Name: Dna-Tethered RNA Polymerase para Transcrição In vitro Programável e Computação Molecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a regular a atividade da T7 RNA polimerase usando fatores de transcrição de ácidos nucleicos artificiais. Este método combina a escalabilidade de circuitos de DNA com a funcionalidade da regulação transcricional.

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L.Y.T.C reconhece o generoso apoio do New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant e da University of Toronto's Medicine by Design Initiative, que recebe financiamento do Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

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<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
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<li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li>
<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
<li>Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li>
</ol>

Não há interesses financeiros concorrentes para declarar por nenhum dos autores.

Este estudo demonstra uma abordagem inspirada em nanotecnologia de DNA para controlar a atividade da polimerase T7 RNA, acoplando um T7 RNAP recombinante com marca DE-T7 com um oligonucleotídeo funcionalizado pela BG, que foi posteriormente usado para programar reações TMDSD. Por design, a tag SNAP foi posicionada no N-terminus da polimerase, já que o C-terminus do tipo selvagem T7 RNAP está enterrado dentro do núcleo da estrutura proteica e faz contatos importantes com o modelo de DNA28. Tentativ...

A computação em DNA usa um conjunto de oligonucleotídeos projetados como meio de computação. Esses oligonucleotídeos são programados com sequências para serem montados dinamicamente de acordo com a lógica especificada pelo usuário e responder a entradas específicas de ácido nucleico. Em estudos de prova de conceito, a saída da computação normalmente consiste em um conjunto de oligonucleotídeos fluorescentes rotulados que podem ser detectados através de leitores de eletroforese de gel ou fluorescência. Ao longo dos últimos 30 anos, foram demonstrados circuitos computacionais de DNA cada vez mais complexos, como várias cascatas lógicas digitais, redes de reação química e redes neurais1,2,3. Para auxiliar na preparação desses circuitos de DNA, modelos matemáticos têm sido usados para prever a funcionalidade dos circuitos genéticos sintéticos4,5, e ferramentas computacionais foram desenvolvidas para o projeto de sequência de DNA ortogonal6,7,8,9,10 . Em comparação com computadores baseados em silício, as vantagens dos computadores de DNA incluem sua capacidade de interagir diretamente com biomoléculas, operar em solução na ausência de uma fonte de alimentação, bem como sua compactação e estabilidade globais. Com o advento do sequenciamento da próxima geração, o custo de sintetizar computadores de DNA vem diminuindo nas últimas duas décadas a uma taxa mais rápida do que a Lei11de Moore. As aplicações desses computadores baseados em DNA estão começando a surgir, como para o diagnóstico de doenças12,13, para alimentar a biofísica molecular14, e como plataformas de armazenamento de dados15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figura 1: Mecanismo de deslocamento da cadeia de DNA mediado por toehold. O toehold, δ, é uma sequência livre e desvinculada em um duplex parcial. Quando um domínio complementar (δ*) é introduzido em uma segunda vertente, o domínio δ livre serve como um toehold para hibridização, permitindo que o resto da cadeia (ônica*) desloque lentamente seu concorrente através de uma reação reversível zipping/unzipping conhecida como migração de fios. À medida que o comprimento do δ aumenta, o ΔG para a reação para a frente diminui, e o deslocamento acontece mais facilmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Até o momento, a maioria dos computadores de DNA utilizam um motivo bem estabelecido no campo da nanotecnologia dinâmica de DNA conhecida como deslocamento de fios de DNA mediados por toehold (TMDSD, Figura 1)16. Este motivo consiste em um duplex de DNA parcialmente duplo (dsDNA) exibindo saliências curtas de "toehold" (ou seja, 7 a 10 nucleotídeos (nt)). Os fios de "entrada" de ácido nucleico podem interagir com os duplexes parciais através do dedo do dedo do sol. Isso leva ao deslocamento de um dos fios do duplex parcial, e este fio liberado pode então servir como entrada para duplexes parciais a jusante. Assim, o TMDSD permite a cascata de sinais e o processamento de informações. Em princípio, os motivos ortogonais de TMDSD podem operar de forma independente na solução, permitindo o processamento paralelo de informações. Houve uma série de variações na reação TMDSD, como a troca de fios de DNA mediada por toehold (TMDSE)17, toeholds "sem vazamento" com domínios de dois comprimentos18, dedos incompatíveis de sequência19e deslocamento de fios mediados por "handhold"20. Esses princípios inovadores de design permitem energias tmdsd mais finamente ajustadas e dinâmicas para melhorar o desempenho da computação de DNA.
