Name: Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de imunofluorescência de montagem inteira para visualização 3D dos nós sinoatrial e atrioventricular em corações de camundongo. Este protocolo preserva a morfologia tecidual para estudos cardiovasculares detalhados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, para R. Xia), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 para S. Clauss, 81Z0600206 para S. Kääb), a Fundação Corona (S199/10079/2019 para S. Clauss), o SFB 914 (projeto Z01 para H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e projeto A10 para C. Schulz), o ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 para S. Clauss) e o Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (para S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.

O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com os Animais da Universidade de Munique, e todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Camundongos C57BL6/J foram comprados do Jackson Laboratory.
NOTA: A Figura 1 mostra os instrumentos necessários para o experimento. A Figura 2 mostra uma ilustração da anatomia cardíaca macroscópica. A Figura 3 mostra a localização da SAN e da AVN em um coração de rato adulto. A Figura 4 mostra a amostra preparada carregada na microscopia confocal.
1. Preparações
<ol><li>Preparar uma solução de formaldeído a 4% (PFA a 4%) diluindo 10 mL de solução de formaldeído a 16% em 30 mL de PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução de sacarose a 15% e uma solução de sacarose a 30%, dissolvendo 15 g e 30 g de sacarose em pó em 100 mL de PBS, respectivamente. Após a dissolução completa do pó de sacarose, filtrar a solução utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm antes de armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare um gel de agarose a 3% a 4%, adicione 3 g ou 4 g de pó de agarose e 100 mL de 1x TAE (diluído a partir de 50x solução de estoque de TAE) em um béquer. Coloque o copo sobre um agitador magnético e ferva-o até que a agarose esteja completamente dissolvida.</li>
	<li>Prepare a placa de dissecação derramando suavemente 30 mL de gel de agarose (3%-4%) em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Deixe a placa de Petri no banco à temperatura ambiente para arrefecer e endurecer.</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio e a solução de lavagem de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 1. Prepare todas as soluções preparadas no dia de uso. O armazenamento a longo prazo não é recomendado.</li>
	<li>Prepare as soluções de anticorpos diluindo-as em PBS frio (4 °C) 1x, proteja a diluição da luz (por exemplo, envolvendo papel alumínio) e mantenha as diluições no gelo até que sejam usadas. Diluir os anticorpos pouco antes da incubação. Evite deixar os anticorpos diluídos à temperatura ambiente. NOTA: A diluição apropriada de anticorpos deve ser testada com amostras de tecido comparáveis, realizando uma coloração imunofluorescente convencional. Aqui, testamos os anticorpos por coloração de cortes congelados cortados a uma espessura de 10 μm.</li>
</ol>2. Colheita de órgãos e preparação de tecidos
<ol><li>Anestesiar o rato, colocando-o numa câmara de incubação ligada a um vaporizador de isoflurano. Ajuste o vaporizador para fornecer 4-5% de isoflurano (96-95% de oxigênio, respectivamente). NOTA: A anestesia completa é confirmada pela perda da reação postural e do reflexo de endireitamento rolando suavemente a câmara até que o rato seja colocado de costas.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica. Coloque o nariz do rato em uma máscara de anestesia conectada a um circuito Bain modificado com seu tubo interno conectado ao vaporizador de isoflurano. Para manter a anestesia, use isoflurano a 1-2% em oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L / min. Elimine o excesso de vapor anestésico do rato através do tubo exterior da máscara e retire através de um recipiente de carvão ativado, que absorve o excesso de gás anestésico.</li>
	<li>Quando a anestesia completa for alcançada, injete fentanil para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal, i.p.).</li>
	<li>Quando o reflexo da pinça do dedo do pé for indetectável, faça um corte claro do jugúnculo para a sínfise usando uma tesoura da íris para remover a pele e a pele. Faça outro corte da esquerda para a direita sob as costelas usando uma tesoura de íris para abrir cuidadosamente o abdômen.</li>
	<li>Vida o xifoide um pouco usando pinça curva para permitir cortar o diafragma da esquerda para a direita sem ferir nenhum órgão. Corte a caixa torácica em uma linha axilar medial em ambos os lados usando uma tesoura de íris para virá-la cranialmente e permitir o acesso ao coração.</li>
	<li>Corte a veia cava inferior e a aorta torácica descendente ao nível do diafragma usando uma tesoura de íris. Puncione o coração com uma agulha de 27 G na área do ápice e, em seguida, empurre cuidadosamente a agulha para o ventrículo esquerdo (VE). Injete suavemente 5-10 mL de PBS gelado no VE para perfundir o coração. NOTA: A cor do coração deve passar de vermelho para cinza, indicando perfusão bem-sucedida com PBS.</li>
	<li>Levante cuidadosamente o ápice do coração usando uma pinça que permite cortar os grandes vasos e remover o coração.</li>
