Name: Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp em espermatozoides de mamíferos para registrar atividade de canais iônicos como o CatSper. Este método avança o entendimento da fisiologia espermática e da infertilidade masculina.

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<table><tbody><tr><td>IX71 com óptica DIC</td><td>Olympus Inc</td><td>IX71</td><td>Nikon TiU microscópio também pode ser usado</td></tr><tr><td>UplanSApo 60x</td><td>Olympus Inc</td><td></td><td><Objetivo >imersão na água</td></tr><tr><td>Mesa de ar com amortecimento de vibração</td><td>Newport Inc</td><td></td><td>TMC airtables ou similares podem ser usadas</td></tr><tr><td>Axopatch & trade; Amplificador 200B</td><td>Axon & comércio; &nbsp; /Dispositivos Moleculares</td><td></td><td>Sutter IPA&reg;/Double IPA&reg; O sistema integrado de patch clamp também é um excelente amplificador</td></tr><tr><td>Conversor analógico para digital Axon Digidata</td><td>Axon & comércio; &nbsp; /Dispositivos Moleculares</td><td>1440 ou 1550</td><td>podem ser usadas também</td></tr><tr><td>Osmômetro de pressão de vapor</td><td>Wescor</td><td>Modelo 5600</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador MPC 385</td><td>Instrumentos Sutter, Novato CA</td><td>MPC 385</td><td>A série de micromanipuladores TransferMan de Eppendorf também pode ser usada</td></tr><tr><td>Puxador de micropipeta</td><td>Instrumentos Sutter, Novato CA</td><td>P1000</td><td>P97 pode ser usado</td></tr><tr><td>MicroForge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td><-em> Devem ser equipados com objetivo Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Caseiro</td><td></td><td><-> para proteger o setup de interferências elétricas ambientes</td></tr><tr><td>&nbsp; Slips de cobertura de vidro de 5 mm</td><td>WPI</td><td>&nbsp;#502040</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de perfusão</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>&nbsp; RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro borosilicato</td><td>Instrumentos Sutter, Novato CA</td><td>BF 150-85-7.5</td><td>diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 0,86 mm e filamento interno</td></tr><tr><td>Coletor de Teflon MP-8</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>64-0211</td><td>Variedade de perfusão de Teflon de 8 posições</td></tr><tr><td>Placa Nunc de 4 poços</td><td>Nunc</td><td>#179820</td><td></td></tr><tr><td>1 x HTF buffer</td><td>EmbryoMax</td><td>MR-070-D</td><td><solução > capacitação</td></tr><tr><td>SA-Oly/adaptador de 2 estágios</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>para plataformas da Série 20</td><td><>somente para microscópio Olympus</td></tr><tr><td>Plataforma magnética aquecida</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>PM-1 ou série similar</td><td> para guardar a câmara RC-24E</td></tr><tr><td>Grampo magnético MAG-1</td><td>Warner Instruments, Inc</td><td>#64-0358</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para microeletrodos com pellet de 2mm Ag/AgCl</td><td>WPI</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Stopcock com conexões com Luer; 4 vias; Trava masculina</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-30600&ndash; 09</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de espiga de mangueira Luer fêmea, 1/16"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-45508&ndash; 00</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de perfusão de politetrafluoroetileno (PTFE)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-06417&ndash; 21</td><td> (Tubo de PTFE Microfurado, 0,022" ID e horários; 0,042" OD)</td></tr><tr><td>Tubo conector de silicone (tubo de silicone curado com platina, 1/32" ID e horários; 3/32" OD)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-95802&ndash; 01</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conector do coletor (Tubo de PTFE, 1/32" ID e horários; 1/16" OD)</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>EW-06407&ndash; 41</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de barb da série Luer masculina, 1/16"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>45518&ndash; 00</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de trava integral Luer macho 1/8"</td><td>Cole-Parmer, Inc</td><td>45-503-04</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conector de silicone</td><td>Dow Silicone Corporation; &nbsp; MI</td><td>#508-008</td><td></td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Fisher Scientific ou VWR</td><td>Luer de Tite de Ar, Norma Objetiva</td><td>1 mL, 3 mL e 20 mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60216</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523-250G</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de sódio (60% à semana)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7900</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBG2421V</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td>metanassulfonato de césio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBF5871V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Qualidade Biológico</td><td>315-006-721</td><td>1 solução M de similar</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Meio Embryomax Human Tubal Fluid:</td><td>Millipore</td><td>MR-070-D</td><td>< meio capacitador >em para espermatozoides murinos</td></tr><tr><td>(Embryomax-HTF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Animais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratos Wistar machos</td><td>Wistar</td><td>Laboratórios Harlan (Livermore, CA)</td><td><eles>ratos adultos</td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos machos</td><td>C57BL/6 camundongos</td><td>Laboratórios Harlan (Livermore, CA)</td><td>< eles> 3 a 6 meses</td></tr></tbody></table>

registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

Recording Electrical Currents across the Plasma Membrane of Mammalian Sperm Cells

Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for ...

recording-electrical-currents-across-plasma-membrane-mammalian-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.

Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS

Este protocolo descreve uma técnica rápida para quantificar a translocação do GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática de células por citometria de fluxo.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Aprenda a técnica de patch-clamp em espermatozoides de mamíferos para registrar atividade de canais iônicos como o CatSper. Este método avança o entendimento da fisiologia espermática e da infertilidade masculina.

Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

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