL de Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail por 10 milhões de PBMCs.</li>
	<li>Agitar suavemente os PBMCs e armazenar a solução a 4 °C por 5 min por 10 milhões de células.</li>
	<li>Adicione 30 μL de buffer de corrida e 20 μL de Pan T-Cell MicroBead Cocktail por 10 milhões de PBMCs.</li>
	<li>Misture os PBMCs e as contas completamente e incubar por mais 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione buffer de execução para atingir um volume total de 500 μL.</li>
	<li>Separe as células T primárias com um instrumento de classificação magnética de bancada comercialmente disponível usando a configuração de "separação esgota" seguindo o protocolo do fabricante. Esta etapa deve render entre 5-10 milhões de células T após a classificação celular.</li>
	<li>Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemótmetro.</li>
	<li>Diluir células T em 10 mL de PBS estéril e centrífuga a 580 x g por 10 min a 4 °C para pelotar as células.</li>
	<li>Aspire as células T supernascidas e resuspend em 1 mL de PBS.</li>
	<li>Conte células T usando um contador celular automatizado ou hemócitometro e alíquota de 1 milhão/mL para experimentos.</li>
	<li>Prepare uma solução de fluoresceína de 1 mg/mL em PBS.</li>
	<li>Adicione 100 μL de solução de fluoresceína de 1 mg/mL por solução celular T de 1 mL (concentração final de fluoresceína = 100 μg/mL) imediatamente antes do processamento.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.</li>
	<li>Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de fluoresceína em células T primárias.</li>
	<li>Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação a 580 x g por 10 min com 500 μL de PBS para remover fluoresceína extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de fluoresceína.</li>
	<li>Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 250 μL de PBS e mede a fluorescência no citômetro de fluxo.</li>
</ol>5. Preparação de células cancerígenas de pulmão A549
<ol><li>Cultura A549 (epitelial basal adenocarcinomômico humano) células em mídia DMEM completa (10% soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina) a 37 °C e 5% CO2 em um frasco de cultura de tecido de fundo plano.</li>
	<li>Colher células A549 quando atingirem 70-90% de confluência. Aspirar a mídia do frasco e lavar as células uma vez com PBS para remover proteínas séricos.</li>
	<li>Adicione trippsina (0,25%) EDTA ao frasco e incubar por 5 min a 37 °C. Trippsina é uma enzima digestiva que faz com que as células se desprendem da superfície inferior do frasco de cultura tecidual.</li>
	<li>Transfira a solução trypsin para um tubo de centrífuga de 15mL e neutralize-o adicionando mídia DMEM completa a uma proporção de 1:3.</li>
	<li>Pelota as células via centrifugação a 1.500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o supernasal e resuspenha a pelota em uma concentração de 100.000/mL em solução PBS contendo trehalose de 200 mM em frasco cônico de 15 mL.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução de agente de contraste de ultrassom, conforme descrito anteriormente na etapa 3.11.</li>
	<li>Processe alíquotas 1mL de células usando o sistema acoustofluido (ver etapas 2.10-2.11). Esta etapa aumenta a entrega de trehalose em células cancerígenas de pulmão A549.</li>
	<li>Imediatamente após o tratamento, lave as células três vezes via centrifugação com 500 μL de PBS para remover trehalose extracelular. As células devem ser lavadas dentro de 10 minutos após a adição de solução de trehalose.</li>
	<li>Após a etapa final de lavagem, resuspend as células em 100 μL de PBS.</li>
	<li>Adicione 11 μL de solução Triton X-100 de 1% às células de lise e solte trehalose intracelular.</li>
	<li>Vórtice para 15 s, em seguida, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Vórtice novamente para 15 s, em seguida, medir a concentração de trehalose usando ensaio de trehalose comercialmente disponível seguindo a recomendação do fabricante.</li>
</ol>

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Os coautores MAM e JAK possuem propriedade na DesiCorp que podem se beneficiar financeiramente de produtos relacionados a esta pesquisa.

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes27. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução de 70% de eta...

Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhorar a absorção de biomoléculas nas células 3. A eletroporação é uma plataforma de entrega molecular não viral comumente utilizada que tem a capacidade de induzir perfuração transitória na membrana plasmática para a entrega intracelular dos compostos moleculares4,5,6,7,8,9. No entanto, a perfuração transitória da membrana plasmática é um processo estocástico e a absorção molecular via eletroporação é geralmente dependente da difusão passiva através dos poros da membrana transitória4,7,8.
Um método alternativo é a utilização de ultrassom para melhor entrega molecular intracelular através da cavitação de agentes de contraste de ultrassom (ou seja, microbolhas cheias de gás). A cavitação de microbolhas induz efeitos de microstreaming na mídia circundante que podem causar perfuração transitória de membranas plasmáticas próximas ("sonoporação") permitindo a rápida absorção intracelular de biomoléculas através de mecanismos de transporte passivos ou ativos10,11,12. A sonoporação é uma técnica eficaz para a rápida entrega molecular às células, mas essa abordagem muitas vezes requer equipamentos caros e métodos de tratamento em massa que são limitados por menor rendimento e maior variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom13. Para lidar com essas limitações, os dispositivos aoustofluidos, que permitem a sonoporação consistente das células em suspensão, estão atualmente em desenvolvimento.
Acoustofluidics é um campo em expansão que integra tecnologias de ultrassom e microfluidic para uma ampla variedade de aplicações. Esta abordagem tem sido usada anteriormente para a separação de partículas, aplicando energia contínua de ultrassom para induzir ondas acústicas permanentes dentro dos canais fluidos14,15,16,17. As partículas são classificadas em diferentes partes do dispositivo com base em uma variedade de propriedades, como tamanho de partícula, densidade e compressão em relação ao médio16. Tecnologias acoustofluídicas também estão em desenvolvimento para permitir a entrega molecular rápida a uma variedade de tipos de células para aplicações de pesquisa e fabricação de terapias celulares18. Recentemente, demonstramos uma entrega molecular aprimorada para eritrócitos usando um dispositivo acoustofluido baseado em PDMS19. Na plataforma acoustofluidic, a dinâmica celular e microbolhas pode ser manipulada para induzir interações físicas que permitem uma entrega aprimorada de biomoléculas. A eficiência e consistência da entrega molecular intracelular pode potencialmente ser aumentada otimizando a distância entre células e microbolhas.
Uma aplicação importante para a sonoporação mediada por aoustofluidic envolve o transporte de biomoléculas para células T humanas primárias. Imunoterápicos baseados na transferência de células T adotivas, como a terapia de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR T), estão surgindo rapidamente para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e vírus como o HIV20. A terapia CAR T tem sido particularmente eficaz em pacientes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA), com taxas de remissão completas de 70-90%21. No entanto, a fabricação de células T para essas terapias geralmente depende da transdução viral, que é limitada por mutagênese insercional potencial, longos tempos de processamento e desafios de fornecer biomoléculas não genéticas, como proteínas ou pequenas moléculas1. Métodos de entrega molecular mediados por acoustofluidic podem potencialmente superar essas limitações e melhorar a fabricação de terapias celulares T.
Outra aplicação importante para a sonoporação mediada por austofluidic envolve a entrega intracelular de compostos conservantes, como o trehalose, que protegem as células durante o congelamento e a dessecação. O trehalose é produzido por alguns organismos na natureza e os ajuda a tolerar congelamento e dessacação protegendo suas membranas celulares22,23. No entanto, o trehalose não é produzido por células mamíferas e é impermeável às membranas celulares de mamíferos. Portanto, técnicas eficazes de entrega molecular, como a sonoporação, são necessárias para alcançar níveis suficientes de trehalose intracelular necessários para proteger membranas celulares internas. Esta abordagem está atualmente em desenvolvimento para preservação seca de vários tipos de células.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada da montagem e operação de um sistema aoustofluido relativamente de baixo custo conduzido por um microcontrolador. Os agentes de contraste do ultrassom são utilizados para induzir a sonoporação dentro dos canais fluidos e permitir a entrega molecular rápida para vários tipos de células, incluindo células T e células cancerosas. Este sistema acoustofluidic pode ser usado para uma variedade de aplicações de pesquisa e também pode ser útil como um sistema protótipo para avaliar métodos de sonoporação para melhores processos de fabricação de terapia celular.

<table><tbody><tr><td>Fabricação de Dispositivo Acustofluídico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOW SYLGARD 184 ENCAPSULANTE DE SILICONE TRANSPARENTE 0.5 KG KIT</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862 (SKU)</td><td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td></tr> <tr><td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69039-25</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório Microfluídico para Tubo Falcon de 15 mL - S (2/4 porta)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td><td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td></tr><tr><td>Lâmina de Microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td></tr><tr><td>triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>105732-02-3 (Cas. No.)</td><td>O clorossilano é muito hazarado e inflamável. A exposição causa queimaduras graves e danos aos olhos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulação de plástico macio Tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K51 (Parte #)</td><td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td></tr><tr><td>Montagem do Sistema Acústico-fluídico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno</td><td>Arduino 7630049200050</td><td>(Código de Barras)</td><td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td></tr><tr><td><forte>Preparação de Agentes de Contraste Ultrassônicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>890703P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/890703</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850365P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/850365</td></tr><tr><td>1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG)</td><td>Avanti Lipids</td><td>840465P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/840465</td></tr><tr><td>APF-140HP (gás decafluorobutato)</td><td>FlouroMed</td><td>355-25-9 (Cas No.)</td><td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td></tr><tr><td>DB-338 Amalgamadores&nbsp;</td><td>COXO</td><td></td><td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td></tr> <tr><td>polioxietileno 40 estearato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440-250G (SKU)</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td></tr><tr><td>Q125 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110 (Ref.)</td><td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r</td></tr><tr><td>Preparação de células T primárias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACs executando tampão</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221 (Nº de pedido)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células T Pan, humano (Coquetel de anticorpos de biotina de células T Pan & Coquetel Pan T-Cell MicroBead)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-535 (Nº de pedido)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td></tr><tr><td>classificador de células magnéticas (autoMACS Pro Separator)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545 (Nº de pedido)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td></tr><tr><td>Preparation of A549 Lung Cancer Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trehalose Assay Kit&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-TREH (Cat. Não.)</td><td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td></tr><tr><td>Azul de tripano (0,4% em solução aquosa Pronto a usar, estéril)</td><td>VWR</td><td>97063-702 (Cat. Não.)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td></tr></tbody></table>

montagem e operação de um dispositivo acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.

