Name: Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Aprenda a isolar e clonar linfócitos T de tecido valvar aórtico calcificado usando células alimentadoras de casaco de buffy irradiado. Este método permite analisar subpopulações de células T por citometria de fluxo para estudar a doença valvar aórtica calcificada.

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Todos os sacos de casacos polidos usados para este protocolo foram irradiados graças à disponibilidade do Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer e toda a equipe do Departamento de Radiologia de Charité Benjamin Franklin. Bolsista/Mary Roxana Christopher, este trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos da Sociedade Cardíaca Alemã (DGK).

O estudo foi realizado de acordo com o Estatuto do Charité para Assegurar boas Práticas Científicas e respeitadas as diretrizes legais e disposições sobre privacidade e ética. O Comitê de Ética aprovou todos os experimentos humanos e a privacidade e o anonimato dos pacientes foram mantidos de acordo com as regras relatadas no Formulário de Ética.
NOTA: Para o protocolo descrito abaixo foram utilizadas amostras frescas de válvulas estenóticas humanas.
1. Preparação do reagente
<ol><li>Prepare o meio completo RPMI enriquecido adicionando em RPMI 1640 Médio: aminoácidos não essenciais; Piruvato de Sódio, L-Glutamina, ß-Mercaptoethanol e Penicilina-Streptomicina (Pen/Strep). Filtre-o antes de usá-lo. Armazene a +4 °C e use dentro de dois meses.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular (CCM) para a fase de clonagem utilizando o meio completo RPMI 1640 completo adicionado por calor (FBS), hb basal médio, 50 U de Interleucina 2 (IL-2) e Soro Humano (HS). Filtre e use-o dentro de um dia. Não guarde.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular para a fase de realimentação utilizando o meio completo RPMI 1640 enriquecido com Aturado FBS, meio basal HB, 30 U de IL-2 e HS. Filtre e use-o dentro de um dia. Não guarde.</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem contendo 250 mL de RPMI e 5 mL Pen/Strep. Armazene a +4 °C, use dentro de dois meses.</li>
</ol>2. Isolamento e cultura de linfócitos T humanos em frascos T-25
<ol><li>Coloque a amostra da válvula estenótica em uma placa de Petri estéril cheia de tampão de lavagem, garantindo que toda a amostra da válvula esteja coberta com ela. Deixe ficar por 15 minutos.</li>
	<li>Corte a válvula estética em pequenos pedaços usando um bisturi e deixe-a de pé novamente por 10 minutos.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular com 50 U de IL-2, como descrito anteriormente, e filtre-o.</li>
	<li>Adicione o CCM dentro dos frascos T25 e usando um plier de plástico estéril, coloque as peças da válvula dentro dos frascos.</li>
	<li>Armazene os frascos em uma posição vertical dentro de uma incubadora de CO2 por uma semana, tomando o cuidado de observar o status do frasco sob o microscópio. Os clones de células T devem ser visíveis aproximadamente três dias após a etapa cultural; para melhor observação é aconselhável colocar os frascos na posição horizontal por 20 minutos antes da análise microscópica. NOTA: A quantidade de meio de cultura celular depende da quantidade de amostra presente e de quantos frascos T25 serão utilizados. Considerando que cada pedaço de válvula requer 10 mL de CCM dentro de um frasco, 25 mL de CCM em um frasco T25 é apropriado para 3 pedaços de válvula.</li>
</ol>3. Fase de clonagem
NOTA: Para a fase de clonagem das células T, é necessário começar com o isolamento das células alimentador a partir de uma camada de buffy irradiada (BC), seguindo o protocolo pbmcs.
<ol><li>Abra o saco BC sob a coifa de fluxo laminar usando o espigão do saco com válvula livre de agulha e transfira 50 mL de sangue em um frasco T150. Adicione 70 mL de PBS para diluir o sangue dentro do frasco.</li>
	<li>Pegue quatro tubos cônicos de 50 mL e coloque 20 mL de gradiente de densidade em cada um e cuidadosamente camada 30 mL de sangue sobre ele.</li>
	<li>Centrifugar por 25 min a 800 x g e 20 °C com o freio desligado.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o supernaste e descarte-o como lixo. Colete o anel pbmcs em um novo tubo cônico de 50ml adicionando dentro da solução PBS até um volume de 50ml.</li>
	<li>Centrifugar por 10 min a 400 x g e 20 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e suspenda a pelota adicionando dentro da solução PBS até um volume de 50 mL. Repita a fase de centrifugação por 10 min a 400 x g e 20 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e suspenda os FCs em 10 mL de meio de cultura celular.</li>
	<li>Pegue um novo tubo de coleta e dilua os FCs com PBS 1:10 adicionando dentro de 9,9 mL de PBS e 100 μL do tubo com FCs e meio de cultura celular. Enxágüe bem com uma pipeta e tire 7 μL desta diluição e conte as células sob o microscópio.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular para a fase de clonagem: 70 mL com 50 U de IL-2 e, em seguida, divida-o em dois tubos cônicos de 50 mL, cada tubo conterá 25 mL de meio de cultura celular, como descrito abaixo:<ul style="list-style-type: disc;">
<li>Tubo 1: 25 mL de CCM + FCs + 0,6% de fitohemagglutinina (PHA)</li>
		<li>Tubo 2: 25 mL de linfócitos CCM + T NOTA: O objetivo do método PMBCs é obter 2 x 106 células para cada mL, de modo que os 25 mL de CCM preparados (Tubo 1) precisam ser calculados em conformidade. A fórmula geral utilizada é: Número de células contadas x 106: 1 mL = CCM x 106: X</li>
	</ul>
</li>
</ol>4. T Cultura de linfócitos em placas multiwell
<ol><li>Usando a pipeta eletrônica, colete todo o meio de cultura celular dentro dos frascos e transfira-o para um tubo cônico de 50 mL. Os frascos vazios podem ser jogados fora.</li>
	<li>Pelota as células por centrifugação por 10 min a 400 x g e 20 °C.</li>
	<li>Descarte o supernasce, suspenda a pelota em 50 mL de PBS e colete as células por centrifugação por 10 minutos a 400 x g e 20 °C. Repita este passo duas vezes.</li>
	<li>Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de CCM. Pegue 7 μL desta diluição e conte as células sob o microscópio. NOTA: O número de células contadas precisa ser multiplicado para o volume da câmara e para a diluição aplicada.</li>
	<li>Proceda para diluir as células contadas de 105 a 103 em meio de cultura celular e, em seguida, tomar 500 μL de 103 e colocá-lo dentro do tubo 2.</li>
