Name: Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a visualizar proteínas glomerulares com resolução nanométrica usando microscopia de expansão em microscópio convencional. Este método acessível alcança 70 nm de resolução para estudos detalhados de biologia celular.

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Os autores gostariam de agradecer a Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr por sua excelente assistência técnica.

1. Divisão e semeadura de células
<ol><li>Aqueça o Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco, incluindo soro de bezerro fetal de 10%, soro tamponado fosfato estéril (PBS) e trippsina estéril a 37 °C. Ative o banco limpo.</li>
	<li>Prepare uma placa de 6 poços adicionando um deslizamento de tampa de vidro estéril (10 mm) a cada poço usando fórceps estéreis.</li>
	<li>Coloque um prato de cultura celular de 10 cm com células Cos7 sob o banco limpo. Sob o banco limpo, aspire o meio das células usando um dispositivo de vácuo.</li>
	<li>Segure o prato de cultura celular angulado em uma mão e adicione 10 mL de PBS estéril ao lado do prato de cultura celular para evitar enxaguar as células. Coloque o prato de cultura celular para baixo para que PBS enxague o prato de cultura celular completa.</li>
	<li>Retire o PBS e adicione 1 mL de trippsina no meio do prato de cultura celular e incubar por 5 min a 37 °C.</li>
	<li>Pare a reação de trippsinização adicionando 10 mL de DMEM incluindo 10% DE FCS e pipeta a solução celular para cima e para baixo com um pipettor para separar manualmente as células.</li>
	<li>Analise o número do celular por mililitro usando uma câmara de contagem.</li>
	<li>Sementes 68.000 células em 2 mL médio por poço sobre a tampa de vidro desliza na placa de 6 poços. Distribua as células dentro da placa de 6 poços agitando cautelosamente a placa horizontal e verticalmente. NOTA: As células devem estar espalhadas.</li>
	<li>Incubar as células durante a noite em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.</li>
</ol>2. Transfecção de células
<ol><li>Prepare dois tubos estéreis de 1,5 mL (um para DNA diluído (A) e outro para reagente diluído para transfecção lipídica cônica (B)). Pipeta 0,75 μg de nefrina e 0,75 μg de expressão de podocina cDNA plasmid por poço em um tubo de 1,5 mL e diluí-lo em 100 μL de meio soro reduzido por poço. Adicione 3 μL de reagente de transfecção lipídica cationic por poço ao segundo tubo de 1,5 mL e diluir com 100 μL de meio soro reduzido. Incubar ambas as reações por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Combine ambas as reações (A e B) a um complexo de DNA-lipíde, e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Adicione cautelosamente 200 μL do complexo DNA-lipíde, a cada poço.</li>
	<li>Incubar as células transfeinadas a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h sem alterar o meio.</li>
</ol>3. Imunolabelamento de estruturas celulares
<ol><li>Prepare uma solução de fixação (4% (w/v) paraformaldeído em PBS, 1 mL/well), a solução de permeabilização (0,5% (w/v) Triton X-100 em PBS, 1 mL/bem), e uma solução de bloqueio (5% (v/v) albumina de soro bovino na PBS, 1 mL/well).</li>
	<li>Remova o meio com um dispositivo de vácuo. Adicione 2 mL de PBS a cada poço para remover o meio extra. Aspire completamente a PBS. NOTA: Para evitar lavar as células com PBS, certifique-se de pipetar PBS não na tampa do vidro escorregar diretamente.</li>
	<li>Fixar células com paraformaldeído (FPF) de 4% (c/v) dissolvido em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Alternativamente, fixar células em 3% (v/v) glyoxal-etanol18.</li>
	<li>Descarte pfa e lave células duas vezes em PBS (2 mL cada) evitando tubos diretos nos deslizamentos de tampa de vidro. Permeabilize as células fixas com Triton X-100 0,5% (w/v) em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a solução de permeabilização e lave duas vezes com PBS conforme indicado na etapa 3.2.</li>
	<li>Bloqueie as células adicionando 1 mL de 5% (v/v) BSA no PBS por 1 h à temperatura ambiente. Incubar as células com 200 μL do anticorpo primário (anticorpo anti-podocina 1:200 em 1% (v/v) BSA em PBS) durante a noite a 4 °C. NOTA: Alternativamente, incubar o anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o anticorpo primário e lave três vezes com PBS como na etapa 3.2. Adicione o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra Alexa 488 1:1000 em 1% (v/v) BSA na PBS) por 1h à temperatura ambiente. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.</li>
	<li>Descarte o anticorpo secundário e lave com PBS três vezes.</li>