Circuitos genéticos sintéticos, como circuitos genéticos transcricionais, também são capazes de calcular21,22,23. Esses circuitos são regulados por fatores de transcrição proteica, que ativam ou reprimem transcrição de um gene ligando-se a elementos específicos de DNA regulatório. Comparados com circuitos baseados em DNA, circuitos transcricionais têm várias vantagens. Em primeiro lugar, a transcrição enzimática tem uma taxa de rotatividade muito maior do que os circuitos de DNA catalíticos existentes, gerando assim mais cópias de saída por cópia única de entrada e fornecendo um meio mais eficiente de amplificação de sinal. Além disso, circuitos transcricionais podem produzir diferentes moléculas funcionais, como aptamers ou codificação de RNA (mRNA) mensageiro para proteínas terapêuticas, como saídas de computação, que podem ser exploradas para diferentes aplicações. No entanto, uma grande limitação dos circuitos transcricionais atuais é a falta de escalabilidade. Isso ocorre porque há um conjunto muito limitado de fatores de transcrição ortogonais baseados em proteínas, e o novo desenho de novos fatores de transcrição proteica permanece tecnicamente desafiador e demorado.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figura 2: Abstração e mecanismo do complexo de polimerase "tether" e "cage" ( A e B) Uma corda oligonucleotídeo é enzimáticamente rotulada para uma polimerase T7 através da reação snap-tag. Uma gaiola composta por um promotor T7 "falso" com uma saliência complementar de tether permite hibridizar a atividade transcricional de corda e bloco. (C) Quando o operador(a*b*) está presente, ele se liga ao toehold sobre a corda oligonucleotídeo(ab)e desloca a região b* da gaiola, permitindo que a transcrição ocorra. Este número foi modificado de Chou e Shih27. Abreviaturas: RNAP = RNA polymerase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Este artigo introduz um novo bloco de construção para computação molecular que combina as funcionalidades dos circuitos transcricionais com a escalabilidade dos circuitos baseados em DNA. Este bloco de construção é um T7 RNAP covalentemente anexado com uma corda de DNA de um único fio(Figura 2A). Para sintetizar este T7 RNAP ligado ao DNA, a polimerase foi fundida a um SNAP-tag24 n-terminal e recombinantemente expressa em Escherichia coli. A tag SNAP foi então reagida com um oligonucleotídeo funcionalizado com o substrato BG. A corda oligonucleotídeo permite o posicionamento de hóspedes moleculares nas proximidades da polimerase através da hibridização do DNA. Um desses convidados foi um bloqueador transcricional competitivo referido como uma "gaiola", que consiste em um duplex de DNA "falso" do promotor T7 sem gene a jusante(Figura 2B). Quando vinculada ao RNAP através de sua corda oligonucleotídeo, a gaiola paralisa a atividade de polimerase, superando outros modelos de DNA para a vinculação RNAP, tornando o RNAP em um estado "OFF"(Figura 2C).
Para ativar a polimerase a um estado "ON", foram projetados modelos de DNA T7 com domínios "operadores" de uma única linha a montante do promotor T7 do gene. O domínio do operador (ou seja, domínio a*b* Figura 2C) pode ser projetado para deslocar a gaiola do RNAP via TMDSD e posicionar o proximal RNAP ao promotor T7 do gene, iniciando assim a transcrição. Alternativamente, foram projetados modelos de DNA onde a sequência do operador era complementar aos fios auxiliares de ácido nucleico que são chamados de "fatores de transcrição artificial" (ou seja, fios TFA e TFB na Figura 3A). Quando ambas as vertentes forem introduzidas na reação, elas se reunirão no site do operador, criando um novo domínio pseudo-contíguo a*b*. Este domínio pode então deslocar a gaiola via TMDSD para iniciar a transcrição(Figura 3B). Estes fios podem ser fornecidos exogenously ou produzidos.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figura 3: Programação seletiva da atividade de polimerase através de um ativador de interruptor de três componentes. (A) Quando os fatores de transcrição (TFA e TFB) estão presentes, eles se ligam ao domínio do operador a montante do promotor, formando uma sequência pseudo de uma única-strand(a*b*) capaz de deslocar a gaiola através do deslocamento mediado do DNA. (B) Este domínio a*b* pode deslocar a gaiola via TMDSD para iniciar a transcrição. Este número foi modificado de Chou e Shih27. Abreviaturas: TF = fator de transcrição; RNAP = polimerase de RNA; TMDSD = deslocamento de fios de DNA mediados por toehold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O uso de fatores de transcrição nucleicos baseados em ácido para regulação transcricional in vitro permite a implementação escalável de comportamentos sofisticados de circuito, como lógica digital, feedback e cascata de sinais. Por exemplo, pode-se construir cascatas lógicas do portão projetando sequências de ácido nucleico de tal forma que as transcrições de um gene a montante ativam um gene a jusante. Uma aplicação que explora a cascata e multiplexing capazes por essa tecnologia proposta é o desenvolvimento de circuitos de computação molecular mais sofisticados para diagnósticos portáteis e processamento de dados moleculares. Além disso, integrar os recursos de computação molecular e síntese de novo RNA pode permitir novas aplicações. Por exemplo, um circuito molecular pode ser projetado para detectar uma ou uma combinação de RNAs definidas pelo usuário como insumos e saída de RNAs terapêuticos ou mRNAs codificando peptídeos funcionais ou proteínas para aplicações médicas de ponto de cuidado.