	<li>Despeje o meio de cultura celular de 25 mL do tubo 1 dentro de uma placa de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm.</li>
	<li>Pegue quatro placas multiwell inferiores de 96-U e usando uma pipeta multicanal definida para 100 FCs de sementes de μL em cada poço.</li>
	<li>Pegue o tubo 2 e despeje o meio de cultura celular dentro de uma placa de Petri. Usando uma pipeta multicanal definida para 100 μL, células T de sementes em cada poço.</li>
	<li>Armazene as placas multiwell dentro de uma incubadora de CO2 por uma semana.</li>
</ol>5. Primeira fase de refeeding
<ol><li>Usando um saco de casaco de buffy irradiado, siga o método PBMCs para obter FCs como descrito no método anterior.</li>
	<li>Prepare a quantidade adequada de CCM sem PHA e filtre-a.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, remova 100 μL de cada poço, garantindo não tocar na parte inferior do poço.</li>
	<li>Adicione 100 μL de FCs em todos os poços como uma camada de alimentação para fornecer nutrientes à cultura celular e alterar o meio. NOTA: Para cada multiwell é aconselhável considerar 6 mL de CCM, de modo que a quantidade recomendada para 4 multiwells é de cerca de 30 mL. A PHA (0,4% da quantidade total de CCM) precisa ser adicionada ao CCM uma vez a cada duas semanas.</li>
</ol>6. Segunda fase de refeeding
<ol><li>Repita a fase de refeeding após a passagem descrita acima. 0,4% PHA precisa ser adicionado ao meio de cultura celular.</li>
</ol>7. Primeira fase de divisão de 1 poço/amostra para 2 poços/amostra
<ol><li>Verifique todos os quatro multi-poços sob o microscópio e vá em frente dividindo esses poços com clones de células T (TCCs).</li>
	<li>Siga o protocolo PBMCs para isolar células alimentadoras de um saco de casacos de buffy irradiados.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular com 30 U de IL-2. Adicione os FCs e pegue uma nova placa multiwell de 96 poços com fundo U.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta definida a 100 μL, enxágue bem dentro dos poços das amostras selecionadas e divida os 200 μL de volume contidos em cada poço em 2 novos poços da nova placa multiwell, a fim de ter 100 μL de volume para cada um dos novos 2 poços.</li>
	<li>Adicione 100 μL de FCs dentro de todos os novos poços. Cada poço deve conter um volume total de 200 μL.</li>
	<li>Coloque a pipeta em 100 μL e adicione 100 μL em dois poços adicionais, contendo apenas FCs para servir como controle. NOTA: Use microscopia leve para observar todas as placas multi-poços, a fim de determinar quais poços cresceram com sucesso O TCC. Para facilitar a seleção de clones, uma comparação pode ser feita ao controle (os dois poços contendo apenas FCs), com o clone parecendo mais escuro e maior em comparação com o controle. Os poços a serem selecionados são aqueles com um clone grande, claro e redondo, com linfócitos densamente embalados juntos. Se não houver TCCs após duas semanas de refeeding, é recomendável esperar mais uma semana e realizar uma fase adicional de refeeding.</li>
</ol>8. Segunda fase de divisão de 2 poços/amostra para 4 poços/amostra
<ol><li>Coloque a pipeta em 100 μL, enxágue bem dentro dos dois poços de cada amostra e semente dois novos poços de 100 μL para cada um.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular com 30 U de IL-2 e siga a técnica de PBMCs para extrair os FCs do saco de casaco e colocar os FCs dentro do CCM.</li>
	<li>Coloque a pipeta em 100 μL e semente os FCs em todos os poços. Armazene os multiwells em uma incubadora de CO2 por uma semana.</li>
</ol>9. Terceira fase de divisão de 4 poços/amostra para 8 poços/amostra:
<ol><li>Usando uma pipeta multicanal definida para 100 μL, enxágue bem dentro de todos os quatro poços de cada amostra e sementes de 100 μL em cada um dos quatro novos poços em uma nova placa de 96 poços.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular e siga a técnica de PBMCs para extrair os FCs de um saco de casacos de buffy irradiado.</li>
	<li>Coloque os FCs dentro do CCM. Coloque a pipeta em 100 μL e semente os FCs em todos os poços. Armazene os multiwells em uma incubadora de CO2 por uma semana</li>
</ol>10. Análise citofluoremétrica
<ol><li>Pegue a placa multiwell com a data mais antiga da incubadora de CO2 e identifique os tubos de coleta com os números da amostra para analisar.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta multicanal definida para 200 μL com 2 pontas, enxágue completamente dentro de dois poços da mesma amostra e coloque ambos dentro do mesmo tubo de coleta. Repita este passo para todas as amostras. NOTA: As amostras de FCs não serão analisadas, pois servem apenas como controles.</li>
</ol>11. Preparação do painel de coloração de anticorpos para análise citofluormétrica
<ol><li>Adicione 1 mL de solução PBS para cada tubo e centrífuga por 10 minutos a 400 x g e 20 °C.</li>
	<li>Após a fase de centrifugação, descarte o supernatante. NOTA: O painel de coloração de anticorpos pode ser encontrado na Tabela 1. Cada concentração de anticorpos calculada é de cerca de 2 μL/amostra. Recomenda-se girar brevemente os tubos de anticorpos antes de usar. Para proteger os anticorpos conjugados fluoróforos da luz, todos os passos devem ser realizados no escuro.</li>
	<li>Prepare a mistura de anticorpos dentro de um tubo de 1,5 mL e vórtice.</li>
	<li>Adicione os anticorpos dentro das amostras e deixe amostras para incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS em cada amostra e centrífuga por 10 min a 400 x g e 20 °C.</li>
	<li>Descarte o supernatante e suspenda a pelota com 500 μL de solução PBS.</li>
	<li>Proceder com a análise citofluormétrica (análise FACS, Tabela 1). NOTA: As amostras manchadas podem ser fixadas utilizando 0,5% de paraformaldeído (PFA) diluído em solução PBS e analisado até 15 dias depois. ATENÇÃO: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Marcador</td>
			<td>Fluoróforo</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Violeta brilhante 510</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>Violeta brilhante 421</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>Violeta brilhante 711</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Painel de coloração de anticorpos para detectar a população de linfócitos T em doença da válvula aórtica de calcificação.