	<li>Excise o coração, cortando as grandes artérias e veias o mais longe possível do coração para evitar qualquer dano à veia cava superior (SVC). Conserve o SVC, pois ele servirá como um marco importante durante o processamento posterior.</li>
	<li>Após a remoção do coração, desligue o vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Coloque o coração em um prato de dissecação cheio de PBS gelado sob o microscópio de dissecação. Após a determinação da esquerda / direita e frente / trás do coração, gire o coração com a frente do coração na parte inferior do prato (para expor os grandes vasos que estão localizados posteriormente).</li>
	<li>Imobilizar o coração colocando pequenos pinos através do ápice e do apêndice atrial esquerdo (AAE) na agarose na parte inferior do prato de dissecção (Figura 2A). Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o tecido não cardíaco ao redor da VCS e da veia cava inferior (VCI) (por exemplo, pulmões, gordura, pericárdio) para expor a região intercaval (Figura 3A).</li>
	<li>Remova a maioria dos ventrículos cortando paralelamente o sulco entre os ventrículos e os átrios com a microtesoura. Preserve uma pequena parte do tecido ventricular para a carga posterior no anel de plexiglas.</li>
	<li>Para fixação e desidratação, colocar a amostra (contendo os átrios, VCS e IVC) em PFA a 4% durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 15% durante 24 horas a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira o coração para a solução de sacarose a 30% durante 24 horas a 4 °C. NOTA: Para a fixação e desidratação nas etapas 2.13, 2.14 e 2.15, as amostras são deixadas a 4°C sem agitação ou balanço.</li>
</ol>3. Coloração por imunofluorescência de montagem inteira
<ol><li>Lavar o coração em Triton X-100 a 1% diluído em PBS e bloquear e permeabilizar em solução bloqueadora (Tabela 1) durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Colocar o coração num tubo de 1,5 ml e incubar com anticorpos anti-rato conexina-43 de coelho (diluição de 1:200) e HCN4 anti-rato de rato (diluição de 1:200) diluídos com solução bloqueadora durante 7 dias a 4 °C. NOTA: A concentração ideal de anticorpos primários deve ser testada antes de utilizar as fichas técnicas como orientação. Outros antígenos de interesse também poderiam ser corados nesta etapa, desde que a espécie hospedeira do antígeno primário seja diferente das demais. Uma concentração mais alta de Triton X-100 pode ajudar a obter uma coloração de anticorpos mais eficiente, conforme demonstrado antes de10, mas a concentração pode ser determinada individualmente.</li>
	<li>Após 7 dias, remover a solução que contém anticorpos primários utilizando uma pipeta e lavar o coração com 1% de solução de Triton X-100 3 vezes (cada vez durante 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).</li>
	<li>Após a lavagem, incubar o coração = com Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG (diluição de 1:200) e Alexa Fluor 647 cabra anti-coelho IgG (diluição de 1:200) por 7 dias a 4 °C.</li>
	<li>Após 7 dias, retire toda a solução que contém os anticorpos secundários utilizando uma pipeta. Em seguida, lave o coração com solução de lavagem (Tabela 1) 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital).</li>
	<li>Para corar os núcleos, incubar o coração em solução de DAPI (10 μg/mL) durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, lave o coração com solução de lavagem 3 vezes (cada vez por 1 h à temperatura ambiente no agitador orbital). NOTA: Para o bloqueio, permeabilização, incubação de anticorpos e coloração DAPI nas etapas 3.1, 3.2, 3.4 e 3.6, deixar as amostras no estado estacionário a 4 °C, sem necessidade de agitação. O tecido corado pôde ser preservado totalmente coberto com solução de lavagem a 4 °C e protegido da luz por alguns dias até a obtenção de imagens ao microscópio confocal.</li>
</ol>4. Microscopia confocal
<ol><li>Preparar anéis de plexiglas e encher com plasticina (Figura 1). No centro da plasticina, um pequeno sulco é formado no centro para carregar o coração. Faça um sulco raso, pois seria mais fácil adquirir um plano de imagem plano, ajustar o espaço e evitar bolhas de ar entre a amostra e as tampas na etapa 4.4.</li>
	<li>Use a mesma amostra de coração para a geração de imagens de SAN e AVN sequencialmente. Para imagens SAN, carregue diretamente o coração, enquanto para imagens AVN, execute a microdissecção antes.<ol><li>Geração de imagens de SAN<ol><li>Identificar a SAN por marcos anatômicos: ela está localizada no lado dorsal do coração dentro da região inter-caval (a região entre a veia cava superior e inferior). A crista terminal (TC) é a faixa muscular entre a SAN e a ARA.</li>
			<li>Coloque o coração no sulco de plasticina com a parte de trás do coração voltada para cima. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).</li>
			<li>Sob o microscópio de dissecção, pressione suavemente o RAA, o LAA e as partes restantes do ventrículo esquerdo na plasticina para fixar o coração. Certifique-se de que toda a região inter-caval e a crista terminalis possam ser claramente vistas (não cobertas por plasticina). A área que será visualizada é mostrada na Figura 3A.</li>
		</ol></li>
		<li>Imagem AVN<ol><li>Depois de concluir a imagem da SAN, recolete a mesma amostra e, posteriormente, use para a imagem AVN. Para microdissecção AVN, coloque o coração = em uma placa de dissecção sob o microscópio de dissecção.</li>