<table><tbody><tr><td>0,5% polissorbato 20 (TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0,5M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Bio Basic</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7)</td><td>Bio Basic</td><td>PD0435</td><td>Comprimidos usados para fazer 10 mM tampão</td></tr><tr><td>10% persulfato de amônio (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrífugo Unidade de Filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% acetona</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td> <td>Marca da casa</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão de transcrição in vitro (IVT)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão Tris-Borato-EDTA (TBE)</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M Isopropil &beta;- d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M tampão de bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X Tris-EDTA (TE) tampão</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (BME)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M acetato de sódio</td><td>Bio Basic</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida 40% (19: 1)</td> <td>Bio Basic</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS tampão de carregamento de amostra de proteína</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x corante de carregamento de gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>agarose B em pó</td><td>Bio Basic</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>New England Biolabs</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 competente E. coli Addgene</td><td></td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye pré-fabricada escada de proteína</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>azul coomassie (SimplyBlue SafeStain)</td><td>Corante de</td> cianina <td>ThermoFisher LC6060</td><td></td></tr><tr><td>(corante de gel de ácido nucleico SYBR Gold)</td><td>Corante</td> de cianina <td>Fisher Scientific S11494</td><td></td></tr><tr><td>(corante de gel de ácido nucleico seguro SYBR</td>)<td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido seco (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bio Basic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de canamicina</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>caldo de lisogenia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>malaquita oxalato verde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'N'-Tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS tampão de corrida (20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1,0 mm 12-well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>oligonucleotídeo (gaiola antisense)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo ( cage sense)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo (aptâmero verde malaquita antisense)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo (malaquita verde aptâmero sense)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo (Fator de Transcrição A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Agtacaccaactacgagtgag</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo (Fator de Transcrição B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo com 3' Modificação de amina (amarra)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce colunas de spin de troca iônica forte</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo que codifica genes de resistência SNAP T7 RNAP e canamicina</td><td>Genscript</td><td>N/A</td> coluna de purificação de proteína <td>de inserção de gene personalizado</td></tr><tr><td>(coluna de rotação HisPur Ni-NTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>rNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche mini coluna de rotação rápida de DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA de alcance ultrabaixo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>ureia</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-tethered rna polymerase para transcrição in vitro programável e computação molecular