Uma imagem do sistema acoustofluido montado dentro de uma caixa impressa em 3D é mostrada na Figura 1. Este protocolo produz um sistema acoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares usando agentes de contraste de ultrassom.
Figura 2   demonstra maior entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias com trata...

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.

Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido que pode fornecer biomoléculas eficientemente para uma variedade de pesquisas e aplicações terapêuticas baseadas em células. A principal vantagem deste sistema é que ele permite a entrega rápida de biomoléculas às células, mantendo sua viabilidade. É uma tecnologia de plataforma que permite que as células sejam transformadas para uma variedade de aplicações terapêuticas celulares, como o tratamento do câncer.Comece combinando 54 gramas de base PDMS e seis gramas de agente de cura em um copo. Misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos um minuto, em seguida, colocou o copo com a solução PDMS em um desiccador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas. Coloque um wafer revestido fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 milímetros, em seguida, despeje a solução PDMS sobre o molde.Se necessário, coloque a placa de Petri dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam. Transfira a placa de Petri para um forno de laboratório e asse por duas horas a 60 graus Celsius para curar o PDMS. Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer com uma lâmina de barbear.Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear, em seguida, faça furos através das portas de entrada e saída usando um soco de biópsia de 2,5 milímetros. Depois de tratar o dispositivo PDMS com plasma de oxigênio, coloque imediatamente cada dispositivo em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo com canais voltados para a superfície do vidro. Permita que os dispositivos se unam durante a noite à temperatura ambiente.Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de um centímetro de diâmetro com uma espessura de um a dois milímetros, em seguida, cuidadosamente alinhado o transdutor com uma espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro. Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um led de energia verde deve acender.Use o software associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de oito mega-hertz. Soldar um fio de calibre de 22 polegadas até a extremidade de cada fio no transdutor PZT. Em seguida, use-o para conectar o fio terminal negativo do transdutor PZT a um pino GND.Conecte o fio terminal positivo do transdutor PZT ao pino de saída através do fio soldado. Corte seções de três a seis polegadas de tubos de plástico macio tygon PVC e empurre a tubulação para dentro das portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura.Opcionalmente, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação. Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa 3D. Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.Corte uma seção de três a seis polegadas de tubos de plástico de plástico macio tygon PVC de 1/16 polegadas de diâmetro interno e empurre-o sobre a tubulação de diâmetro interno de 1/32 polegadas da saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos. Encha uma seringa de 60 mililitros com ar ambiente na lateral do reservatório microfluido.Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mililitros por hora para empurrar as soluções do agente de contraste através do dispositivo acoustofluido a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mililitros por hora e colete as amostras da saída do dispositivo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Prepare uma solução fofolipílica em um frasco de cintilação de 20 mililitros adicionando 25 miligramas de DSPC, 11,6 miligramas de DSEPC, 0,26 miligramas de DSPG e 0,88 miligramas de estearato de polixietileno40. Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos.Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 horas para formar uma filme lipídico seco. Reidratar a espuma com 10 mililitros de PBS estéril e, em seguida, sonicar a solução lipídica por três minutos a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica. Após a sônicação, a solução fofolipídida pode ser armazenada de dois a seis graus Celsius por até um mês.Para preparar agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 microliters de solução micelar cônica em 600 microliters de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de dois mililitros. Sele o frasco acariciando a tampa. Use uma agulha de calibre 1,5 polegadas de 20 polegadas para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano por 30 segundos.Amalgamar o frasco para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano. Adicione 25 microliters de solução de agente de contraste de ultrassom por um mililitro de solução celular. Em seguida, bombeie imediatamente o agente de contraste combinado e a mistura celular através do dispositivo acoustofluido.Este protocolo produz um sistema aoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares. A entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias foi melhorada com tratamento acoustofluido em comparação com um grupo de controle não tratado. A intensidade da fluorescência das células T aumentou cinco vezes após o tratamento, indicando maior entrega de fluoresceína.A viabilidade celular diminuiu ligeiramente após um tratamento acoustofluido, mas permaneceu acima de 80% O tratamento intracelular aumentou a entrega intracelular de um composto conservante trehalose para células de carcinoma pulmonar A549 humanos em comparação com o fluxo sozinho e para as células do grupo controle não tratado. Adicionar os microbolhas cationic à solução celular é fundamental. A entrega intracelular de biomoléculas será limitada sem microbolhas cationic em solução.Esta plataforma permite a entrega intracelular de várias biomoléculas, que podem alterar a função celular para pesquisa ou fins terapêuticos. Após a conclusão desse procedimento, pode ser realizada caracterização celular adicional para avaliar o impacto da entrega de diversas biomoléculas.

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