Name: Resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica determinada pela análise do loop de pressão-volume (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a analisar a função cardíaca intrínseca e a reserva beta-adrenérgica em camundongos usando o método de loop de pressão-volume com isoproterenol. Esta técnica de tórax aberto permite medições precisas da contratilidade cardíaca in vivo.

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Somos gratos a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter e à equipe da Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) da Universidade de Heidelberg para assistência técnica especializada.
Este trabalho foi apoiado pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular), pelo BMBF (Ministério alemão da Educação e Pesquisa), por um estado federal de Baden-Württemberg, a Inovação e o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 e o Centro de Pesquisa Colaborativa (SFB) 1118.

Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Conselho Regional de Karlsruhe e da Universidade de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção dos animais utilizados para fins científicos. Os dados mostrados neste protocolo são derivados de camundongos machos do tipo selvagem C57Bl6/N (17 ± 1,4 semanas de idade). Os camundongos foram mantidos sob condições especificadas de livre de patógenos na instalação animal (IBF) da Faculdade de Medicina de Heidelberg. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com umidade relativa entre 56-60%, uma mudança de ar 15 vezes por hora e temperatura ambiente de 22°C +/- 2°C. Foram mantidos em gaiolas convencionais tipo II ou tipo II há muito tempo fornecidos com cama animal e papéis de tecido como enriquecimento. Alimentos autoclavados padrão e água autoclavada estavam disponíveis para consumir ad libitum.
1. Elaboração de instrumentos e soluções de medicamentos
<ol><li>Cateter venoso central: Corte o micro tubo (diâmetro externo de 0,6 mm) em tubos de cateter de ~20 cm de comprimento. Use fórceps para puxar uma extremidade do tubo na ponta de uma cânula de calibre 23. Corte a outra extremidade do tubo na diagonal para criar uma ponta afiada que possa perfurar a veia femoral.</li>
	<li>Tubo endotraqueal: Para um tubo de intubação corte uma ubula venipuncture de 20 mm de comprimento para remover o acessório da seringa.<ol>
<li>Se o tubo de intubação não se encaixar perfeitamente na conexão do ventilador, enrole o parafilme sobre a extremidade do tubo onde o dispositivo de ventilação está conectado. A conexão deve ser estável e selada pelo espessamento(Figura 1A). Encurte o pino guia metálico da cânula venipunctura de 20 bitolas para 2,7 cm e use-o como um auxílio de intubação. Abordagens refinadas para intubação, incluindo fibras leves para facilitar a visualização da traqueia também são bem descritas, por exemplo, por Das e colaboradores16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mistura anestésica utilizada para intubação: Misture 200 μL de heparina (1000 UI/mL) com 50 μL de 0,9% NaCl e 750 μL de 2 mg/mL etomidato de um produto à base de emulsão óleo-na-água. Use 7 μL/g de peso corporal (BW) para cada rato (0,1 mg/kg BW Buprenorphine 10 mg/kg BW etomidate).</li>
	<li>Relaxante muscular: Dissolva 100 mg de brometo de pancurônio em 100 mL de 0,9% NaCl. Use 1,0 μL/g de peso corporal (1 mg/kg BW) para cada rato.</li>
	<li>Soluções de isoproterenol: Dissolver 100 mg de isoproterenol em 100 mL de 0,9% NaCl (1 μg/μL). Prepare as seguintes diluições(Tabela 1) e transfira cada uma em uma seringa de 1 mL.<ol>
<li>Para obter diluição 1, diluir o estoque em 1:1.8. Para obter diluição 2, diluir o estoque em 1:6. Para obter diluição 3, diluir a diluição 1 em 1:10. Por fim, obtenha diluição 4 por uma diluição de 1:10 de diluição 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15% Hypertnic NaCl (c/v): Dissolver 1,5 g de 0,9% NaCl em 10 mL de H2O. Filtrar a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.</li>
