Name: Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila melanogaster usando placas de Petri com corantes. Este método permite avaliar comportamento alimentar e preferências gustativas de forma eficiente.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Tingwei Mi por ajudá-los a otimizar o ensaio de alimentação de duas opções. Eles também gostariam de agradecer Samuel Chan e Wyatt Koolmees por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, com subsídios R03 DC014787 (Y.V.Z.) e R01 DC018592 (Y.V.Z.) e pela Fundação Ambrose Monell.

1. Montagem das câmaras de ensaio
NOTA: Embora este protocolo descreva o uso de uma placa de Petri de 35 mm(Figura 1A),o efeito desejado pode ser alcançado usando qualquer vaso de fundo liso e impermeável que possa ser bisseccionado e coberto.
<ol><li>Primeiro, bissectar uma placa de Petri de 35 mm com tampa fixando um comprimento de plástico (5 mm de largura e 3 mm de altura) pela linha média com adesivo impermeável, formando dois compartimentos impermeáveis. Confirme se o selo está completo para evitar vazamentos que podem levar à mistura dos dois substratos alimentares que estão sendo avaliados. NOTA: Após a montagem, reutilize este aparelho enquanto o selo aguentar.</li>
</ol>2. Preparando frascos de fome
<ol><li>Preparar um número suficiente de frascos de mosca de plástico vazio; em seguida, livremente compactar um pedaço de papel de tecido na parte inferior. Comprimir o papel de tecido o suficiente para que ele preencha o espaço, mas não tanto que ele forma uma massa densa. NOTA: Certifique-se de que não há fendas profundas ou dobras no tecido, pois isso pode levar as moscas a ficarem presas.</li>
	<li>Adicione ~3 mL de água pura ao frasco para que o tecido esteja completamente saturado, mas não há água parada. Certifique-se de que não há grandes gotículas de água em excesso na parede do frasco. Alternativamente, o substituto surgiu para o papel encharcado, preparando uma solução de 1% w/v de ágar (sem sacarose) adicionando 5 mL de 1% de agarose a cada frasco vazio e permitindo que a agarose solidifice à temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Fome úmida de moscas antes do experimento
<ol><li>Inicie a fome 24 horas antes da hora do experimento. Sob anestesia de CO2, grupos de ~70, 2-4 dias de idade voam para os frascos de fome preparados, rotulando cada frasco com o genótipo e tempo de fome.</li>
</ol>4. Configuração do reagente
<ol><li>Preparação de corantes NOTA: Antes de realizar quaisquer experimentos, é importante realizar um ensaio de controle preliminar para determinar as concentrações corretas de corantes vermelhos e azuis a serem usados.<ol>
<li>Para o ensaio de controle, prepare uma série de diluições para cada corante, e realize o ensaio de alimentação com o mesmo alimento com uma corante diferente. Use os resultados para identificar concentrações de dois corantes (um vermelho, um azul) que produzem um PI de ~0 quando nenhum composto experimental é adicionado (ver seção 7). NOTA: Por exemplo, a concentração final de corante azul foi fixada em 50 μM e testada contra uma série de concentrações de corante vermelho. Com base na curva de dosagem de corante vermelho, a concentração ideal de corante vermelho foi de 210 μM, o que deu viés de corante mínimo(Figura 1B). Uma maior concentração de corante vermelho leva as moscas a preferir alimentos vermelhos, enquanto uma menor concentração leva as moscas a preferir comida azul. Refine cuidadosamente as concentrações de corante azul ou vermelho em incrementos de 1 μM, pois diferenças dessa magnitude e maior podem afetar os resultados experimentais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de 1% de agarose<ol>
<li>Combine 0,5 g de agarose e 50 mL de água pura (ou alguma delas múltipla) em um vaso seguro para micro-ondas. Micro-ondas a solução agarose até dissolver, agitando-a conforme necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de outros componentes alimentares<ol>
