Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

Este protocolo produz regiões de marca-passo intactas da pélvis renal, o órgão muscular liso dentro do rim que bombeia urina para dentro do ureter e para a bexiga. Ao contrário das células isolantes da pélvis renal, essa abordagem fornece ambientes intactos em ambientes in situ de regiões de marca-passo da pélvis renal e uma preparação mais fisiológica para o estudo do ritmo da pélvis renal. Um indivíduo que nunca realizou essa técnica pode lutar para cortar seções uniformes.

Um usuário iniciante deve garantir que o rim esteja nivelado no estágio vibratome e não acelere o processo de corte. Usando fórceps internos e tesouras internas de dissecção, belisque os intestinos e levante-os para longe da parede abdominal. Corte simultaneamente a parte inferior dos intestinos livre do corpo no duodeno proximal e no cólon distal para ter acesso ao espaço retroperitoneal que contém os rins.

Belisque suavemente e levante a extremidade distal do ureter com fórceps teciduais. Usando a tesoura de dissecção, corte sob o ureter beliscado em direção ao rim até que ele se liberte do tecido conjuntivo circundante. Uma vez que os rins são expostos, extraia-os individualmente.

Encha um prato revestido de elastômero de silício com solução KRB gelada. Transfira o rim para o prato de dissecção e certifique-se de que ele está completamente submerso. Use uma tesoura de mola fina e fórceps internos para remover tecido adiposo da base do rim para expor a pelve renal distal, ou RP, e ureter proximal.

Remova o ureter proximal e uma porção do RP distal da base usando tesouras de mola fina e fórceps. Fure a cápsula renal externa com fórceps finos, afastando as pontas do corpo dos rins. Usando fórceps com cada mão, aperte as pontas soltas da cápsula e descasque-as até que a membrana restante da cápsula renal seja totalmente removida.

Insira uma lâmina de barbear no suporte da lâmina do instrumento vibratome e ajuste o ângulo de desembaraço da lâmina para aproximadamente 18 graus. Ajuste os parâmetros da lâmina como mencionado no manuscrito do texto, garantindo que a espessura da seção renal não exceda 150 micrômetros, o que afetaria negativamente os experimentos de imagem de íons de cálcio. Use fórceps sem corte para agarrar suavemente e remover o rim preparado da solução KRB gelada.

Coloque imediatamente o rim em papel absorvente por aproximadamente dois a quatro segundos para remover o excesso de umidade externa. Role suavemente o rim através do papel absorvente para garantir que todos os lados do parênquim tenham secado para que haja uma ótima adesão do rim ao estágio vibratome. Aplique imediatamente uma fina camada de cola cianoacrilato na base da placa da amostra de vibratome e use fórceps sem corte para colocar o lado ureter renal para baixo na área coberta de cola.

Aplique suavemente pressão para baixo na parte superior do rim com a borda plana dos fórceps por aproximadamente 10 a 20 segundos para secar a cola. Fixar firmemente a placa da amostra na parte inferior da bandeja tampão e ajustar o nível da solução KRB para que a parte superior do rim esteja totalmente imersa. Para seção automática de vibratome, selecione as posições de início e extremidade do ciclo de corte da lâmina vibratome de 0,5 a 1 centímetro do rim para garantir que todo o plano renal esteja sendo seccionado.

Inicie o processo de corte automático, certificando-se de que a lâmina faça contato com o rim. Usando fórceps, colete seções que são liberadas do rim e transfira-as imediatamente para poços individuais. Continue o protocolo de secção e use um microscópio leve para identificar regiões de PKJ nas fatias de rim até que as regiões do PKJ se tornem mais aparentes.

Encha um prato de imagem revestido de elastômero de silício com solução KRB gelada. Transfira uma fatia de rim individual para o prato. Insira pinos minutien ao redor da periferia de uma fatia de rim para fixar a seção na base do prato de imagem.

Coloque o prato de imagem no palco de um microscópio confocal de disco giratório vertical e comece imediatamente a perfumar com a solução KRB. Use uma lente objetiva de imersão em água de baixa ampliação para localizar a fatia renal. Centralizar o campo de imagem em áreas da fatia onde o PKJ está presente usando pontos turísticos.

Uma vez que o PKJ esteja localizado, use uma lente objetiva de imersão de água de ampliação mais alta para ampliar a área de interesse. Distinguir diferentes células de interesse em diferentes tipos de durações transitórias de íons de cálcio na parede PKJ. Uma vez identificadas células de interesse, ajuste a intensidade do laser para produzir uma boa relação sinal-ruído e regissume imagens em uma frequência de amostragem temporal entre 16 e 32 Hertz.

Imagens microscópicas leves de seções renais inteiras mostram marcos anotados de uma única região PKJ. Várias regiões de PKJ apresentam-se perto da medula interna e do rim distal. As localizações das artérias renais do PKJ e dos limites do PKJ são mostradas aqui.

Uma seção PKJ de um mouse expressando GCaMP em células alfa positivas PDGFR é mostrada aqui. A fina parede PKJ suspensa entre tecido parenchímico pode ser distinguida usando marcos como a arteriola renal. A expressão de GCaMP6f neste tecido transgênico específico é espalhada por toda a largura do PKJ através das camadas muscular e aventurna.

No PDGFR alfa GCaMP6f fatias positivas de rim, uma rede de células que normalmente se estende sobre a largura da parede PKJ é fluorescente e exibe transitórios de íons de cálcio oscilantes de várias durações e frequências. Em fatias positivas de rim SMC GCaMP3, uma camada de células positivas GCaMP3 estão presentes na camada muscular. Um mapa espostotemporal mostra que as células alfa positivas PDGFR localizadas no PKJ adventitia provocam transitórios de íons de cálcio de baixa frequência de longa duração, enquanto os SMCs dispararam transitórios de íons de cálcio de menor duração com mais frequência.

Da mesma forma, também foram observados uma matriz de sinais de íons de cálcio fluorescentes dentro e ao redor coletando dutos e transitórios de íons de cálcio oscilantes nos SMCs. Ao tentar este procedimento, é importante que o rim esteja o mais nivelado possível durante a seção de vibratome para garantir que fatias de rim uniformes sejam liberadas do bloco. Após esse procedimento, outros métodos como isolamento unicelular, imunohistoquímica e estudos moleculares podem ser realizados para aumentar nossa compreensão dos mecanismos de marca-passo na pelve renal.