	<li>Remova o PBS e incuba as células com 200 μL de anticorpo anti-nefrina 1:100 em 1% (v/v) BSA em PBS por 1 h à temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.</li>
	<li>Remova a PBS e incubar com o anticorpo secundário anti-cobaia 633, 1:200, por 1h em temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes. Mantenha as células no escuro usando uma caixa.</li>
</ol>4. Microscopia de expansão
<ol><li>preparação
	<ol>
<li>Para formar os espaçadores para a câmara de gelação, corte a tampa de vidro desliza #1,0 e #1,5 em listras de 5 mm (quatro por lâmina de vidro) usando uma faca de diamante. Posicione as faixas de deslizamento de cobertura de #1,5 mm para que elas formem um quadrado de 2,5 cm de comprimento em um escorregador de vidro e coloque-as em uma câmara de coloração(Figura 2A1-C1). Pipeta uma gota de ddH2O nos cantos da praça para aderir as faixas de deslizamento de tampa de vidro entre si e ao escorregador de vidro(Figura 2A2-C2). NOTA: Evite a secagem completa do ddH2O, pois a força de adesão se perderá. Se necessário, aplique mais gotículas de ddH2O. Aguarde aproximadamente 20 min para que os deslizamentos de cobertura de #1,5 mm sejam fixados com faca antes de começar com a etapa 4.1.2.</li>
		<li>Coloque quatro tiras de deslizamento de tampa de vidro #1.0 por deslizamento de tampa nos deslizamentos de cobertura de #1,5 mm. Adere as listras ao pipetar uma gotícula em cada faixa de deslizamento de cobertura de #1,5 mm(Figura 2A3-C3). NOTA: A espessura do gel deve ser de pelo menos 0,15 mm para facilitar o manuseio no andamento do protocolo. No entanto, para evitar o excesso de gel em cima das células, mantenha a altura dos espaçadores perto do substrato celular. Usando #1,5 e #1.0 como espaçadores, a altura dos espaçadores será de aproximadamente 0,3 mm. As células aderem ao vidro de cobertura (altura de 0,12 mm). Portanto, o gel será espesso o suficiente para manusear, mas o gel excessivo em cima das células é evitado usando #1,0 e #1,5 tampam listras de vidro como espaçadores.</li>
		<li>Para a tampa da câmara de gelação, enrole um copo de tampa (#1,5) com filme de parafina. Evite dobras ou sujeira no filme de parafina(Figura 2A5-C5).</li>
	</ol></li>
	<li>Ancoragem e polimerização (gelação)
	<ol>
<li>Prepare o tampão de ancoragem (ver Tabela 1). Para tratamento de ancoragem, substitua o PBS por 250 μL de tampão de ancoragem por poço diretamente no deslizamento da tampa de vidro e incubar por 3h à temperatura ambiente. Mantenha o substrato no escuro usando uma caixa. NOTA: Alternativamente, incubar durante a noite à temperatura ambiente. Prepare um novo tampão de ancoragem para cada experimento e espere por 10-15 min até que seja dissolvido corretamente. 6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl (AcX) deve ser substituído a cada 4-5 meses para garantir a ancoragem adequada.</li>
		<li>Remova o tampão de ancoragem e lave uma vez com 1,5 mL PBS por poço.</li>
		<li>Para colorir as fibras de actina, descongele uma solução de fhalloidina compatível exM e incubar a faloidina (5 μL de phalloidin diluída em 195 μL de 1% (v/v) BSA em PBS/well) por 45 min à temperatura ambiente. Mantenha amostras no escuro usando uma caixa.</li>
		<li>Enquanto isso, dissolva o acrilato de sódio em ddH2O usando um dispositivo de agitação. No gelo, prepare a solução monômero (ver Tabela 1). NOTA: O acrilato de sódio dissolvido deve ser uma solução clara e incolor. Se a solução for amarela, substitua-se por novo acrilato de sódio.</li>
		<li>Prepare a solução de gelagem no gelo (ver Tabela 1). Pipeta ammoniumperoxidsulfate (APS) na solução de gelagem logo antes da solução de gelagem ser aplicada na câmara de gelação.</li>
		<li>Remova a falooidina das células e lave com 1,5 mL de PBS duas vezes à temperatura ambiente. Deixe 1,5 mL PBS dentro do poço para facilitar a remoção da amostra no deslizamento da tampa do vidro.</li>
		<li>Coloque as células no vidro de cobertura na câmara de gelagem usando fórceps e uma cânula para levantar o deslizamento de vidro de cobertura da placa de 6 poços. NOTA: As células devem estar na parte superior do deslizamento da tampa do vidro. O deslizamento da tampa de vidro não deve tocar os espaçadores.</li>
		<li>Adicione APS à solução de gelagem e vórtice em breve. Pipeta 200 μL de solução de gelagem na amostra (Figura 2A4-C4). Feche cautelosamente a câmara de gelação evitando bolhas de ar dentro do gel (Figura 2A5-C5).</li>