			<li>Oriente o coração com o lado direito voltado para cima (incluindo as partes restantes do ventrículo direito). Coloque pinos através da parte restante da parede livre do VE (que agora está na parte inferior) para imobilizar o tecido (Figura 2B).</li>
			<li>Corte a parede livre do VD restante para cima através da valva tricúspide e da veia cava superior. Em seguida, vire o VD e a AR para expor o septo interventricular e interatrial. (Figura 3B) NOTA: Preste atenção para não danificar o seio coronário (CS), pois é um marco anatômico importante encontrar o triângulo de Koch que permite localizar a AVN. O CS corre transversalmente no sulco atrioventricular esquerdo no lado posterior do coração, e a abertura do orifício CS está localizada entre a VCI e a valva tricúspide na parte inferior do septo interatrial (Figura 3A e B).</li>
			<li>Identificar o triângulo de Koch que pode ser encontrado na superfície endocárdica do átrio direito, delimitado anteriormente pela linha articular do folheto septal da valva tricúspide (VC) e posteriormente pelo tendão de Todaro. A base é formada pelo orifício do seio coronariano (Figura 3B). Como essa é a região alvo para imagens AVN, ela precisa ser claramente visível.</li>
			<li>Transfira o coração para o sulco de plasticina dentro do anel de Plexiglas com o triângulo de Koch claramente exposto (ou seja, não coberto por plasticina). Pressione suavemente o tecido ao redor do triângulo de Koch na plasticina para fixar a amostra. Adicione PBS no coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS (geralmente algumas gotas de PBS são suficientes).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aplique silicone nas bordas dos anéis de plexiglas para permitir cobrir os corações carregados dentro dos anéis de plexiglas cheios de plasticina com deslizamentos de cobertura.</li>
	<li>Pressione suavemente a parte de trás da plasticina para espremer partes do PBS e para anexar o coração à tampa, evitando bolhas de ar dentro da área de imagem. NOTA: Certifique-se de que as regiões de interesse não estão dobradas e cobertas durante a pressão na parte de trás da plasticina. Um plano de imagem plano sem supercompressão da amostra é necessário para conservar a anatomia e para a imagem confocal adequada das amostras. Para SAN, é importante certificar-se de que a região entre cavalas esteja claramente exposta. Para AVN, o triângulo de Koch deve ser totalmente exposto.</li>
	<li>Coloque as amostras de coloração de montagem inteira de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal. O SAN/AVN exposto anexado à folha da tampa está agora na parte inferior da plataforma do microscópio (Figura 4). NOTA: Para tirar imagens, usamos o Carl Zeiss LSM800 com Airyscan Unit e o software ZEN 2.3 SP1 preto.</li>
	<li>Escolha a placa "BP420-480 + LP605" para a excitação do anti-HCN4 conjugado Alexa Fluor 647. Varie o ganho mestre de 650-750.</li>
	<li>Obtenha uma imagem geral de toda a região SAN e AVN usando a função Verificação de blocos . Em seguida, selecione a região positiva para HCN4 clicando e adicionando um quadrado na imagem de visão geral em torno da área de interesse que será digitalizada.</li>
	<li>Verifique os parâmetros, incluindo placas e ganho mestre para os canais restantes (Alexa Fluor 488 e DAPI) do microscópio confocal e do conjunto, conforme descrito na etapa 4.6.</li>
	<li>Ajuste lentamente o foco de cima para baixo da amostra para visualizar toda a amostra e definir o Primeiro e o Último para o intervalo de pilha Z. Defina um intervalo ideal para a pilha Z com base na espessura da amostra óptica. Usamos um objetivo de 20x e 0,8-1 μm como intervalo para Z-stack.</li>
	<li>Depois que todos os parâmetros estiverem definidos corretamente, verifique toda a área da SAN e do AVN.</li>
	<li>Realizar a reconstrução 3D das imagens usando software (por exemplo, Imaris versão 8.4.2).<ol><li>Selecione Processamento de Imagens | Subtração da linha de base para remover a coloração de fundo.</li>
		<li>Selecione a criação de superfície na configuração do canal e da região de interesse selecionados para processamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).</li>
<li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li>
<li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espa%C3%B1ola+de+Cardiolog%C3%ADa+%28English+Edition%22%5BJournal%5D)">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li>
<li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%3A+a+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%BCller-Taubenberger%2C+A+%22Dictyostelium+discoideum+Protocol%22">Dictyostelium discoideum Protocol</a>. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+PJ+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).</li>
<li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Airyscan+detector+from+ZEISS%3A+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li>
<li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li>
<li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+%27funny%27+%28f%29+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664(2014).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li>
<li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+diversity+in+the+heart%3A+insights+from+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).</li>
<li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gap+junctions+and+connexins%3A+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

