Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo
22 de dezembro de 2020
Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.
Este protocolo explica as etapas necessárias para realizar microdissecção, coloração de imunofluorescência de montagem total e microscopia especificamente para o nó sinusal e o nó AV no camundongo. A metodologia de montagem completa é vantajosa para abordar a localização 3D exata e a morfologia do seio e do nó AV e para examinar a relação com o tecido circundante. A morfologia do tecido é consideravelmente preservada com apenas o mínimo de desidratação do tecido e ruptura física.
Para começar, perfure o coração com uma agulha de calibre 27 na área do ápice, empurrando cuidadosamente a agulha para o ventrículo esquerdo e injetando suavemente de cinco a 10 mililitros de PBS gelado para profundir o coração. Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e corte os vasos grandes para remover o coração. Coloque o coração em uma placa de dissecação cheia de PBS gelado sob o microscópio de dissecação.
Após a determinação da orientação do coração, gire o coração para que a frente do coração fique no fundo do prato. Imobilize o coração colocando pequenos pinos através do ápice e do apêndice atrial na agarose na parte inferior da placa de dissecação. Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o tecido não cardíaco ao redor das veias cava superior e inferior.
Para expor a região intercaval, remova a maioria dos ventrículos cortando paralelamente ao sulco entre os ventrículos e os átrios com uma microtesoura. Para fixação e desidratação, coloque a amostra em paraformaldeído a 4% durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira o coração para uma solução de sacarose a 15% e incube-o por 24 horas a quatro graus Celsius.
Após a incubação, transfira o coração para uma solução de sacarose a 30% por mais 24 horas a quatro graus Celsius. Lave o coração em 1% Triton X-100 diluído em PBS. Em seguida, bloqueie-o e permeabilize-o em solução de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius.
Coloque o coração em um tubo de 1,5 mililitro e incuba-o com anticorpos anti-camundongo Conexina 43 de coelho e anticorpos anti-camundongo HTN4 de rato diluídos com solução de bloqueio por sete dias a quatro graus Celsius. Após sete dias, remova a solução contendo anticorpos primários usando uma pipeta. Lave o coração com solução de Triton X-100 a 1% três vezes por uma hora por lavagem no agitador orbital.
Repita as etapas de lavagem após a incubação com anticorpos secundários e DAPI. Depois de preparar anéis de plástico e preenchê-los com plasticina, coloque o coração na ranhura de plasticina com a parte de trás do coração voltada para cima. Identifique o SAN, que está localizado no lado dorsal do coração com a região intercava.
Adicione PBS ao coração para deslocar todo o ar dentro da cavidade até que o coração esteja totalmente coberto com PBS. Aplique silicone nas bordas do anel de plástico. Pressione suavemente a parte circundante da amostra na plasticina para fixar o coração e cubra o coração com uma lamínula.
Em seguida, pressione suavemente a parte de trás da plasticina para espremer um pouco do PBS e prenda o coração à lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas de ar na área de imagem. Posicione as amostras de coloração de montagem inteira de cabeça para baixo na plataforma do microscópio confocal e prossiga com a imagem conforme descrito no manuscrito do texto. Os parâmetros para cada canal do microscópio confocal são definidos usando o respectivo software.
Este protocolo foi usado para realizar imagens de microscopia confocal do nó sinoatrial e do nó atrioventricular em corações murinos. A coloração específica do sistema de condução e o miocárdio de trabalho com anticorpos fluorescentes, visando HCN4 e Conexina 43, respectivamente, tornam possível identificar o nó sinoatrial e o nó atrioventricular dentro da anatomia intacta. Este protocolo de coloração de montagem total torna possível estudar a interação de diferentes tipos de células usando vários anticorpos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve os passos para a coloração de imunofluorescência em preparação inteira do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações de camundongos. A metodologia permite a localização tridimensional precisa e o exame da morfologia dessas estruturas cardíacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Cardiovascular
- Técnicas de Imunofluorescência
Antecedentes
- O nó sinoatrial (SAN) e o nó atrioventricular (AVN) são fundamentais para a função cardíaca.