	<li>Preparação de 12,5% de solução albumina (c/v): Dissolver 1,25 g de albumina de soro bovino em 10 mL de 0,9% NaCl. Incubar a solução a 37 °C por 30 min. Esfrie até a temperatura ambiente e filtre a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.</li>
	<li>Preparação da configuração: Ligue primeiro a placa de aquecimento e coloque-a em 39-40 °C. Coloque uma seringa cheia de soro fisiológico na almofada de aquecimento e transfira o cateter de loop de volume de pressão (PVL) para dentro da seringa. Pré-incubar o cateter por pelo menos 30 minutos antes de ser usado para estabilização. A configuração que usamos consiste em um cateter de condução de pressão 1.4 F, uma unidade de controle e o software correspondente, e é descrito graficamente na Figura 1B e as referências do provedor estão listadas na Tabela de Materiais.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Injete buprenorfina (0,1 mg/kg BW intraperitoneally) 30 min antes da intubação.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma câmara de vidro acrílico pré-saturada com isoflurane de 2,5% e pré-aquecida com uma almofada de aquecimento colocada na base da câmara.</li>
	<li>Assim que o camundongo dormir (falta de reflexo), injete a mistura anestésica (7 mL/kg BW) contendo etomidato de 10 mg/kg etomidato e heparina (1.200 UI/kg BW) intraperitoneally.</li>
</ol>3. Ventilação
<ol><li>Transfira o animal para a plataforma de intubação (Figura 1C) 3-4 minutos após a injeção anestésico. O rato fica pendurado nos dentes com a visão dorsal voltada para o operador.</li>
	<li>Levante suavemente a língua com fórceps. Para identificar os glottis, levante ligeiramente a mandíbula inferior do rato com o segundo fórceps.</li>
	<li>Insira cuidadosamente o tubo endotraqueal(Figura 1A) na traqueia e remova a haste guia.</li>
	<li>Transfira o animal para a placa de aquecimento, coloque-o na parte de trás e conecte o tubo de intubação ao pequeno respirador animal.</li>
	<li>Ajuste a taxa respiratória para 53,5 x (peso corporal em gramas)-0,26 [min-1],como descrito por outros12, e volumes de maré para pico de pressões inspiratórias de 11 ± 1 cmH2O. Estabeleça um PEEP de 2 cmH2O.</li>
	<li>Fixar cuidadosamente as extremidades do mouse na placa de aquecimento com tiras adesivas e aplique pomada nos dois olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Insira uma sonda de temperatura reta e mantenha a temperatura do núcleo do núcleo a 37 ± 0,2 °C.</li>
	<li>Instale um ECG de 1 chumbo e monitore a frequência cardíaca on-line como um indicador para profundidade e estabilidade da anestesia.</li>
	<li>Após a ausência de reflexos interdigiais, injete 1 mg/kg BW do músculo relaxante pancurônio-brometo intraperitoneally. Isso previne artefatos respiratórios durante as medições de PVL.</li>
</ol>4. Cirurgia
<ol><li>Recomendações gerais<ol>
<li>Durante a cirurgia, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com O2. A concentração de isoflurane também pode depender de variáveis como cepa de camundongos, sexo, idade e peso dos animais, mas precisa ser individual e experimentalmente determinada e os valores aqui são referência para a cepa de camundongos C57BL6/N. É importante ressaltar que o ventilador está conectado a um sistema de extração para evitar que o operador inale isoflurane.</li>
		<li>Use uma ampliação entre 1,5-4x do microscópio estéreo para procedimentos cirúrgicos. NOTA: Consulte orientações institucionais/locais sobre a preparação do animal para cirurgias de não sobrevivência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cannulação femoral<ol>
<li>Enxágüe a linha traseira com 70% de etanol, incisee a região inguinal esquerda e exponha a veia femoral esquerda.</li>
		<li>Exploda a artéria epigástrica e a veia com um cautery.</li>
		<li>Ligate a veia femoral com uma sutura colocada distal ao acesso ao cateter.</li>