<li>Dissolva cada componente alimentar, incluindo sacarose e quaisquer compostos experimentais, em água a uma concentração 100 vezes ou maior da concentração testada final. NOTA: O volume total de cada ingrediente alimentício adicionado a 1% de ágar não deve exceder 1 mL por 10 mL de ágar derretido. Caso contrário, a agarose pode ser muito diluída e não se solidificar adequadamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de mídia alimentar<ol>
<li>Misture ágar, corante e o composto experimental desejado em tubos cônicos de centrífugas de polipropileno (15 ou 50 mL); usar água em vez do tastant experimental no alimento de controle. Faça isso enquanto o ágar ainda estiver completamente líquido e misture completamente usando uma batedeira de vórtice. Mantenha os tubos em um banho de água de 60 °C enquanto não estiver em uso para evitar que a agarose endureça antes de ser distribuída em pratos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparando pratos para o experimento NOTA: Certifique-se de que todos os pratos estão completamente secos antes de começar.<ol>
<li>Pipeta 1 mL de meio de alimentação experimental vermelha em um lado do prato de ensaio (Figura 1A); repetir para o número desejado de pratos. Deixe a agarose esfriar até ficar firme (3-5 min), e depois pipeta 1 mL de alimento de controle azul para o outro lado dos pratos(Figura 1A). Repita este processo com o par azul vermelho/experimental de controle. NOTA: Certifique-se de que todos os pratos estão totalmente definidos antes de iniciar o experimento. Use os pratos dentro de 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Iniciando o ensaio de alimentação bidirem
<ol><li>Paralise temporariamente as linhas de moscas experimentais no gelo até que não sejam observadas atividades motoras óbvias, como voar e escalar. Uma vez que as moscas são imobilizadas, inverta suavemente o frasco, e toque para transferir todas as moscas para a câmara de ensaio. NOTA: O choque frio leva ~3-5 min. A exposição prolongada ao frio pode afetar a fisiologia e a saúde da mosca e, portanto, deve ser evitada.</li>
	<li>Coloque rapidamente a tampa na câmara e reserve-a. Uma vez que todas as moscas tenham sido transferidas, mova todas as câmaras para um espaço escuro e fechado. Deixe o ensaio funcionar por 90 minutos. NOTA: Um ambiente escuro minimiza a influência da via visual da mosca no comportamento alimentar e remove quaisquer pistas ambientais de fora do prato.</li>
</ol>6. Terminando o ensaio de alimentação bidirem
<ol><li>Depois de 90 min terem transcorrido, transfira as câmaras para um congelador de -20 °C para sacrificar as moscas. Depois de ~1 h, conte as moscas. NOTA: Inverta cada placa de Petri antes de colocar a placa no congelador para garantir que nenhuma mosca será congelada na comida.</li>
</ol>7. Atribuir um índice de preferência (PI) para determinar a preferência alimentar
<ol><li>Sob um microscópio de dissecção padrão, examine a cor abdominal das moscas em cada prato individual. Conte as moscas como vermelho, azul ou roxo de acordo com a cor de seu abdômen(Figura 2A). Conte a mosca se seu abdômen tiver mais de 50% de cor, indicando alimentação robusta(Figura 2B). Exclua a mosca se seu abdômen contiver apenas um pequeno ponto de alimentação, indicando má alimentação(Figura 2C).</li>
	<li>Depois que o número de moscas comendo azul, vermelho ou alimentos azuis e vermelhos tiver sido contado, use a seguinte equação para atribuir a cada placa de Petri um índice de preferência (PI):</li>
</ol>PI = (Número de moscas que comem alimentos experimentais) - (Número de moscas que comem alimentos de controle) / (Número de moscas que comem alimentos experimentais) + (Número de moscas que comem alimentos de controle) + (Número de moscas comendo ambas)
Pi > 0 indica preferência pelo composto experimental, PI < 0 indica uma aversão ao composto experimental, e PI = 0 não indica nenhum efeito do composto no comportamento alimentar.
8. Limpeza das câmaras de ensaio
<ol><li>Limpe prontamente as placas de Petri raspando o substrato alimentar e enxaguando-as com água e sabão sem perfumado. Mergulhe as placas de Petri durante a noite em água destilada. Verifique se a vedação divisória em cada prato ainda é impermeável, em seguida, deixe o prato secar. NOTA: Depois de garantir que não haja manchas residuais ou de corante, as placas de Petri estão prontas para serem usada novamente.</li>
</ol>