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

A nanotecnologia de DNA permite a automontagem programável de ácidos nucleicos em formas e dinâmicas prescritas pelo usuário para diversas aplicações. Este trabalho demonstra que conceitos da nanotecnologia de DNA podem ser usados para programar a atividade enzimática da polimerase T7 RNA (RNAP) derivada de phage e construir redes de regulação genética sintética escalável. Primeiro, um T7 RNAP com oligonucleotídeo é projetado através da expressão de um RNAP com marca SNAP n-terminal e posterior acoplamento químico da tag SNAP com um oligonucleotídeo modificado por benziloguanina (BG). Em seguida, o deslocamento da cadeia nucleico-ácido é usado para programar transcrição de polimerase sob demanda. Além disso, conjuntos auxiliares de ácido nucleico podem ser usados como "fatores de transcrição artificial" para regular as interações entre o T7 RNAP programado pelo DNA com seus modelos de DNA. Este mecanismo de regulação de transcrição in vitro pode implementar uma variedade de comportamentos de circuito, como lógica digital, feedback, cascata e multiplexing. A composabilidade dessa arquitetura normativa genética facilita a abstração, padronização e escala do design. Esses recursos permitirão a prototipagem rápida de dispositivos genéticos in vitro para aplicações como biosensação, detecção de doenças e armazenamento de dados.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figura 5: Análise SDS-PAGE da expressão SNAP T7 RNAP e ensaio de transcrição in vitro. (A) ANÁLISE DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SNAP T7 RNAP, PESO molecular SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = fluxo-through da coluna, W1 = frações de eluição de tampão de lavagem contendo impurezas, E1-3 = frações de eluição contendo produto purificado, e DE = 10x dil...

Descrevemos a engenharia de uma nova polimerase T7 RNA com DNA para regular reações de transcrição in vitro. Discutimos os passos para a síntese e caracterização proteica, validamos a regulação transcricional de prova de conceito e discutimos suas aplicações em computação molecular, diagnóstico e processamento de informações moleculares.

Dna-Tethered RNA Polymerase para Transcrição In vitro Programável e Computação Molecular