		<li>Passe uma sutura sob a veia femoral e prepare um nó craniano de perfuração. Puna a veia femoral com o micro tubo preparado (ver passo 1.1) preso a uma seringa de 1 mL.</li>
		<li>Amarre o nó para consertar o tubo dentro do vaso.</li>
		<li>Contra-ação perda de fluido pela infusão de 0,9% NaCl complementada com 12,5% de albumina a uma taxa de infusão de 15 μL/min com uma bomba de seringa automática. Além disso, mantenha o tecido exposto úmido usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toracotomia<ol>
<li>Enxágüe o tórax com 70% de etanol.</li>
		<li>Incisar a pele logo abaixo do processo xifoide e separar sem rodeios os músculos peitorais da parede do peito com fórceps ou um cautery.</li>
		<li>Levante o processo xifoide com fórceps e, em seguida, corte através da parede do peito movendo-se lateralmente em ambos os lados com um cauterismo até que o diafragma seja totalmente visível por baixo.</li>
		<li>Incisar o diafragma por baixo e expor o ápice cardíaco. Em seguida, remova cuidadosamente o pericárdio com fórceps.</li>
		<li>Realize uma costotomia limitada no lado esquerdo como descrito anteriormente6.</li>
		<li>Passe uma sutura sob a veia caval inferior para realizar a redução da pré-carga durante os estágios posteriores.</li>
		<li>Puna suavemente o ápice cardíaco com uma cânula de 25 mm (máximo de 4 mm). Remova a cânula e insira o cateter FOTOVOLTAICO até que todos os eletrodos estejam dentro do ventrículo.</li>
		<li>Ajuste a posição do cateter por movimentos suaves e giros até que sejam obtidas alças em forma retangular(Figura 2A).</li>
		<li>Mantenha sempre todos os tecidos expostos úmidos usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Medições
<ol><li>Recomendações gerais<ol>
<li>Durante as medições, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com 100% O2.
</li>
		<li>Realize 2 medidas de linha de base, bem como 2 oclusãos de vena cava em cada etapa do protocolo de resposta à dose. NOTA: É importante que após a primeira e segunda oclusão vena cava, tanto os valores de pressão quanto de volume retornem aos valores de estado estável como antes da primeira oclusão. Esta observação é necessária para reconhecer uma mudança na posição do cateter devido a reduções seriais no volume intraventricular. Se uma mudança na posição do cateter fosse o caso, especialmente os valores de volume seriam deslocados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize uma análise on-line dos parâmetros (frequência cardíaca, volume de derrame, dP/dtmax) e espere até obter a função cardíaca de estado estável. Para a faixa de parâmetros esperada com a configuração aqui utilizada em camundongos C57Bl6/N, consulte os resultados publicados6.</li>
	<li>Pare o respirador na posição expiratória final e regise parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior com fórceps, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2B). Ligue o ventilador. Espere pelo menos 30 segundos para a segunda oclusão até que os parâmetros hemodinâmicos sejam estabilizados.</li>
	<li>Após a obtenção das medidas em condições basais proceder à dose-resposta de isoproterenol, mudando para as seringas preparadas. Aqui a taxa de infusão permanece inalterada para evitar modificações da pré-carga cardíaca. Tome cuidado para não infundir bolhas de ar ao trocar a seringa.<ol>
<li>Espere pelo menos 2 minutos até que uma nova função cardíaca de estado estável seja obtida do que parar novamente o respirador na posição expiratória final e registrar parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga.</li>
		<li>Espere pelo menos 30 segundos pela segunda oclusão. Depois mudando para a seringa preparada com a próxima concentração isoproterenol e repetir as gravações dos parâmetros independentes de linha de base e pré-carga. NOTA: Artefatos como o pico de pressão sistólica final (ESPS, Figura 2C) podem ocorrer durante o aumento da dosagem de isoproterenol, que resulta da armadilha do cateter. Artefatos que ocorrem antes do início dos parâmetros basais podem ser facilmente corrigidos através do ree posicionado do cateter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Calibração