		<li>Incubar a câmara de gelagem por pelo menos 1 h a 37 °C para polimerizar o gel na câmara de coloração molhada.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização (digestão)
	<ol>
<li>Tire a câmara de coloração da incubadora. Para abrir a tampa da câmara de gelação, introduza uma lâmina de barbear entre a tampa e o espaçador. Remova a tampa com cautela. Remova os espaçadores com a lâmina de barbear e elimine todo o gel extra cortando-o com a lâmina de barbear.</li>
		<li>Coloque o slide com o gel e cubra o vidro em um prato cheio de PBS. Tremendo suavemente, remova o vidro de cobertura separado do gel. Para remover o gel do prato facilmente, coloque o slide abaixo do gel para fixar o gel ao slide.</li>
		<li>Com o gel no slide, divida o gel em pequenos pedaços (quarto do gel é dividido em duas a três peças) usando a lâmina de barbear. Empurre suavemente um pedaço de gel em um poço de uma placa de 6 poços com fundo de vidro e enfold-lo por um pincel. Mantenha o gel hidratado com um pouco de PBS usando o pincel para evitar a desidratação do gel. NOTA: As células enfrentam para baixo.</li>
		<li>Usando um microscópio invertido, faça imagens de visão geral com baixa abertura numérica para determinar o fator de expansão após a expansão.</li>
		<li>Prepare o tampão de digestão (ver Tabela 1). Diluir Proteinase K a 4 U/mL no tampão de digestão para receber a solução de digestão. NOTA: O tampão de digestão sem Proteinase K pode ser armazenado a 4 °C por 1-2 semanas.</li>
		<li>Adicione 500 μL da solução de digestão a cada poço e mergulhe o gel dentro da solução. Deixe digerir durante a noite à temperatura ambiente e feche a tampa mantendo as amostras no escuro. NOTA: Alternativamente, deixe digerir a 37 °C por 1h.</li>
	</ol></li>
	<li>expansão
	<ol>
<li>Remova a solução de digestão com uma pipeta e descarte-a. Adicione 1 mL de ddH2O. Incubar o gel imerso por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire a água e adicione 1 mL de ddHfresco 2O. Aguarde 10 min e continue trocando água a cada 10 minutos até que um platô de expansão seja atingido. NOTA: A expansão da amostra até 4,5 vezes é alcançável. O gel fica opticamente claro.</li>
	</ol></li>
	<li>imagiologia
	<ol>
<li>Remova a água do gel e inicie diretamente a microscopia. Utilizando um microscópio invertido, utilize principalmente um objetivo de ar (baixa ampliação) para encontrar células imagens no estado de pré-expansão (etapa 4.3.4).</li>
		<li>Mude para um objetivo de 40x (óleo/água) e 63x para uma melhor resolução. Excite-se com o comprimento de onda de interesse e leve a imagem através da câmera.</li>
	</ol></li>
	<li>validação
	<ol>
<li>Faça uma visão geral da amostra. Encontre e combine as mesmas estruturas dentro da amostra que foram imagens na etapa 4.3.4. Use o canal com a melhor relação sinal-ruído para validação(Figura 3 A-B). NOTA: Ajuste os parâmetros de imagem para obter brilho semelhante à da imagem adquirida no estado não expandido (etapa 4.3.4).</li>
		<li>Sobreposição de imagens pré e pós-expansão girando e mudando-as com ImageJ. Use a ferramenta de medição de distância no ImageJ para medir as distâncias entre estruturas claramente identificáveis. Meça pelo menos 10 estruturas diferentes. NOTA: Alternativamente, use um script Python para medir distâncias descritas em14.</li>
		<li>Calcule o fator de expansão dividindo as medições pós/pré-expansão.</li>
		<li>Para determinar distorções, tire imagens com maior abertura numérica(Figura 4A-B). Sobreponha essas imagens e analise-as com ImageJ ou conforme descrito em15. NOTA: A determinação de distorções deve ser realizada rotineiramente, mas não necessariamente em todas as amostras.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+up%3A+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+nephrin%2C+podocin%2C+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li>
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<li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8(2003).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHS2%2C+encoding+the+glomerular+protein+podocin%2C+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396(2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado permite ao pesquisador visualizar proteínas celulares, por exemplo, podocina, nefrina e componentes citoesqueletal, por exemplo, F-actin. Dentro deste protocolo, as células cos7 transfectadas são usadas como modelo para estudar a interação de proteínas de diafragma cortadas com F-actin. Infelizmente, as linhas celulares podocyte imortalizadas não expressam quantidades endógenas suficientes de proteínas de diafragma cortadas19.