A anatomia cardíaca tem sido tradicionalmente estudada por meio de cortes histológicos finos11. No entanto, esses métodos não preservam a estrutura tridimensional do sistema de condução e, portanto, fornecem apenas informações 2D. O protocolo de coloração por imunofluorescência de montagem completa descrito aqui permite superar essas limitações e pode ser usado rotineiramente para imagens SAN e AVN.
Em comparação com métodos padrão, como a imuno-histoquímica convenciona...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

As arritmias são doenças comuns que afetam milhões de pessoas e são a causa de morbidade e mortalidade significativas em todo o mundo. Apesar dos enormes avanços no tratamento e na prevenção, como o desenvolvimento de marcapassos cardíacos, o tratamento das arritmias permanece desafiador, principalmente devido ao conhecimento muito limitado sobre os mecanismos da doença de base 1,2,3. Uma melhor compreensão da eletrofisiologia normal e da fisiopatologia das arritmias pode ajudar a desenvolver estratégias de tratamento novas, inovadoras e causais no futuro. Além disso, para estudar de forma abrangente a arritmogênese, é importante localizar e visualizar o sistema de condução cardíaca específico em modelos animais, como o camundongo, pois os camundongos são amplamente utilizados em pesquisas de eletrofisiologia.
As principais partes do sistema de condução cardíaca são o nó sinoatrial (SAN), onde o impulso elétrico é gerado em células de marcapasso especializadas, e o nó atrioventricular (AVN), que é a única conexão elétrica entre os átrios e os ventrículos4. Sempre que as propriedades eletrofisiológicas da SAN e da AVN são alteradas, podem ocorrer arritmias como síndrome do seio doente ou bloqueio atrioventricular, o que pode levar à deterioração hemodinâmica, síncope e até mesmo à morte, ressaltando assim o papel essencial da SAN e da AVN na eletrofisiologia e arritmogênese5.
Estudos abrangentes sobre SAN ou AVN exigem uma localização e visualização precisas de ambas as estruturas, idealmente dentro de seu ambiente fisiológico. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e localização dentro do miocárdio de trabalho, sem estabelecer uma estrutura macroscopicamente visível clara, estudar a anatomia e a eletrofisiologia da SAN e da AVN é um desafio. Pontos de referência anatômicos podem ser usados para identificar aproximadamente a região que contém SAN e AVN 6,7,8. Em resumo, a SAN está localizada na região inter-caval do átrio direito adjacente à crista terminal muscular (TC), a AVN está localizada dentro do triângulo de Koch estabelecido pela valva tricúspide, o óstio do seio coronariano e o tendão de Todaro. Até agora, esses marcos anatômicos foram usados principalmente para localizar, remover e, em seguida, estudar SAN e AVN como estruturas individuais (por exemplo, pela histologia convencional). Para entender melhor a complexa eletrofisiologia da SAN e da AVN (por exemplo, efeitos regulatórios de células adjacentes do miocárdio em funcionamento), no entanto, é necessário estudar os sistemas de condução dentro do ambiente fisiológico 3D.
A coloração por imunofluorescência de montagem completa é um método utilizado para estudar estruturas anatômicas in situ , preservando a integridade do tecido circundante9. Aproveitando o software de microscopia confocal e análise de imagens, o SAN e o AVN podem ser visualizados com anticorpos marcados fluorescentemente visando canais iônicos especificamente expressos nessas regiões.
Este protocolo a seguir explica as etapas necessárias para executar um método de coloração de montagem completa bem estabelecido para localização e visualização de microscópio SAN e AVN. Especificamente, este protocolo descreve como (1) localizar SAN e AVN por marcos anatômicos para preparar essas amostras para coloração e análise microscópica (2) para realizar coloração de imunofluorescência de montagem completa dos marcadores de referência HCN4 e Cx43 (3) para preparar amostras de SAN e AVN para microscopia confocal (4) para realizar imagens confocais de SAN e AVN. Também descrevemos como este protocolo pode ser modificado para incluir coloração adicional do miocárdio circundante ou células não-miócitos, como fibras nervosas autônomas, o que permite uma investigação completa do sistema de condução cardíaca dentro do coração.