NOTA: Os procedimentos de calibração podem variar dependendo do sistema PVL utilizado.
<ol><li>Calibração de condução paralela<ol>
<li>Conecte uma seringa contendo uma solução naCl de 15% à cânula femoral após a última medição da dose-resposta isoproterenol. Infundir cuidadosamente 5 μL da solução hipertônica restante no tubo até que pvl mude ligeiramente para a direita durante a visualização on-line. Então espere até que os laços voltem ao estado estável.</li>
		<li>Pare o respirador no final da expiração e injete um bolus de 10 μL de 15% de NaCl dentro de 2 a 3 segundos. Verifique se o PVL se expande em grande parte e será deslocado para a direita durante a visualização on-line.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibração conduance-volume<ol>
<li>Espere 5 min, nada menos, para que o bolus salino hipertônico seja completamente diluído. Depois remova o cateter e retire pelo menos 600 μL de sangue do ventrículo esquerdo do coração pulsante usando uma seringa de 1 mL e uma cânula de 21 calibres. Neste momento, o animal é eutanizado sob anestesia profunda e analgesia por hemorragia maciça, parando a ventilação e remoção do coração.</li>
		<li>Transfira o sangue para o cuvette de calibração pré-aquecido (em banho-maria a 37 °C) com cilindros de volume conhecido. Coloque o cateter PV centralizado em cada cilindro e regisse a condução. Ao calcular uma curva padrão para cada animal, as unidades de condução podem ser convertidas em valores absolutos de volume.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análise
<ol><li>Após medições bem sucedidas de PVL em condições basais e estimulação isoproterenol, visualize, digitalize, calcule e extraia parâmetros caracterizando função cardíaca (como PRSW, dP/dt, pressão e volume diastólico final, pressão e volume sistólica final, tensão e volume de relaxamento constantes, entre outros) utilizando um software de análise PVL apropriado. Análises estatísticas adicionais e representações gráficas podem ser realizadas com software de análise padrão.</li>
	<li>Análise de parâmetros independentes de pré-carga NOTA: Para esta etapa é crucial padronizar o procedimento.<ol>
<li>Selecione os primeiros 5-6 PVLs mostrando a diminuição da pré-carga em todas as medições para a análise de parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2D). Um número constante de PVLs selecionados para análise durante a redução da pré-carga diminuirá a variabilidade entre as medições dos parâmetros obtidos.</li>
		<li>Calcule o valor médio das duas medidas em cada etapa do protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nielsen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+volume+measurement+in+mice+by+conductance+catheter%3A+evaluation+and+optimization+of+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration.</a> The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).</li>
<li>Townsend, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pressure+Volume+Loops+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53810(2016).</li>
<li>Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genetic+background+on+ex+vivo+and+in+vivo+cardiac+function+in+several+commonly+used+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).</li>
<li>Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+tolerance+and+left+ventricular+pressure-volume+relationships+in+frequently+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312(2011).</li>
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<li>Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+stenosis+in+old+hypercholesterolemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice.</a> Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses deve ser declarado.