- A imunofluorescência em preparação inteira fornece informações sobre a morfologia desses nós.
- Essa técnica preserva a morfologia tecidual com desidratação mínima.
- Compreender a relação entre esses nós e os tecidos circundantes é essencial para a pesquisa cardíaca.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para coloração do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações de camundongos.
- Facilitar o estudo da localização tridimensional dos nódulos cardíacos.
- Aprimorar a compreensão das interações do tecido cardíaco.
Métodos Utilizados
- Microdissecação de corações de camundongos.
- Coloração de imunofluorescência em preparação inteira.
- Microscopia para visualização dos tecidos corados.
- Uso de PBS frio em gelo para preservação dos tecidos.
Resultados Principais
- Coloração bem-sucedida do NSA e do NVA em corações de camundongos.
- Preservação da morfologia tecidual observada.
- Visualização clara da localização tridimensional obtida.
- Compreensão aprimorada das relações dos nódulos cardíacos com os tecidos circundantes.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para o estudo do NSA e do NAD em camundongos.
- A imunofluorescência em montagem inteira é uma técnica valiosa na pesquisa cardíaca.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para obter insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização tridimensional de alta resolução dos nós sinoatrial e atrioventricular em modelos de camundongos preenche uma lacuna crítica na pesquisa de eletrofisiologia cardíaca, permitindo o mapeamento anatômico e celular preciso. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na validação precoce de alvos para mecanismos de arritmia e apoia a continuidade translacional desde a descoberta até estudos cardíacos pré-clínicos. A preservação da integridade do tecido e a possibilidade de análise multiplexada de tipos celulares posicionam este fluxo de trabalho como um recurso reutilizável para portfólios de P&D cardiovascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação detalhada de populações de células do marcapasso e do sistema de condução in situ.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer as relações entre estrutura e função dos nódulos.
- Facilita a identificação segura de alvos relevantes para doenças na arritmogênese.
- Fornece contexto anatômico para estudos funcionais e testes de hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de tecido cardíaco intactos e validados para fluxos de trabalho downstream de imagem e análise.
- Fornece resultados quantitativos reprodutíveis de imunofluorescência para marcadores nodais e miocardiais.
- Permite marcação multiplexada com anticorpos para avaliar múltiplos tipos celulares dentro da mesma amostra.
- Apóia a padronização e escalabilidade de ensaios para estudos comparativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados anatômicos tridimensionais com modelos pré-clínicos relevantes para doenças de distúrbios da condução cardíaca.
- Mantém a continuidade desde a descoberta molecular até a validação em nível tecidual.
- Permite o avanço ajustado ao risco de alvos candidatos com base em evidências estruturais e celulares.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores por meio da análise das interações entre células nodais e não miócitos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de imunofluorescência em preparação de montagem inteira e imagem confocal integra a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa cardíaca pré-clínica, fornecendo dados anatômicos quantitativos de alto conteúdo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na pesquisa de condução cardíaca.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de imunofluorescência para identificação de nódulos.
- Análises: Permite a reconstrução tridimensional e análise comparativa de regiões nodais e miocárdicas.
- Pesquisa Translacional: Oferece continuidade anatômica e celular para modelos pré-clínicos de arritmias.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma padronizada de imagem e análise para equipes de P&D cardiovascular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos cardíacos.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo do tecido e a aquisição de imagens para gerar resultados reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência no uso de capital em programas de descoberta cardíaca.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos do sistema de condução cardíaco.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação cardíaca, imunofluorescência e microscopia confocal.
- Requer acesso a plataformas de imagem avançadas e software de análise de imagens.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de manipulação de tecidos e protocolos com anticorpos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes modelos cardíacos ou espécies.
- O tamanho da amostra e a penetração do anticorpo podem limitar a produtividade em estudos de larga escala.
