Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização
23 de dezembro de 2020
Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.
Este protocolo possibilitou a visualização do RNA do SARS-CoV-2 em linhagens celulares e em culturas tridimensionais de epitélio das vias aéreas humanas totalmente diferenciadas, fornecendo uma ferramenta para entender melhor a patogênese e a replicação viral no nível de uma única célula. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e resolução, este método é útil não apenas para estudos científicos básicos do SARS-coronavírus-2, mas também para projetos de aplicação, como diagnósticos. Demonstrando o procedimento estará Agnieszka Suder, uma estudante de doutorado do meu laboratório.
Depois de fixar e permeabilizar as células conforme descrito no manuscrito do texto, remova a solução 1X PBS dos poços e adicione pelo menos 300 microlitros de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras durante 30 minutos à temperatura ambiente. Prepare cada grampo de cabelo HCR resfriando o volume desejado em tubos separados.
Para preparar 300 microlitros de solução de amplificação, use 18 picomoles de cada grampo de cabelo. Transfira a solução em grampo para tubos e incube-os a 95 graus Celsius por 90 segundos. Em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.
Prepare uma mistura de grampos de cabelo adicionando os grampos de cabelo H1 e H2 resfriados por pressão ao tampão de amplificação. Coloque gotas de 30 a 50 microlitros da mistura de grampos de cabelo no Parafilm. Coloque as lamínulas com células nas gotas da mistura de grampos de cabelo e incube as amostras durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
Para montar as lâminas, coloque duas gotas de 10 microlitros de meio de montagem em uma lâmina, certificando-se de que as gotas estejam separadas o suficiente para permitir que duas lamínulas sejam colocadas em uma única lâmina. Remova o excesso de líquido batendo nas lamínulas em uma toalha limpa. Em seguida, coloque-os em um meio de montagem antidesbotamento com as células voltadas para baixo.
Coloque as amostras montadas em uma superfície plana e seca no escuro e deixe-as curar. Após fixar e permeabilizar as células HAE conforme descrito no manuscrito do texto, pré-amplificar as amostras incubando-as com tampão de amplificação por 30 minutos em temperatura ambiente. Use 30 picomoles de cada grampo de cabelo para preparar 500 microlitros de solução de amplificação.
Transfira a solução de grampo de cabelo para os tubos e incube-os a 95 graus Celsius por 90 segundos. Em seguida, resfrie-os à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Prepare a solução de grampo de cabelo adicionando todos os grampos de cabelo resfriados a 500 microlitros de tampão de amplificação em temperatura ambiente.
Remova a solução de pré-amplificação e adicione a solução completa de grampo de cabelo. Em seguida, incube as amostras durante a noite em temperatura ambiente no escuro. Coloque a membrana recortada das inserções Transwell em 10 microlitros de meio de montagem antidesbotamento com as células voltadas para cima e adicione meio de montagem extra à membrana.
Em seguida, cubra as membranas com lamínulas. Este protocolo de imuno-RNA-FISH foi realizado em dois sistemas celulares, uma linhagem celular Vero e uma cultura de epitélio de vias aéreas humanas 3D. A localização do RNA subgenômico do SARS-coronavírus-2 em células Vero infectadas e inoculadas simuladas é mostrada aqui.
O RNA viral pode ser visto em vermelho. A localização do RNA subgenômico do SARS-coronavirus-2 em células epiteliais das vias aéreas humanas infectadas e simuladas é mostrada aqui. O protocolo de permeabilização foi otimizado em células Vero.
A permeabilização com detergente resulta em um sinal claro e específico para o RNA subgenômico do SARS-coronavírus-2, enquanto o uso de etanol resulta em uma imagem borrada e desfocada. Ao montar as lâminas com células Vero, é importante colocar uma lamínula com as células voltadas para baixo. Ao montar as lâminas HAE, a membrana precisa ser colocada com as células voltadas para cima.
Essa técnica pode ser facilmente modificada para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificantes e vírus de RNA que possam surgir no futuro. Juntamente com a imunofluorescência, pode ser usado para estudar as interações proteína-RNA no nível de célula única.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método que integra a hibridização in situ de fluorescência de RNA (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar o RNA do SARS-CoV-2. Esta abordagem melhora a compreensão das interações RNA-hospedeiro do SARS-CoV-2 a nível de célula única.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Virologia
- Biologia Celular
Fundo
- Entender a patogênese viral é crucial para desenvolver diagnósticos e tratamentos eficazes.
- O SARS-CoV-2 tem implicações significativas para a saúde pública.
- Visualizar o RNA a nível de célula única pode fornecer insights sobre a replicação viral.
- Combinar RNA-FISH com imunofluorescência oferece alta especificidade e sensibilidade.
Propósito do Estudo
- Visualizar o RNA do SARS-CoV-2 em vários modelos celulares.
- Melhorar a compreensão das interações virais dentro das células hospedeiras.
- Fornecer uma ferramenta para pesquisa básica e aplicada em virologia.
Métodos Utilizados
- Fixação e permeabilização de células.
- Aplicação de buffer de amplificação para visualização do RNA.
- Uso de hairpins HCR para detecção específica de RNA.
- Técnicas de imunofluorescência para complementar RNA-FISH.
Principais Resultados
- O RNA do SARS-CoV-2 foi visualizado com sucesso em linhagens celulares e culturas de epitélio das vias aéreas humanas.
- O método demonstrou alta especificidade e sensibilidade.
- Os resultados contribuem para uma melhor compreensão da patogênese viral.
- Este protocolo é aplicável para fins de pesquisa e diagnóstico.
Conclusões
- O método combinado é eficaz para estudar o SARS-CoV-2 a nível de célula única.
- Fornece insights valiosos sobre as interações RNA-hospedeiro.
- Esta abordagem pode auxiliar no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