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Propomos um método para regular a atividade de polimerase usando fatores artificiais de transcrição de ácido nucleico. Esta arquitetura reguladora genética pode servir como um bloco de construção para futuros dispositivos genéticos in vitro. Ao amarrar um domínio de ligação de DNA a uma polimerase T7 RNA, esta técnica combina a escalabilidade de circuitos baseados em DNA, com a funcionalidade de circuitos transcricionais.Comece fazendo nove diluições de oligonucleotídeo BG de um único fio para um volume final de 50 microliters de água dupla destilada, de cinco para um a cinco proporções, como indicado na tabela. Prepare uma mistura de reação para cada diluição misturando dois microliters de tampão SNAP com quatro microliters de oligonucleotídeo BG e quatro microliters de SNAP T7 RNAP. Prepare o controle RNAP substituindo o oligonucleotídeo por água dupla destilada, e o controle de DNA substituindo o SNAP T7 RNAP por água dupla destilada.Configure 11 reações adicionando dois microliters de cada amostra a quatro microliters de buffer SNAP, e dois microliters de corante de carga de proteína por amostra. Aqueça as reações por 10 minutos a 70 graus Celsius, antes de carregar dois microlitadores de cada amostra em um gel de proteína de quatro a 12% vitreous por 35 minutos de eletroforese de gel no gelo a 200 volts. No final da corrida, lave o gel com três trocas de água em um shaker por pelo menos 10 minutos por lavagem, seguido de coloração de ácido nucleico com corante de cianinina por 15 minutos.Imagem do gel em um sistema de imagem de gel apropriado, e manche o gel novamente com 20 mililitros de azul Coomassie. Após uma hora, des colorigar com água dupla destilada por pelo menos uma hora antes de imagem do gel novamente. Para purificação SNAP T7 de oligonucleotídeo, primeiro, prepare o tampão de elução misturando 50 microliters de um traço molar, com 100 microliters de cinco cloreto de sódio molar, com 850 microliters de água dupla destilada.Em seguida, coloque uma coluna de troca de íons por amostra em dois tubos de centrífugas mililitros e lave as colunas com tampão de purificação por centrifugação até que todo o buffer tenha sido elucido de cada coluna. Diluir cada amostra com tampão de purificação em um tampão de purificação de três para um para a razão da amostra, e carregar 400 microliters de amostra em cada coluna. Quando todo o buffer tiver sido elucido como demonstrado, colete e rotule o fluxo através de cada amostra.Lave as colunas três vezes com 400 microliters de tampão de purificação por lavagem até que todo o buffer tenha sido elucido por lavagem, coletando e rotulando as vias de fluxo conforme apropriado. Após a última lavagem, colete a proteína elucida adicionando 50 microliters de tampão de elução no centro da coluna, e centrifugando a coluna três vezes até que todos os 50 microliters de tampão tenha sido elucido. Colete e rotule o elto após cada centrifugação, agrupando o elto em um único tubo após a última centrifugação, deixando um pequeno volume de cada elute para análise de gel.Meça a absorção dos alíquotas de elute restantes em 260 e 280 nanômetros, e adicione glicerol às amostras em uma proporção de um para um para menos 20 graus de armazenamento até o seu uso. Use uma unidade de filtro centrífrico de 500 microliter de 30 quilodalton para tampão trocar o produto elute total com buffer de armazenamento 2x. E medir a absorvência como demonstrado.Em seguida, adicione glicerol ao produto em uma proporção de um para um para menos 20 graus Celsius de armazenamento. Para avaliar os elutos por SDS-PAGE, execute as amostras em uma escada proteica apropriada em um gel de quatro a 12% vítreo por 35 minutos a 200 volts, ou até que a frente de corante migre até o final do gel. Para demonstrar a atividade de controle sob demanda do RNAP amarrado, misture 2,4 microliters de cada modelo com cinco microliters de tampão de 5x e 14,2 microliters de água dupla destilada.Incubar a gaiola de DNA de dois fios de micromolar a 75 graus Celsius por dois minutos. E anneal o sentido e as cepas anti-sentido do promotor e modelo de DNA de aptamer verde malachita da mesma maneira indicada na tabela. No final das incubações, adicione o SNAP T7 RNAP amarrado à gaiola de DNA duplamente encalhada em uma razão molar de um a cinco para uma concentração final de 500 RNAP nanomolar.Depois de 15 minutos em temperatura ambiente, coloque a amostra no gelo, e misture 2,5 microlitadores de 10x tampão de transcrição in vitro com um microlitr de 25 milionolars de triptosfato de ribonucleoídeos, um microlitra de um verde de malacita mililitro, 2,5 microliters da mistura RNAP CAGE, 2,5 microliters cada um de um fator de transcrição micromolar A e B oligonucleotídeos, fios de oligonucleotídeos, e três microliters de um modelo de aptamer verde malachite mililitro em 10 microliters de água dupla destilada. Em 15 microliters de água dupla destilada, configurou uma segunda reação contendo 2,5 microliters de 10x tampão de transcrição in vitro, um microliter de 25 milimolars de triptomulado, um microliter de um verde malachite mililitro, 2,5 microliters da mistura RNAP CAGE, e três microliters de um modelo de aptamer verde malachite de malachite de mililitro. Para configurar uma reação contendo apenas tampão, misture 2,5 microliters de 10x tampão de transcrição in vitro, um microliter de 25 milimonas ribonucleoside triphosfato mix, um microlitr de um verde malachite mililitro, e três microliters de um modelo de aptamer verde malita de mililitro em 17,5 microlit de água dupla destilada.Quando todas as reações tiverem sido preparadas, transfira cada reação para uma placa de 384 poços, e monitore a transcrição do aptamer verde malachita em um leitor de placa de fluorescência por duas horas a 37 graus Celsius a uma excitação de 610 nanômetros, e uma emissão de 655 nanômetros. No final da leitura, coloque a placa no gelo, e execute o produto RNA de cada poço em um gel poliacrílico desnaturing de 12%TBE-ureia em 70 graus Celsius TBE tampão a 280 volts por 20 minutos, ou até que a frente de corante atinja a extremidade do gel. Em seguida, colorir o gel com corante de cianina mancha de ácido nucleico por 10 minutos em um agitador orbital, antes da imagem como demonstrado.Uma expressão bem sucedida e purificação da proteína SNAP T7 RNAP recombinante pode ser confirmada usando SDS-PAGE. Após o SDS-PAGE, a atividade enzimática pode ser validada pela reação de transcrição in vitro. O acoplamento bem-sucedido de oligonucleotídeos funcionalizados da BG pode ser verificado através de 18% de desnaturação TBE-ure PAGE.Em comparação com o oligonucleotídeo não modificado, a adição da moiety BG ao oligonucleotídeo aumenta seu peso molecular. Como observado neste gel representativo de corante de cianina para confirmar a purificação T7 RNAP do excesso de oligonucleotídeos BG, o fluxo inicial através de fração continha principalmente ooligonucleotídeos bg em excesso, bem como uma pequena porção da polimerase amarrada ao DNA que não se ligava à resina de troca de cation. As frações de diluição da piscina continham apenas a única faixa de oligo RNAP causada pelo corante de cianinina que ligava à corda oligonucleotídeo, com a faixa de produto concentrada exibindo a mesma, mas banda mais escura significando uma alta concentração bem sucedida.Os mesmos padrões são observados pela coloração azul Coomassie, com uma pequena mudança de mobilidade de gel observada no controle RNAP não conjugado. Aqui, o sinal fluorescente produzido no final da transcrição in vitro em cinética em tempo real é mostrado. Nesta análise, observou-se ativação de 336 vezes no sinal de fluorescência, demonstrando um controle robusto da atividade de polimerase.Ao tentar este protocolo, lembre-se de lavar completamente o SDS do gel antes da coloração de ácido nucleico. Isso porque o STS vai prender o corante no gel, resultando em alto sinal de fundo. Aplicar nosso método a um grande circuito genético com múltiplas cascatas mostrará a escalabilidade e a composabilidade do sistema de transcrição amarrado.Esta técnica está sendo usada atualmente para desenvolver circuitos genéticos capazes de computação de estilo de rede neural.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