<ol><li>Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+the+responses+to+sucrose%2C+glucose%2C+and+maltose+identified+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).</li>
<li>Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gr+receptor+is+required+for+response+to+the+sugar+trehalose+in+taste+neurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).</li>
<li>Ueno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+sensitivity+in+Drosophila+correlates+with+mutations+in+and+expression+of+the+gustatory+receptor+gene+Gr5a%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a.</a> Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).</li>
<li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sugar+receptors+in+sweet+taste+perception%2C+olfaction%2C+and+internal+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing.</a> Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+representations+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Taste representations in the Drosophila brain.</a> Cell. 117 (7), 981-991 (2004).</li>
<li>Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+perception+and+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Taste perception and coding in Drosophila.</a> Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).</li>
<li>Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sugar receptors in Drosophila.</a> Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).</li>
<li>Dus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+sensor+in+the+brain+directs+the+action+of+the+brain-gut+axis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila.</a> Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).</li>
<li>Toshima, N., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+preference+for+amino+acids+is+dependent+on+internal+nutritional+state+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).</li>
<li>Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids%2C+taste+circuits%2C+and+feeding+behavior+in+Drosophila%3A+towards+understanding+the+psychology+of+feeding+in+flies+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man.</a> Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).</li>
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<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+processing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Gustatory processing in Drosophila melanogaster.</a> Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).</li>
<li>Freeman, E. G., Dahanukar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neurobiology+of+Drosophila+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular neurobiology of Drosophila taste.</a> Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).</li>
<li>Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+sensitivity+to+trehalose+and+its+alteration+by+gene+dosage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).</li>
<li>Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+experience-induced+taste+desensitization+modulated+by+the+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).</li>
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<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193(2007).</li>
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<li>Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIC%3A+high-throughput%2C+continuous+analysis+of+feeding+behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila.</a> PLoS One. 9 (6), 101107(2014).</li>
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<li>Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+quantitative+food-intake+assays+and+forcibly+activating+neurons+to+study+appetite+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900(2018).</li>
<li>Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+essential+for+aversive+taste+and+inhibiting+male-to-male+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship.</a> Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+food+texture+sensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The basis of food texture sensation in Drosophila.</a> Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).</li>
<li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nature Communications. 5, 4560(2014).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Molecular Brain. 8, 87(2015).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse ou interesses financeiros concorrentes.

Este método envolve várias etapas cruciais onde problemas podem ocorrer. Primeiro, certifique-se de que as moscas ingeram uma quantidade suficiente de alimentos para fornecer dados estáveis. Se as moscas comem mal, certifique-se de que as moscas estão com fome há pelo menos 24 horas, e que a mídia experimental contém pelo menos uma concentração mínima de sacarose (2 mM). Para estimular ainda mais o consumo alimentar, prolongar o período de fome úmida para além das 24 horas, dependendo da condição fisiológica das moscas. ...