<table><tbody><tr><td><forte>Anestesia</forte></td>Sistema vaporizador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td><td>Inclui uma câmara de indução, uma unidade de evacuação de gás e filtros de carvão</td></tr><tr><td>Circuito Bain modificado</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4860</td><td>Inclui uma máscara de anestesia para camundongos</td></tr><tr><td>Plataforma cirúrgica</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M</td><td></td></tr><tr><td>In vivo instrumentação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps fino</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de tecido</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Alfinetes de tecido</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-01</td><td>Poderia usar agulhas 27G como substituto</td></tr><tr><td><forte>Instrumentos gerais de laboratório</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Agitador magnético Sunlab</td><td>D-8040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IKA&nbsp;</td><td>Pipeta RH básica</td><td></td></tr><tr><td>, volume 10 &micro; L, 100 &micro; L, 1000 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Dissecção microscópio de zoom estéreo&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10836-004</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.2</td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>Oxford</tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 preto</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Lab Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro de seringa</td><td>Sartorius</td><td>17597</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>agulha 27G</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cônico de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Thermo Scientific</td><td>7632160</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>20-158</td><td>Componentes da</td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído TEA 16%</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>28908</td><td>use como solução a 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>Componentes do TEA</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>850070</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1X) Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S1888-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Roche</td><td>TRIS-RO</td><td>Componentes do TEA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ml</td><td>Diluído a 1% em PBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Drugs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl 0.5&nbsp; mg/10&nbsp; mL</td><td>Braun Melsungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1 mL/mL</td><td>Cp-pharma</td><td>31303</td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio 5 L</td><td>Linde</td><td>2020175</td><td>Inclui um regulador de pressão</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor&nbsp; 488&nbsp;</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td> <td># 4412</td><td>diluído para 1: 200</td></tr><tr><td>Cabra anti-Rato IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>#A-21247</td><td>diluído para 1: 200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Cloridrato, Trihidrato (DAPI)</td> <td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>diluído para 1: 1000</td></tr><tr><td>Coelho Anti-Conexina-43</td><td>Sigma</td><td>C6219</td><td>diluído para 1: 200</td></tr><tr><td>Rato anti-HCN4 (SHG 1E5)</td> <td>Invitrogen</td><td>MA3-903</td><td>diluído a 1:200</td></tr><tr><td><forte>Outro</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anel de plexiglass</td><td></td><td></td><td>Auto-projetado e impresso em 3D</td></tr><tr><td>Plasticina</td><td>Cernit</td><td>49655005</td><td></td></tr><tr><td>Silikonpasten, Baysilone</td><td>VWR</td><td>291-1220<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse, C57BL / 6</td><td>O Laboratório</td><td></td><td></td> Jackson</tr></tbody></table>