Aqui, fornecemos um protocolo para analisar a função cardíaca in vivo em camundongos sob crescente estimulação β-adrenérgica. O procedimento pode ser usado para abordar ambos os parâmetros de linha de base da função cardíaca e a reserva adrenérgica (por exemplo, inotropia e cronotropia) em camundongos geneticamente modificados ou após intervenções. A vantagem mais proeminente das medidas de ciclo de volume de pressão (PVL) em comparação com outros meios de determinação da função cardíaca é a análise da função cardíaca in...

Doenças cardiovasculares normalmente afetam a função cardíaca. Esta questão aponta a importância na avaliação da função cardíaca in vivo detalhada em modelos de doenças animais. A experimentação animal é cercada por um quadro dos três princípios orientadores de Rs (3Rs) (Reduzir/Refinar/Substituir). No caso de compreender patologias complexas envolvendo respostas sistêmicas (ou seja, doenças cardiovasculares) no nível de desenvolvimento atual, a principal opção é refinar os métodos disponíveis. O refino também levará a uma redução do número de animais necessários devido à menor variabilidade, o que melhora o poder da análise e das conclusões. Além disso, a combinação de medidas de contratilidade cardíaca com modelos animais de doença cardíaca, incluindo aqueles induzidos por estimulação neurohumoral ou por sobrecarga de pressão como banda aórtica, que imita, por exemplo, os níveis alterados de catecolamina/β-adrenérgico1,2,3,4, fornece um método poderoso para estudos pré-clínicos. Tendo em conta que o método baseado em cateter permanece a abordagem mais utilizada para uma avaliação aprofundada da contratilidade cardíaca5,pretendemos apresentar aqui uma medição refinada da função cardíaca in vivo em camundongos por medições de loop de volume de pressão (PVL) durante β-adrenérgico com base na experiência anterior, incluindo a avaliação de parâmetros específicos desta abordagem6, 7.
Para determinar parâmetros hemodinâmicos cardíacos, estão disponíveis abordagens que incluem imagens ou técnicas baseadas em cateter. Ambas as opções são acompanhadas de vantagens e desvantagens que precisam ser cuidadosamente consideradas para a respectiva questão científica. As abordagens de imagem incluem ecocardiografia e ressonância magnética (RM); ambos foram usados com sucesso em camundongos. As medições ecocardiográficas envolvem altos custos iniciais de uma sonda de alta velocidade necessária para a alta frequência cardíaca dos camundongos; é uma abordagem não invasiva relativamente simples, mas é variável entre os operadores que, idealmente, devem ser experimentados reconhecendo e visualizando estruturas cardíacas. Além disso, nenhuma medição de pressão pode ser realizada diretamente e os cálculos são obtidos a partir da combinação de magnitudes de tamanho e medições de fluxo. Por outro lado, tem a vantagem de que várias medidas podem ser realizadas na mesma função animal e cardíaca podem ser monitoradas, por exemplo, durante a progressão da doença. Quanto à medição do volume, a ressonância magnética é o procedimento padrão-ouro, mas semelhante à ecocardiografia, não são possíveis medidas diretas de pressão e apenas parâmetros dependentes de pré-carga podem ser obtidos8. Fatores limitantes também são a disponibilidade, o esforço de análise e os custos operacionais. Aqui, os métodos baseados em cateter para medir a função cardíaca são uma boa alternativa que, adicionalmente, permitem o monitoramento direto da pressão intracardica e a determinação de parâmetros de contratilidade independentes da carga, como o trabalho de acidente vascular cerebral pré-carga (PRSW)9. No entanto, os volumes ventriculares medidos por um cateter de condução de pressão (por determinação de condutividade) são menores do que os da ressonância magnética, mas as diferenças de grupo são mantidas na mesma faixa10. Para determinar valores de volume confiáveis é necessária a calibração correspondente, que é um passo crítico durante as medições pvl. Combina medições ex vivo de condutividade sanguínea em cuvetas calibradas em volume (conversão de condutância em volume) com a análise in vivo para a condutância paralela do miocárdio durante a injeção de bolus da solução salina hipertônica11,12. Além disso, o posicionamento do cateter dentro do ventrículo e a orientação correta dos eletrodos ao longo do eixo longitudinal do ventrículo são fundamentais para a capacidade de detecção do campo elétrico circundante produzido por eles. Ainda com o tamanho reduzido do coração do rato é possível evitar artefatos produzidos por alterações na orientação intraventricular do cateter, mesmo em ventrículos dilatados5,10, mas artefatos podem evoluir sob β-adrenergic stimulation6,13. Além dos métodos de condutância, o desenvolvimento do método baseado em admissão apareceu para evitar as etapas de calibração, mas aqui os valores de volume são bastante superestimados14,15.
Como o camundongo é um dos modelos pré-clínicos mais importantes em pesquisa cardiovascular e a reserva β-a reserva adrenérgica do coração é de interesse central em fisiologia cardíaca e patologia, apresentamos aqui um protocolo refinado para determinar a função cardíaca in vivo em camundongos por medições de PVL durante β-adrenergic estimulação.