CRISPR / Cas sistemas mediato imunidade adaptativa em Bacteria e Archaea. Muitas proteínas Cas são propostos para agir como endoribonucleases actuam sobre precursores crRNA de comprimento variável. Aqui, ilustramos três abordagens diferentes para gerar pré-crRNA substratos para a análise bioquímica da actividade de endonuclease Cas.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

O origami de DNA é um método poderoso para fabricar objetos precisos em nanoescala, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui descrevemos um protocolo para o dobramento de um robô bio-responsivo a partir de origami de DNA, sua purificação e coloração negativa para imagens microscópicas eletrônicas de transmissão (TEM).

Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

Este protocolo descreve um método para derivar portas de deslocamento de fita de DNA de plasmídeos e testá-las usando medições de cinética de fluorescência. As portas podem ser compostas modularmente em sistemas multicomponentes para aproximar o comportamento de redes formais de reação química (CRN), demonstrando um novo uso para CRNs como linguagem de programação molecular.

Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

Partes genéticas bem caracterizadas são necessárias para o projeto de novos circuitos genéticos. Aqui descrevemos um método econômico e de alto rendimento para caracterizar rapidamente as partes genéticas. Nosso método reduz o custo e o tempo combinando lisatos livres de células, DNA linear para evitar a clonagem e manuseio de líquidos acústicos para aumentar o rendimento e reduzir os volumes de reação.

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

Apresentamos um protocolo para preparação de condensados biomoleculares sintéticos constituídos por nanoestrelas de DNA anfifílico a partir de seus oligonucleotídeos de DNA constituintes. Os condensados são produzidos a partir de um único componente de nanoestrela ou de dois componentes e são modificados para sustentar a transcrição in vitro de RNA a partir de um molde de DNA incorporado.

Condensados sintéticos e arquiteturas semelhantes a células de nanoestruturas de DNA anfifílico

Aprenda a regular a atividade da T7 RNA polimerase usando fatores de transcrição de ácidos nucleicos artificiais. Este método combina a escalabilidade de circuitos de DNA com a funcionalidade da regulação transcricional.

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