Apesar das diferenças dramáticas na estrutura anatômica dos órgãos de paladar entre moscas e mamíferos, as respostas comportamentais das moscas a muitas substâncias tastant são surpreendentemente semelhantes às dos mamíferos. Por exemplo, as moscas preferem açúcar1,2,3,4,5,6,7,8, aminoácidos9,10, e baixo sal11, que indicam nutrientes, mas rejeitam alimentos amargos12,13,14,15 que são inpalatáveis ou tóxicos. Nas últimas duas décadas, as moscas provaram ser um organismo modelo altamente valioso para avançar na compreensão de muitas questões fundamentais relacionadas à sensação do sabor e ao consumo alimentar, incluindo detecção de sabor, transdução de sabor, plasticidade do sabor e regulação alimentar16,17,18,19,20. Notavelmente, uma série de estudos têm demonstrado que os mecanismos de transdução de sabor e circuito neural subjacentes à percepção do sabor são análogos entre moscas frutíferas e mamíferos. Portanto, a mosca-das-frutas serve como um organismo experimental ideal, permitindo que os pesquisadores descubram conceitos e princípios evolutivamente conservados que regem a detecção e o consumo de alimentos no reino animal.
Para investigar a sensação de sabor em moscas, é fundamental estabelecer um ensaio rápido e rigoroso para medir objetivamente a preferência alimentar. Ao longo dos anos, vários métodos de alimentação, tais como ensaios à base de corante11,12,13,21,22,23, o ensaio de resposta de extensão proboscis mosca24, o alimentador capilar (CAFE) ensaio25,26, o ensaio Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)eoutros métodos combinatórios foram desenvolvidos para medir quantitativamente a preferência alimentar e/ou a ingestão alimentar de moscas de frutas28,29,30,31. Um dos paradigmas populares de alimentação é o ensaio de alimentação de duas opções baseado em corante usando uma placa de microtiter multiwell12,21,32 ou, como descrito aqui, uma pequena placa de Petri11,22 como a câmara de alimentação. Este ensaio é projetado com base na transparência do abdômen da mosca. Durante este ensaio, as moscas são colocadas na câmara de alimentação e apresentadas com duas opções de alimentos misturadas com corante vermelho ou corante azul. Uma vez que o ensaio esteja completo, os abdômens de mosca aparecem vermelhos ou azuis, dependendo de qual alimento eles consumiram.
Tanto a placa de Petri quanto os ensaios de alimentação à base de corante de placas multiwell são altamente robustos e produzem aproximadamente os mesmos resultados. Utilizando esses dois ensaios, inúmeras descobertas importantes e avanços foram feitos para decifrar os receptores e células altamente diversificados responsáveis por detectar os gostos alimentares e a textura dos alimentos11,12,21,22,32,33. No ensaio baseado em corante, um passo experimental que requer tempo e esforço considerável é preparar e carregar alimentos na câmara de alimentação. Para reduzir o tempo de preparação e carregamento dos alimentos, este ensaio foi modificado substituindo a placa de microtiter multiwell por uma pequena placa de Petri, que é dividida em dois compartimentos iguais. No ensaio à base de placa de Petri, dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho são adicionados às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O abdômen de cada mosca é então examinado, e o índice de preferência (PI) é calculado.
Este ensaio de alimentação de duas opções baseado em placa de Petri é acessível, simples e rápido. Uma placa multiwell requer aproximadamente 110 s para encher, enquanto cada placa de Petri leva apenas ~20 s. Além disso, a placa multiwell requer a tubulação de pequenos volumes de alimentos em um grande número de pequenos poços (por exemplo, 60 ou mais poços por placa), o que exige considerável precisão e atenção. Por outro lado, o ensaio baseado em placa de Petri requer apenas duas ações por placa. Como o ensaio de alimentação pode envolver um grande número de réplicas, o ensaio baseado em placa de Petri economiza uma quantidade não trivial de tempo e esforço. Este ensaio dá resultados equivalentes aos do ensaio baseado em multiwell e tem se mostrado bem sucedido em abordar muitas questões fundamentais na sensação do sabor, incluindo a codificação do sabor salgado11,a plasticidade do sabor modificada pela experiência alimentar22, e a base molecular da sensação da textura dos alimentos33. Em resumo, este ensaio de duas opções baseado em placa de Petri é uma ferramenta poderosa para investigar como as moscas percebem o meio de nutrientes externos e internos para obter o comportamento alimentar adequado.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756P56</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9884114</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Amscope</td><td>SM-2T-6WB-V331</td><td></td></tr><tr><td>FCF Brilliant Blue</td><td>Wako Chemical</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Fly CO2 configuração de anestesia</td><td>Genesee Scientfic</td><td>59-114/54-104M</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de moscas com ciclo dia/noite programável</td><td>Powers Scientific Inc.</td><td>IS33SD</td><td></td></tr><tr>Linhas <td></td><td></td><td></td><td>para moscas</td></tr><tr><td>Prato de vidro (seguro para micro-ondas)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de armazenamento de mídia</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-192-9998</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de plástico cortado para caber no prato de uma folha não mais espessa que 5 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de plástico para moscas</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sulforrodamina B</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9012</td><td></td></tr><tr><td>Composto de Tastant de interesse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1000</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD05</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio rápido de preferência alimentar em drosophila

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

Para selecionar alimentos com valor nutricional, evitando o consumo de agentes nocivos, os animais precisam de um sistema de paladar sofisticado e robusto para avaliar seu ambiente alimentar. A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster,é um organismo modelo geneticamente tratável que é amplamente utilizado para decifrar os fundamentos moleculares, celulares e neurais da preferência alimentar. Para analisar a preferência alimentar da mosca, é necessário um método de alimentação robusto. Descrito aqui é um ensaio de alimentação de duas opções, que é rigoroso, econômico e rápido. O ensaio é à base de placas de Petri e envolve a adição de dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O exame do abdômen de cada mosca é seguido pelo cálculo do índice de preferência. Em contraste com placas multiwell, cada placa de Petri leva apenas ~20 s para encher e economiza tempo e esforço. Este ensaio alimentar pode ser empregado para determinar rapidamente se as moscas gostam ou não de um determinado alimento.