<table><tbody><tr><td>cateter 1.4F SPR-839</td><td>Millar Instruments, EUA</td><td>840-8111</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 ml</td><td>Beckton Dickinson, EUA</td><td>REF303172</td><td></td></tr><tr><td>Bio Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Bridge-Amplifier</td><td>ADInstruments, EUA</td><td>FE221</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Roth, Alemanha</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina</td><td>Bayer, Alemanha</td><td>4007221026402</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de calibração</td><td>Millar, EUA</td><td>910-1049</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de pressão diferencial MPX</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Alemanha</td><td>Tipo 39912</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5/45</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #7B</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fórceps</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>EcoLab-PE-Micotube</td><td>Smiths, EUA</td><td>004/310/168-1</td><td></td></tr><tr><td>Etomidate Lipuro</td><td>Braun, Alemanha</td><td>2064006</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm, Alemanha</td><td>R26881</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento e unidade de controle</td><td>Labotec, Alemanha</td><td>Placa Quente 062</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter, Alemanha</td><td>HDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de Isofluran</td><td>Abbot</td><td>Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Isocarpina</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>I5627</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino 0,61 mm OD, 0,28 mm ID</td><td>Smiths Medical International Ltd, Reino Unido</td><td>Ref. 800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>MiniVent ventilador para camundongos</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Alemanha</td><td>Tipo 845</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra PVL System</td><td>Millar Instruments, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem, Alemanha</td><td>A3597</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9% isotônico</td><td>Braun, Alemanha</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de pancurônio</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>BCBQ8230V</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Nr. 70-2209</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/35 unidade de controle</td><td>ADInstruments, EUA</td><td>PL3504</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de cauterização recarregável</td><td>Faromed, Alemanha</td><td>09-605</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>140094-11</td><td></td></tr><tr><td>Software LabChart 7 Pro</td><td>ADInstruments, EUA</td><td>LabChart 7.3 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Ração padrão para camundongos</td><td>LASvendi GmbH, Alemanha</td><td>Rod18</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica 8/0</td><td>Suprama, Alemanha</td><td>Ch.B.03120X</td><td></td></tr><tr><td>Cânula de punção venosa Venflon Pro Safty 20-gauge</td><td>Beckton Dickinson, EUA</td><td>393224</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de Canulação de Vasos</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>00574-11</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa (Filtropur S 0.45)</td><td>Sarstedt, Alemanha</td><td>Ref. 83.1826</td><td></td></tr></tbody></table>

resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica determinada pela análise do loop de pressão-volume

Cardiac Response to &#946;-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis

A determinação da função cardíaca é uma análise robusta do ponto final em modelos animais de doenças cardiovasculares, a fim de caracterizar efeitos de tratamentos específicos no coração. Devido à viabilidade das manipulações genéticas, o camundongo tornou-se o modelo animal mamífero mais comum para estudar a função cardíaca e buscar novos potenciais alvos terapêuticos. Aqui descrevemos um protocolo para determinar a função cardíaca in vivo usando medidas e análises de loop de volume de pressão durante as condições basais e sob estimulação β-adrenérgica por infusão intravenosa de concentrações crescentes de isoproterenol. Fornecemos um protocolo refinado, incluindo suporte à ventilação levando em conta a pressão final positiva para amenizar efeitos negativos durante as medidas do peito aberto e a potente analgesia (Buprenorphine) para evitar o estresse miocárdio incontrolável evocado pela dor durante o procedimento. Todos juntos, a descrição detalhada do procedimento e a discussão sobre possíveis armadilhas permitem uma análise de loop de volume de pressão altamente padronizada e reprodutível, reduzindo a exclusão dos animais da coorte experimental, prevenindo possíveis viés metodológico.

A medição do ciclo de volume de pressão (PVL) é uma ferramenta poderosa para analisar a farmacodinâmica cardíaca de drogas e investigar o fenótipo cardíaco de modelos de camundongos geneticamente modificados em condições normais e patológicas. O protocolo permite a avaliação da reserva cardíaca β-adrenérgica no modelo de camundongo adulto. Aqui descrevemos um método de peito aberto sob anestesia isoflurano combinada com buprenorfina (analgésico) e pancurônio (relaxante muscular), que se concentra na resposta cardíaca à e...

Aqui descrevemos uma análise de loop de volume de pressão cardíaca sob doses crescentes de isoproterenol infundido por via intravenosa para determinar a função cardíaca intrínseca e a reserva β-adrenérgica em camundongos. Utilizamos uma abordagem de peito aberto modificada para as medições de loop de volume de pressão, nas quais incluímos ventilação com pressão final-expiratória positiva.

Resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica determinada pela análise do loop de pressão-volume

Determination of the cardiac function is a robust endpoint analysis in animal models of cardiovascular diseases in order to characterize effects of ...