<ol><li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+valvular+heart+diseases%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li>
<li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aortic+valve+calcification%2C+as+measured+by+MDCT%2C+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis%3A+results+of+an+international+registry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li>
<li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+outcome+in+severe%2C+asymptomatic+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li>
<li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis%3A+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement%3A+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li>
<li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+%28TAVI%29-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Revascularization+Medicine%22%5BJournal%5D)">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li>
<li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAVI+for+low-flow%2C+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%3A+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+%28GARY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Intervention+Journal%22%5BJournal%5D)">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li>
<li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+%28TAVI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers%22%5BJournal%5D)">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation%3A+%22on-label%22+versus+%22off-label%22+use+of+TAVR+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+valve-in-valve+implantation+%28VinV-TAVR%29+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li>
<li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+Aortic+Valve+Disease%3A+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li>
<li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+infiltration%2C+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li>
<li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li>
<li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li>
<li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta%3A+Study+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+journal+of+the+Islamic+Republic+of+Iran%22%5BJournal%5D)">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).</li>
<li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methodsin+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li>
<li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Different+Functional+Distribution+of+%22Not+Effector%22+T+Cells+%28Treg%2FTnull%29+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).</li>
<li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li>
<li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li>
<li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H%2B%2C+K%2B+--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li>
<li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+%28CpPLD%29+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Procceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células alimentadoras e for...