Neste ensaio, um prato de 35 mm foi dividido em dois compartimentos de alimentação iguais, com cada metade do prato contendo alimentos agarose, juntamente com corante azul ou vermelho(Figura 1A). Para excluir o viés de corante, as concentrações de corante azul e vermelho foram cuidadosamente refinadas para produzir um PI "0" aproximado quando apenas esses dois corantes foram adicionados(Figura 1B). Uma vez que a placa de Petri estava carregada com alimentos test...

Apresentamos um protocolo para um ensaio de alimentação de duas opções para moscas. Este ensaio de alimentação é rápido e fácil de executar e é adequado não apenas para pesquisas de laboratório de pequena escala, mas também para telas comportamentais de alto rendimento em moscas.

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Nosso protocolo foi projetado para realizar um bom ensaio para a mosca-das-frutas, que é um poderoso organismo modelo que permite projetar para todos os genes, receptores, neurônios e uma cabeça neuro-psicológica que estão envolvidas na sensação do teste e no consumo alimentar. Como os humanos voam como comida que tem gosto: doce, levemente salgado, levemente azedo ou rejeitar alimentos que tem gosto amargo, muito salgado ou muito azedo. O poder desta técnica vem da velocidade e conveniência.Você pode testar muitas moscas diferentes em um curto espaço de tempo PRH sem uma configuração complexa. Nosso método é um excelente e excelente ensaio para entender se moscas como a, assim como um determinado alimento, bem como como certos produtos genéticos influenciam a preferência pelo sabor. Estabelecer se os animais aceitam ou rejeitam certos alimentos pode ser um desafio.Por isso, é importante estabelecer um protocolo padrão para testar a preferência do gosto animal. Para preparar frascos de fome para o ensaio, compacte vagamente um pedaço de tecido na parte inferior de cada frasco de plástico vazio por tipo de gene de mosca a ser testado. De tal forma que o papel preenche este espaço sem formar uma massa densa, em cerca de três mililitros de água pura em cada frasco para saturar completamente os tecidos sem água parada.Tomando cuidado para que não haja grandes gotículas de água em excesso nas paredes dos frascos. Alternativamente, cinco mililitros de 1%Agros sem sacarose podem ser substituídos pelo papel encharcado, 24 horas antes do experimento dióxido de carbono anestesiar moscas de dois a quatro dias de idade e classificar as moscas em grupos de aproximadamente 70. Em seguida, adicione cada grupo de moscas a uma vil fome e rotule cada frasco com o genótipo e tempo de iniciação da fome.Antes de realizar um experimento, prepare uma série de diluições para cada corante usando o mesmo alimento com cada corante diferente. Combinado 0,5 gramas de Agros com 50 mililitros de água pura em um vaso seguro de micro-ondas e aquecer a solução Agro até que tenha dissolvido a agitação conforme necessário. Dissolva cada componente alimentar, incluindo sacarose e quaisquer compostos experimentais na água a uma concentração de 100 vezes ou maior da concentração final testada.E misture o corante Agro e o composto experimental desejado em tubos cônicos de centrífugas de polipropileno. Depois de misturar coloque os tubos no banho de água de 60 graus Celsius até a distribuição e adicione um mililitro de uma cor das soluções experimentais de alimentos e corantes para um lado do primeiro prato de ensaio. Deixe o Agros esfriar até firmar antes de adicionar um mililitro da solução de alimentos de controle, rotulado com a segunda cor de corante para o outro lado do prato.Em seguida, repita a preparação do prato de ensaio, com o controle oposto e o par de solução de corante experimental. Use os resultados para identificar duas concentrações de corante que produzem um índice de preferência de zero. Quando nenhum composto experimental é adicionado.Para realizar um ensaio de alimentação bidirem. Primeiro temporariamente paralisado uma mosca experimental vil por três a cinco minutos no gelo até que nenhuma atividade motora óbvia, como voar e escalar são observadas. Uma vez que as moscas tenham sido imobilizadas, inverta suavemente o frasco e toque para transferir as moscas para a câmara de ensaio, em seguida, rapidamente colocou a tampa sobre a câmara.Quando todos os grupos foram transferidos, mova todas as câmaras de ensaio para um espaço escuro e fechado por 90 minutos. No final do ensaio inverta as câmaras a menos 20 graus Celsius congelador, por cerca de uma hora. Antes de colocar cada câmara sob um microscópio estéreo para examinar a cor abdominal das moscas em cada grupo experimental.Conte uma mosca, se o abdômen tiver mais de 50% de cor indicando uma alimentação robusta, descarte qualquer mosca em que o abdômen contenha apenas uma pequena mancha alimentar, o que é indicativo de má alimentação. Quando todas as moscas forem contadas use a equação para quantificar o índice de preferência alimentar de cada grupo. Neste ensaio, um prato de 35 milímetros foi dividido em duas semanas vamos alimentar em compartimentos contendo a comida do Agro, juntamente com corante vermelho ou azul.Para excluir o viés de corante, as concentrações de corante azul e vermelho foram cuidadosamente refinadas para produzir uma preferência zero aproximada quando apenas esses dois corantes foram adicionados, 90 minutos depois que moscas adultas molhadas carregando cores abdominais bly apareceram como azul ou vermelho. Se o animal consumia predominantemente alimentos azuis ou vermelhos, respectivamente, se uma mosca consumisse azul e vermelho, o abdômen parecia roxo. Apenas moscas que ingeriram uma quantidade considerável de alimentos foram pontuadas, enquanto moscas com ingestão alimentar insuficiente não foram contabilizadas.Comparando este ensaio baseado em placa de Petri com o ensaio baseado em placas multi-bem revelou que os dois métodos de alimentação deram essencialmente o mesmo que dizer os resultados de alimentação em resposta a alimentos doces, amargos e salgados em moscas do tipo selvagem. Notavelmente, no entanto, é muito mais rápido preparar e distribuir alimentos em uma placa de Petri do que em um prato de 60 bems. Certifique-se de identificar qual concentração de corante usar especialmente depois de fazer um novo lote de dieta.Esta concentração pode ser diferente entre linhas de mosca. Nosso par hoje é baseado em ensaio de duas escolhas é muito poderoso também. Para você perguntar como as moscas, sinta tanto o quadro interno-externo danificado à alimentação e comportamento adequados ao estado real.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve um ensaio de alimentação para moscas-das-frutas no qual alimentos coloridos são usados para monitorar a alimentação e o efeito que os compostos adicionados podem ter na atividade alimentar. O protocolo de exemplo testa os efeitos de vários produtos químicos desreguladores endócrinos (EDC).