Nossa abordagem de peito aberto, na qual incluímos ventilação com pressão final-expiratória positiva, é significativa para avaliar e analisar a função cardíaca in vivo, e o aumento da estimulação beta-adrenérgica. O procedimento pode ser usado para abordar ambos os parâmetros básicos da função cardíaca independente da carga, e a reserva beta-adrenérgica em camundongos geneticamente modificados ou após intervenções. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, desinfete o membro traseiro esquerdo do rato anestesiado com 70% de etanol e faça uma incisão para expor a veia femoral esquerda.Exploda a artéria epigástrica e a veia com um cautery. Para ver melhor a veia femoral, o campo de visão é atravessado por uma sutura através do abdômen. Em seguida, uma sutura é colocada distal ao acesso do cateter, para ligar a veia femoral.Passe uma sutura sob a veia femoral, e prepare um nó cranial para o local da punção. Puna a veia femoral com um micro tubo preparado ligado a uma seringa de 1 mililitro e fixe o tubo dentro do vaso com a sutura atada. Para neutralizar qualquer perda de fluido, use uma bomba de seringa automática para infundir cloreto de sódio de 0,9%, suplementado com 12,5% de albumina, a uma taxa de infusão de 15 microliter, e hidrate o tecido exposto com cloreto de sódio pré-aquecido de 0,9%.Para acessar o tórax, enxágue o tórax com 70% de etanol e inciso a pele logo abaixo do processo xifoide. Separe sem rodeios os músculos peitorais da parede do peito e use fórceps para levantar o processo xifoide para permitir que a parede do peito seja cortada, até que o diafragma seja totalmente visível. Incisar o diafragma de baixo para expor o ápice cardíaco, e use fórceps para remover cuidadosamente o pericárdio.Realize uma costotomia limitada no lado esquerdo, e passe uma sutura sob a veia de caval inferior para permitir a redução da pré-carga a jusante. Usando uma cânula de 25 bitola, puna suavemente o ápice cardíaco e substitua a cânula por um cateter de volume de pressão, até que todos os eletrodos estejam dentro do ventrículo. Em seguida, ajuste suavemente a posição do cateter até obter laços em forma retangular.Para adquirir medidas de loop de volume de pressão, realize uma análise on-line dos parâmetros de interesse da função cardíaca e espere até que uma função cardíaca de estado estável seja obtida. Pare o respirador na posição expiratória final e regissuira os parâmetros da linha de base. Após 3 a 5 segundos, use fórceps para levantar a sutura abaixo da veia caval inferior para obter parâmetros independentes de pré-carga e ligar o ventilador.Espere pelo menos 30 segundos para a segunda oclusão até que os parâmetros hemodinâmicos sejam estabilizados. Após obter a medição em condições basais, monte uma seringa carregada de isoproterenol na bomba de seringa. Espere pelo menos dois minutos, até que uma nova função cardíaca de estado estável seja observada.Antes de parar o respirador na posição final-expiratória e registrar os parâmetros da linha de base. Após 3 a 5 segundos, levante a sutura sob a veia de caval inferior para obter parâmetros independentes de pré-carga, e espere pelo menos 30 segundos pela segunda oclusão. Em seguida, monte a seringa contendo a próxima concentração de isoproterenol e repita a linha de base e pré-carregue as gravações de parâmetros independentes.Para realizar uma calibração de condutância paralela, após a última medição de dose-resposta isoproterenol, conecte uma seringa carregada com a solução de cloreto de sódio de 15% à cânula femoral e infunda cuidadosamente 5 microlitradores da solução hipertônica até que o laço de volume de pressão mude ligeiramente para a direita. Aguarde até que os loops retornem ao estado estável, antes de parar o respirador no final da expiração, e imediatamente injetar um bolus de 10 microliteres de cloreto de sódio de 15%. Em seguida, verifique se o laço de volume de pressão foi largamente ampliado e deslocado para a direita.Para realizar uma relação condutância/volume, espere 5 minutos até que o bolus salino hipertônico seja completamente diluído antes de remover o cateter, e usando uma seringa de 1 mililitro, equipada com uma cânula de 21 bitola para remover pelo menos 600 microliters de sangue do ventrículo esquerdo do coração pulsante. Em seguida, transfira o sangue para uma cuvette de calibração pré-aquecida em um banho de água de 37 graus celsius, com cilindros de um volume conhecido, e coloque o cateter de volume de pressão centralmente em cada cilindro para permitir o registro da condutura. Usando este método aberto de medição de volume de pressão do peito, se o cateter estiver corretamente colocado dentro do ventrículo, um ciclo cardíaco completo será representado por um loop de volume de pressão em forma retangular.Como ilustrado, o sístolo começa com uma fase de contração isovolumétrica, durante a qual ambas as válvulas cardíacas são fechadas. Quando a pressão ventricular excede a pressão aórtica, a válvula aórtica se abre, e o sangue é bombeado para a aorta durante a fase de ejeção. Posteriormente, quando a pressão aórtica excede a pressão ventricular, a válvula aórtica se fecha e a diastola começa.Durante o relaxamento isovolumétrico, a pressão ventricular cai, até que a pressão atrial exceda a pressão ventricular, e a válvula mitral se abre. O preenchimento diastólico passivo, caracterizado pela relação fim diastólico de pressão-volume, ocorre até o próximo ciclo cardíaco começar. Uma vez que é capaz de determinar a função cardíaca independente da pré-carga, a análise do volume de pressão pode fornecer uma visão detalhada sobre a função cardíaca, na contralidade cardíaca.Por exemplo, nesta análise isoproterenol induziu um efeito significativo em cada função cardíaca medida, e parâmetro de contração cardíaca. Em contrapartida, observou-se redução dos parâmetros diastólicos em resposta ao aumento das concentrações de isoproterenol. A colocação precisa do cateter dentro do ventrículo esquerdo é crucial para obter laços reprodutíveis sem artefatos.Para otimizar a colocação do cateter, preferimos a abordagem do peito aberto. Após as medições do laço fotovoltaico, a endise alométrica pode ser determinada, e o tecido pode ser isolado, para identificar alterações moleculares e histopatológicas, causadas por tratamentos e ou modificações genéticas. Esta técnica abre caminho para analisar a reserva beta-adrenérgica em modelos de camundongos em condições normais e patológicas e pode ser usada como modelo para testar outros estímulos.

cardiac-response-to-adrenergic-stimulation-determined-pressure-volume

Research

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