A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população idosa1.
A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão do CAVD e a alta mortalidade está associada ao início precoce dos sintomas, a menos que seja realizada a substituição da válvula aórtica (AVR). Em pacientes com estenose aórtica aórtica sintomática grave, a sobrevida sem sintomas de 3 anos foi relatada como baixa de 20%3. A substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR) representa uma nova opção, revolucionando o tratamento para pacientes de alto risco, especialmente entre os idosos e reduziu drasticamente a mortalidade, que era intrinsecamente alta nessa população4,5,6. Apesar dos resultados promissores do TAVR, novas pesquisas são necessárias para entender a fisiopatologia CAVD para identificar novos alvos terapêuticos precoces7,8,9.
Antes considerado um processo passivo e degenerativo, o CAVD é agora reconhecido como uma doença progressiva ativa, caracterizada por um interruptor de fenótipo osteoblástico das células intersticiais da válvula aórtica10. Esta doença envolve mineralização progressiva, alterações fibrocalcísicas e redução da motilidade dos folhetos da válvula aórtica (esclerose), que acabam por obstruir o fluxo sanguíneo levando ao estreitamento (estenose) da abertura da válvula aórtica11.
A inflamação é considerada um processo-chave na fisiopatologia CAVD, semelhante ao processo de aterosclerose vascular. A lesão endotelial permite a deposição e o acúmulo de espécies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas na válvula aórtica12. Essas lipoproteínas oxidadas provocam uma resposta inflamatória, por serem citotóxica, com a atividade inflamatória levando à mineralização. O papel da imunidade inata e adaptativa no desenvolvimento da CAVD e na progressão da doença foi recentemente destacado13. A ativação e a expansão clonal de subconjuntos específicos de células T de memória foram documentados em pacientes com CAVD e folhetos de válvulas aórticas mineralizados, de modo que os processos inflamatórios são assumidos como envolvidos pelo menos no desenvolvimento do CAVD e, presumivelmente, na progressão da doença também14. De fato, embora as células e macrófagos que apresentem antígenos estejam presentes tanto na válvula saudável quanto na doença, a presença de linfócitos T é indicativa de uma válvula aórtica envelhecida e doente. Este infiltrado linfocítico junto com um aumento na neovascularização e metaplasia são sinais histológicos característicos do CAVD15.
Nós hipótesemos a existência de uma interação entre as células interstices da válvula aórtica e a ativação do sistema imunológico, o que potencialmente desencadeia o início de um processo inflamatório crônico na válvula aórtica. O ensaio das células T a partir do tecido da válvula aórtica estótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação, pois pode fornecer uma representação próxima das células válvulas aórticas in vivo. No presente trabalho, utilizando tecido da válvula aórtica, isolamos linfócitos T, cultura e cloná-los, e posteriormente os caracterizamos usando a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS). Amostras frescas de válvulas aórticas foram excisadas de pacientes cavd que receberam substituição da válvula cirúrgica para estenose aórtica grave. Após a excisão cirúrgica, a amostra de válvula fresca foi dissecada em pequenos pedaços e as células T foram cultivadas, clonadas e então analisadas por citometria de fluxo. O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os dados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações na distribuição de linfócitos T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subconjuntos específicos de células T de interesse.
A extração de tecido calcificado, o isolamento de leucócitos do tecido calcificado e, particularmente, o uso de citometria de fluxo neste tipo de tecido podem ser desafiadores, devido a questões como a autofluorescência. Poucas publicações existem com protocolos para este propósito específico16,17,18. Aqui apresentamos um protocolo projetado especificamente para o isolamento direto e cultura do linfócito T a partir de amostras de válvulas aórticas humanas. A expansão clonal de linfócitos é uma marca registrada da imunidade adaptativa. Estudar esse processo in vitro fornece informações perspicazes sobre o nível de heterogeneidade linfócito19. Após um período de incubação de três semanas, os clones de células T estão prontos para serem explantados, pois uma quantidade adequada de células T de cada clone foi obtida, de modo a permitir o estudo fenotípico e funcional. Posteriormente, o fenótipo dos clones T é estudado por citofluorometria.
Este protocolo imunológico é uma adaptação de um método anteriormente desenvolvido pela Amedei et al. para isolamento celular T e caracterização do tecido humano, especialmente projetado para tecido humano calcificado, como em CAVD20,21,22. O protocolo aqui para o isolamento de PBMCs (células mononucleares de sangue periféricos) usando casaco de buffy irradiado descreve uma maneira eficaz de obter células alimentadoras (FC), especificamente ajustadas para a fase de clonagem de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula. A camada alimentador consiste em células presas em crescimento, que ainda são viáveis e bioativas. O papel das células alimentadoras é importante para apoiar a sobrevivência in vitro e o crescimento de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula23. Para evitar a proliferação de células alimentados na cultura, essas células devem sofrer uma parada de crescimento. Isso pode ser alcançado de duas maneiras: através de métodos físicos como a irradiação, ou através do tratamento com produtos químicos citotóxicos, como a mitomicina C (MMC), um antibiótico antitumoral que pode ser aplicado diretamente à superfície da cultura24. Aqui mostramos a prisão de crescimento celular alimentador alcançada através da irradiação celular.
Este método apresenta uma maneira eficiente e econômica de isolar e caracterizar células T a partir do tecido da válvula aórtica, contribuindo para a ampliação do espectro de métodos imunológicos para a exploração da fisiopatologia CAVD.