coloração de imunofluorescência de montagem inteira, imagem confocal e reconstrução 3d do nó sinoatrial e atrioventricular em camundongo

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

O sinal elétrico fisiologicamente gerado pelas células do marcapasso no nó sinoatrial (SAN) é conduzido através do sistema de condução, que inclui o nó atrioventricular (AVN), para permitir a excitação e contração de todo o coração. Qualquer disfunção de SAN ou AVN resulta em arritmias, indicando seu papel fundamental na eletrofisiologia e arritmogênese. Modelos de camundongos são amplamente utilizados na pesquisa de arritmia, mas a investigação específica de SAN e AVN permanece desafiadora.
A SAN está localizada na junção da crista terminal com a veia cava superior e a AVN está localizada no ápice do triângulo de Koch, formado pelo orifício do seio coronariano, do anel tricúspide e do tendão de Todaro. No entanto, devido ao pequeno tamanho, a visualização pela histologia convencional continua sendo desafiadora e não permite o estudo de SAN e AVN dentro de seu ambiente 3D.
Aqui descrevemos uma abordagem de imunofluorescência de montagem inteira que permite a visualização local de SAN e AVN de camundongos marcados. A coloração de imunofluorescência de montagem inteira destina-se a seções menores de tecido sem a necessidade de seccionamento manual. Para este fim, o coração do rato é dissecado, com tecido indesejado removido, seguido de fixação, permeabilização e bloqueio. As células do sistema de condução dentro da SAN e da AVN são então coradas com um anticorpo anti-HCN4. A microscopia confocal de varredura a laser e o processamento de imagem permitem a diferenciação entre células nodais e cardiomiócitos em funcionamento e localizam claramente a SAN e a AVN. Além disso, anticorpos adicionais podem ser combinados para rotular outros tipos de células também, como fibras nervosas.
Em comparação com a imuno-histologia convencional, a coloração por imunofluorescência de montagem completa preserva a integridade anatômica do sistema de condução cardíaca, permitindo assim a investigação da AVN; especialmente em sua anatomia e interações com o miocárdio de trabalho circundante e células não-miócitos.

Usando o protocolo descrito acima, a imagem de microscopia confocal de SAN e AVN pode ser realizada de forma confiável. A coloração específica do sistema de condução usando anticorpos fluorescentes direcionados à HCN4 e a coloração do miocárdio de trabalho usando anticorpos fluorescentes direcionados à Cx43 permitem a identificação clara de SAN (Figura 5, Vídeo 1) e AVN (Figura 6, Vídeo 2) dentro da anatomia inta...

Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Este protocolo explica as etapas necessárias para realizar microdissecção, coloração de imunofluorescência de montagem total e microscopia especificamente para o nó sinusal e o nó AV no camundongo. A metodologia de montagem completa é vantajosa para abordar a localização 3D exata e a morfologia do seio e do nó AV e para examinar a relação com o tecido circundante. A morfologia do tecido é consideravelmente preservada com apenas o mínimo de desidratação do tecido e ruptura física.Para começar, perfure o coração com uma agulha de calibre 27 na área do ápice, empurrando cuidadosamente a agulha para o ventrículo esquerdo e injetando suavemente de cinco a 10 mililitros de PBS gelado para profundir o coração. Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e corte os vasos grandes para remover o coração. Coloque o coração em uma placa de dissecação cheia de PBS gelado sob o microscópio de dissecação.Após a determinação da orientação do coração, gire o coração para que a frente do coração fique no fundo do prato. Imobilize o coração colocando pequenos pinos através do ápice e do apêndice atrial na agarose na parte inferior da placa de dissecação. Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o tecido não cardíaco ao redor das veias cava superior e inferior.Para expor a região intercaval, remova a maioria dos ventrículos cortando paralelamente ao sulco entre os ventrículos e os átrios com uma microtesoura. Para fixação e desidratação, coloque a amostra em paraformaldeído a 4% durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira o coração para uma solução de sacarose a 15% e incube-o por 24 horas a quatro graus Celsius.Após a incubação, transfira o coração para uma solução de sacarose a 30% por mais 24 horas a quatro graus Celsius. Lave o coração em 1% Triton X-100 diluído em PBS. Em seguida, bloqueie-o e permeabilize-o em solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius.Coloque o coração em um tubo de 1,5 mililitro e incuba-o com anticorpos anti-camundongo Conexina 43 de coelho e anticorpos anti-camundongo HTN4 de rato diluídos com solução de bloqueio por sete dias a quatro graus Celsius. Após sete dias, remova a solução contendo anticorpos primários usando uma pipeta. Lave o coração com solução de Triton X-100 a 1% três vezes por uma hora por lavagem no agitador orbital.Repita as etapas de lavagem após a incubação com anticorpos secundários e DAPI. Depois de preparar anéis de plástico e preenchê-los com plasticina, coloque o coração na ranhura de plasticina com a parte de trás do coração voltada para cima. Identifique o SAN, que está localizado no lado dorsal do coração com a região intercava.Adicione PBS ao coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS. Aplique silicone nas bordas do anel de plástico. Pressione suavemente a parte circundante da amostra na plasticina para fixar o coração e cubra o coração com uma lamínula.Em seguida, pressione suavemente a parte de trás da plasticina para espremer um pouco do PBS e prenda o coração à lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas de ar na área de imagem. Posicione as amostras de coloração de montagem inteira de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal e prossiga com a imagem conforme descrito no manuscrito do texto. Os parâmetros para cada canal do microscópio confocal são definidos usando o respectivo software.Este protocolo foi usado para realizar imagens de microscopia confocal do nó sinoatrial e do nó atrioventricular em corações murinos. A coloração específica do sistema de condução e o miocárdio de trabalho com anticorpos fluorescentes, visando HCN4 e Conexina 43, respectivamente, tornam possível identificar o nó sinoatrial e o nó atrioventricular dentro da anatomia intacta. Este protocolo de coloração de montagem total torna possível estudar a interação de diferentes tipos de células usando vários anticorpos.

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar o nó sinoatrial ou SAN do coração do camundongo. O SAN abriga as células sinoatriais que iniciam os batimentos cardíacos gerando potenciais de ação espontâneos.

Isolamento do nó sinoatrial do modelo de camundongo: um procedimento para colher o nó SA do coração murino

Usando exames de ressonância magnética (humana), software de imagem 3D e análise imuno-histológica, documentamos alterações nos ventrículos laterais do cérebro. O mapeamento longitudinal 3D das alterações do volume do ventrículo lateral e a caracterização das alterações celulares periventriculares que ocorrem no cérebro humano devido ao envelhecimento ou doença são então modelados em camundongos.

Modelagem 3D do lateral ventrículos e histológica Caracterização do Tecido Periventricular em humanos e mouse

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal.

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Aprenda a técnica de imunofluorescência de montagem inteira para visualização 3D dos nós sinoatrial e atrioventricular em corações de camundongo. Este protocolo preserva a morfologia tecidual para estudos cardiovasculares detalhados.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

Explorar mais vídeos