Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

Registrar a atividade elétrica da célula espermática usando a técnica patch-clamp tem sido fundamental na identificação de vários canais iônicos espermatozoides e na compreensão da eletrofisiologia do esperma em nível molecular. Esse método se destaca na medição de impressões digitais eletrofisiológicas e farmacológicas dos canais iônicos e é a ferramenta mais confiável para identificação de canais iônicos. Dada a importância fisiológica dos canais iônicos e dos transportadores eletrogênicos para a fertilidade masculina, essa técnica é uma ferramenta poderosa para entender certos defeitos espermatozoides que levam à infertilidade.

Para a fabricação de micropipetas, comece com capilares de vidro borosilicato com diâmetro externo de 1,5 milímetros, diâmetro interno de 0,86 milímetros e filamento interno. Certifique-se de que o diâmetro interno da ponta da pipeta seja aproximadamente dois micrômetros antes do polimento ao fogo e reduzido para 0,5 micrômetros após o polimento adequado. Monte uma ponte de ágar para manter o ambiente ao redor do eletrodo de referência estável.

Faça um capilar de vidro em formato de L dobrando-o sob um pequeno fogo de Bunsen e deixe esfriar. Faça uma solução de 1%agarose em um molar de cloreto de potássio e aqueça-a em um micro-ondas até que a agarose derreta e a solução fique transparente. Preencha cuidadosamente o capilar de vidro em forma de L com a agarose para evitar bolhas de ar e deixe esfriar até a temperatura ambiente.

Alternativamente, submerga o capilar de vidro em forma de L na agarose derretida. Gire o recipiente várias vezes e aqueça novamente no micro-ondas até a agarose ferver, o que expulsará bolhas de ar da ponte de ágar. Abra a região inferior do abdômen do camundongo com tesoura e extraia ambos os epidídimos.

Coloque-as em um recipiente de cultura celular de 35 milímetros preenchido com solução salina ou HS pré-aquecida até a temperatura ambiente. Transfira os epidídimidos para um novo recipiente de cultura celular contendo solução de HS e remova completamente toda a gordura residual. Separe os epidídimidos em caput, corpus e cauda usando uma lâmina de bisturi número 15.

Transfira o corpo de cada epidídimo para um novo prato de cultura celular contendo solução de HS. Faça múltiplas incisões na parte isolada do epidídimo usando uma lâmina pontiaguda número 11 do bisturi. Transfira as partes dos epidídimos com múltiplas incisões para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 1,5 mililitros de solução de HS.

Agite brevemente os espermatozoides do epidídimo para a solução usando pinças Superfine Dumont Tipo 5A. Depois, descarte os epidídimos e deixe o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. Espere até que a matéria sólida sedimente o fundo do tubo.

Depois, transfira o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Encontre a célula espermática adequada com gotícula citoplasmática usando ampliação de 600x. Certifique-se de que a gotícula citoplasmática seja oval e tenha uma forma ligeiramente alongada semelhante a um fuso.

Selecione um espermatozoide que seja móvel com a cabeça presa ao deslize de cobertura de modo que a célula espermatozoide fique parcialmente fixa, mas a gotícula citoplasmática e o restante do flagela continuem a se mover com batidas dos flagelos. Certifique-se de que a cabeça do espermatozoide esteja solta presa à capa de cobertura. Após a seleção visual de um espermatozoide com morfologia adequada, encha a micropipeta com a solução da pipeta e prenda-a no suporte da pipeta.

Para manter a ponta da pipeta limpa dos detritos, aplique pressão positiva na pipeta usando o conjunto em formato de tubo em U. Abaixe a pipeta e mergulhe a ponta na solução do banho. Para visualizar claramente a célula, posicione a ponta da pipeta acima da gota citoplasmática de modo que a abertura da ponta fique alinhada diagonalmente em direção à gota.

Abaixe rapidamente a ponta da pipeta em direção à gota para que fiquem no mesmo plano focal. Assim que a ponta da pipeta tocar a gota, aplique pressão negativa na pipeta para mover parte da gota para dentro da ponta e formar uma vedação de giga-ohm. Depois, levante o espermatozoide da cobertura da capa.

Compense a transiência da capacitância dispersa usando o modo compensatório do amplificador antes de transitar para o modo célula inteira. Realize um amaciamento e faça a transição para o modo célula inteiro aplicando um milissegundo, pulsos de tensão que aumentam gradualmente combinados com uma sucção muito leve. Após a aplicação de cada pulso de tensão de amaciamento, inicie a ferramenta de teste de membrana para verificar se há transitoria maior de capacitância.

Ajuste a transiência de capacitância maior para determinar a capacitância de toda a célula, assim como sua resistência de acesso. Após uma adaptação bem-sucedida, prossiga com os experimentos planejados de patch-clamp de célula inteira, como aplicar várias soluções de banho contendo diferentes compostos ou medir as atividades do canal usando protocolos de passos de tensão ou rampa de tensão. Os registros CatSper foram realizados estabelecendo um selo de alta resistência entre a pipeta de remendo e o espermatozoio de mamífero em sua gotícula citoplasmática.

As densidades das correntes CatSper de césio inteira foram registradas em espermatozoides de neurônios caudais selvagens e em neurônios caudais deficientes em CatSper. As células espermáticas de diferentes espécies são diversas em sua morfologia e vias regulatórias internas. Espermatozoides de primatas e humanos apresentaram propriedades e regulação semelhantes dos canais CatSper.

Curiosamente, a ativação da progesterona do CatSper parece ser única para os espermatozoides primatas. Espermatozoides de javalis, touros e roedores não apresentaram nenhuma alteração estimulada por progesterona em suas correntes CatSper. Em espermatozoides de touro e javalim, até a atividade basal dos canais CatSper estava abaixo dos limites detectáveis, sugerindo que o influxo de cálcio e a consequente hiperativação são impulsionados por outros canais ou transportadores, ou que um estimulador natural diferente é necessário para ativar seus canais CatSper.

As gotículas citoplasmáticas pequenas, lisas, uniformes e não excessivamente inchadas são mais adequadas para patch-clamp. Você deve evitar usar aquelas gotículas citoplasmáticas minúsculas, unilaterais, inchadas e totalmente transparentes, pois elas resultarão em vedação fraca ou inexistente. Essa técnica permite o estudo detalhado de canais de ar específicos em seu sistema natural de expressão, e o sucesso depende de células espermáticas variáveis de alta qualidade, regiões puras, habilidades básicas de fisiologia intelectual, paciência e, mais importante, persistência.