<table><tbody><tr><td>Seringas de plástico de 50 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96- poços Placas Multiwell de fundo em U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>Bag Spike (sem agulha)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluir a 4% com PBS</td></tr><tr><td>CD14 Violeta brilhante 421</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE&</td><td>nbsp; Biolegend</td><td>302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE/Cy7</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Violeta brilhante 711</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Violeta brilhante 510</td><td>&nbsp; Tubo Eppendorf</td><td>301047</td><td></td>Biolegend</tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubo 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo de centrífuga cônico de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL Falcon</td><td></td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de poliestireno de fundo redondo</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>Leitura rápida 102 câmara de contagem de plástico</td><td>KOVA INTERNATIONAL</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para meio de cultura 250 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para meio de cultura 500 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 Suplemento liofilizado</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB Basal Medium</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inativado por Calor (Soro Fetal Bovino)</td> <td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>HS (Soro Humano)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>PHA (fitohemaglutinina)</td><td>Célula-tronco Tecnologias</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de Plástico</td><td>Thermo Scientific</td><td>R80115TS</td><td>10 0mm x 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Mídia</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco da Life technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa 0,45&micro; l</td><td>Rotilabo-Spritzenfilter</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Balões de cultura de células</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Balão de cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos t usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR). 
As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).
O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.

Utilizamos um método simples e econômico para caracterizar a população leucócito de amostras frescas de válvulas aórticas derivadas de pacientes humanos com estenose de válvula aórtica grave (consulte o protocolo). O método de isolar os PBMCs é um passo vital na obtenção de células alimentadoras, que são usadas em todas as etapas do experimento (clonagem, realimentação e divisão de fases) e permitem a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Os passos-chave deste método são mo...

Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Este protocolo é fácil de executar. A fase de clonagem permite que um número maior de clones T seja obtido a partir de amostras frescas. Além disso, o fenótipo e a função das células T podem ser facilmente analisados.Demonstrando o procedimento estará Mary Christopher, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir a clonagem de células T, use o espeto do saco com a válvula livre de agulha para abrir um saco de casaco de buffy irradiado em uma capa de fluxo laminar. Transfira até 50 mililitros de sangue do saco para um frasco T-150, e adicione 70 mililitros de PBS ao frasco.Cuidadosamente camada 30 mililitros do sangue diluído em 20 mililitros de gradiente de densidade em cada um dos quatro tubos cônicos de 50 mililitros, e separar as células por centrifugação gradiente de densidade. Aspire cuidadosamente o supernasal e transfira o PBMC de cada tubo para um único tubo de 50 mililitros. Use o PBS para levar o volume final a 50 mililitros e coletar o PBMC por centrifugação.Após uma segunda lavagem sob as mesmas condições, suspenda as células alimentadores isoladas em 10 mililitros de cultura celular para contagem, e adicione 25 mililitros de um meio de cultura celular de 70 mililitros complementado com 50 unidades de solução IL-2 em cada um dos dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, adicione células alimentadoras a um tubo a 2 por 10 a 6ª células por mililitro de cultura celular complementada com concentração de IL-2. Para configurar uma cultura de linfócitos T, junte o clone de células T contendo supernantes da amostra de válvula estenótica em um único tubo de 50 mililitros, e colete as células por centrifugação.Lave a pelota três vezes em 50 mililitros de PBS por lavagem, antes de reutilizar as células em 1 mililitro de meio de cultura celular para contar. Diluir as células a uma 1 por 10 a 3ª células por concentração de mililitro, e adicionar 500 microlitres de células ao tubo de cultura celular meio suplementado com IL-2 sem células alimentadores. Adicione a suspensão da célula alimentadora a uma placa de plástico 100 por 15 mililitros de Petri, e adicione 100 microliters de células alimentadoras a cada poço do número apropriado de placas de 96 poços para o experimento.Em seguida, adicione as células T a uma placa de Petri, e adicione 100 microliters de células T a cada célula alimentadora complementada bem para uma incubação de uma semana na incubadora de cultura celular. O isolamento do PBMC é vital para a obtenção de células alimentadoras e para permitir a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Após duas semanas de incubação, uma população de células T clones pode ser obtida.Aqui, mostra-se o esquema de gating para análise de subpopulações de células T em pacientes com doença da válvula aórtica calcificada. Como observado neste paciente, havia mais células CD4+T do que células CD8+T. A análise citométrica de fluxo de células T nãocloadas confirma que os mesmos marcadores de células T estão presentes em amostras nativas de válvulas e clones.Juntos, esses dados indicam que as células T estão presentes em válvulas aórticas calcificadas com CD45+leucócitos, sugerindo que a doença da válvula aórtica calcifica está ligada à ativação do sistema imunológico e à atividade inflamatória. Este método é muito versátil. Pode ser aplicado a diferentes protocolos para os quais o pesquisador precisa ser capaz de isolar células de um tecido, para a caracterização funcional.Tenha em mente que é importante trabalhar em condições estéreis para evitar contaminação, e observar criticamente as células sob o microscópio.

investigating-aortic-valve-calcification-via-isolation-culture-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células intersticiais da válvula aórtica do coração de um camundongo adulto usando um procedimento de colagenase em duas etapas e sua subsequente cultura em meio de crescimento de baixo volume.

Isolamento de células intersticiais da válvula de camundongo: um método enzimático para isolar e cultivar VICs da válvula aórtica de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para avaliar a calcificação arterial medial das células musculares lisas vasculares in vitro. O método von Kossa emprega uma reação fotoquímica para depositar prata metálica nos locais de calcificação e conferir uma coloração preta.

Coloração de Von Kossa de células musculares lisas vasculares da aorta: uma técnica in vitro para avaliação da calcificação da camada medial arterial

Este vídeo demonstra uma técnica de ensaio para avaliar a calcificação das células intersticiais da válvula aórtica in vitro. O ensaio ajuda a quantificar a concentração de cálcio usando o reagente arsenazo III, um corante sensível ao cálcio que reage com íons de cálcio para formar um complexo cálcio-arsenazo de cor roxa.

Ensaio de calcificação para medir a concentração de cálcio em células intersticiais da válvula aórtica

A calcificação vascular é um importante preditor e contribuinte para doenças cardiovasculares humanas. Este protocolo descreve métodos para induzir calcificação de células musculares lisas vasculares primárias cultivadas e para quantificar a calcificação e a carga de macrófagos em aortas de animais usando imagens de fluorescência no infravermelho próximo.

Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Este artigo fornece metodologia detalhada para identificar e quantificar os subconjuntos de linfócitos T funcionais presentes dentro de rim murino, aorta e linfonodos por coloração intracelular e citometria de fluxo. O modelo de hipertensão induzida por angiotensina II foi escolhido para explicar, passo-a-passo, os procedimentos e os princípios fundamentais da citometria de fluxo e coloração intracelular.

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Aprenda a isolar e clonar linfócitos T de tecido valvar aórtico calcificado usando células alimentadoras de casaco de buffy irradiado. Este método permite analisar subpopulações de células T por citometria de fluxo para estudar a doença valvar aórtica calcificada.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado (Vídeo) | JoVE Journal

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

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