Teste de alimentação: avaliação das preferências alimentares em Drosophila melanogaster

Este vídeo descreve o ensaio de preferência de sabor, um método comportamental usado para medir a atração ou evitação por soluções coloridas com sabor diferente, avaliando a coloração abdominal da mosca após a ingestão da substância preferida. O protocolo apresentado demonstra o procedimento usado para medir a preferência das moscas por soluções de concentrações variadas de sacarose.

Ensaio de Preferência de Sabor: Um Método para Medir o Comportamento Alimentar em Drosophila

Este vídeo descreve o ensaio CApillary FEeder, ou CAFE, um método comportamental que mede a ingestão de alimentos e a preferência de moscas-das-frutas desenfreadas. O protocolo apresentado mostra como realizar o ensaio com evaporação mínima dos capilares cheios de líquido usados para fornecer o alimento e rastrear sua ingestão.

O ensaio CApillary FEeder (CAFE): um método para rastrear o consumo e a preferência alimentar em Drosophila

As fêmeas de Drosophila escolhem entre substratos e selecionam locais atraentes para a postura de ovos. Este vídeo descreve um ensaio comportamental que testa sua tomada de decisão, chamado de ensaio de preferência de postura de ovos. O clipe em destaque demonstra o procedimento com uma configuração personalizada, que permite aos pesquisadores não apenas testar o comportamento de muitas fêmeas ao mesmo tempo, mas também é compatível com gravação de vídeo e configurações optogenéticas.

drosófila Ensaio de preferência de postura de ovos: um método para testar a tomada de decisão em moscas

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.

Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo descreve um ensaio de alto rendimento para testar as preferências de postura de ovos de Drosophila melanogaster em resolução de um único animal.  Este ensaio fornece uma plataforma simples, eficiente e escalável para identificar genes e componentes de circuitos que controlam um processo simples de tomada de decisão.

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O paladar é um processo sensorial importante que facilita a atração por substâncias benéficas e evita substâncias tóxicas.  Este protocolo descreve um ensaio de ingestão simples para determinar a preferência gustativa de Drosophila por um determinado composto químico.

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Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

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Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

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