Com este método, as pr...

Albuminúria é um parâmetro substituto de risco cardiovascular e resulta da interrupção do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto do endotélio fenestrado, da membrana glomerular do porão e do diafragma cortado formado por podocitos. Processos primários e secundários de pés de podocitos envolvem a parede capilar do glomerulum2. A estrutura delicada dos processos dos pés é mantida por feixes de actina cortical que também servem como âncoras para proteínas de diafragma de fenda múltipla e outras proteínasadaptadoras 2. A proteína backbone do diafragma é chamada de nefrina e interage de forma homofílica com moléculas de nefetos de podocitos opostos. Através de diversas proteínas adaptadoras, a nefrina está ligada ao citoesqueleto de actina2,3. Mutações no gene de codificação de nefrina NPHS1 levam à síndrome nefrótica do finlandês tipo4.
Uma das proteínas interativas de nefrina é a podocina, uma proteína semelhante ao grampo de cabelo da família estomatina3. Podocin recruta nefrina para jangadas lipídicas e a liga ao citoesqueleto de actina5. Podocina é codificado pelo gene NPHS2. Mutações no NPHS2 levam à síndrome nefrótica resistente a esteroides6.
Para visualizar e co-localizar proteínas adaptadoras de actina, podem ser utilizadas técnicas de imunofluorescência. Infelizmente, a barreira de difração da luz limita a resolução de microscópios convencionais de fluorescência para 200-350 nm7. Novas técnicas de microscopia, por exemplo, estimuladas pelo esgotamento das emissões (STED)8,microscopia de localização ativada por foto (PALM)9,microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM ou dSTORM) ou microscopia de exclusão de estado terrestre seguida pelo retorno individual da molécula (GSDIM)9,10,11, permitem uma resolução de aproximadamente 10 nm. No entanto, essas técnicas de super resolução exigem microscópios altamente caros, pessoal bem treinado e, portanto, não estão disponíveis em muitos laboratórios.
A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica nova e simples que permite imagens de super resolução com microscópios convencionais e está potencialmente disponível para uma grande comunidade de pesquisa12. Na microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM), a amostra de interesse (células ou tecidos) é fixa e manchada com fluoroforos13. As proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas por uma pequena molécula (6-(Acryloyl)amino)ácido hexanoico, éster succinimidyl, AcX) em um hidrogel inchado13. Através da digestão enzimática com proteinase K (ProK), proteínas e fluoroforos mantêm sua posição relativa dentro do gel após a expansão13. Após o inchaço do gel, a amostra expande-se até 4,5 vezes (expansão volutiva de 90 vezes) levando a uma resolução lateral eficaz de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4.5). Modificações desta técnica podem até permitir uma expansão de 10 vezes (expansão volutiva de 1.000 vezes), tornando uma resolução de 20-30 nm nos microscópios convencionais14,15,16.
Estruturas glomerulares de camundongos e rins humanos foram visualizadas via ExM17. Dentro deste artigo, apresentamos um protocolo proExM detalhado para visualizar imagens de super resolução de F-actin e podocina de proteína actina dentro das células usando um microscópio de fluorescência convencional.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td></td></tr><tr><td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, éster succinimidílico, Acryloyl-X, SE</td><td>invitrogen</td><td>A-20770</td><td>armazenar até 4 meses</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser (óculos de cobertura)</td><td>Engelbrecht</td><td>K12432</td><td>24x32mm #1.0</td></tr><tr><td>Diamont cortador</td><td>VWR</td><td>201-0392</td><td>para cortar as lamínulas</td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272-100G</td><td>8M O estoque pode ser mantido na RT</td></tr><tr><td>Marten pincel de cabelo</td><td>Leon Hardy</td><td>3 (770)</td><td></td></tr><tr><td>"Menzel" Deckgl&auml; ser (óculos de cobertura)</td><td>Thermo Fischer&nbsp;</td><td>15654786</td><td>24x24mm #1.5</td></tr><tr><td>N,N'-Metilenbisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Objekttr&auml; ger UniMark</td><td>Marienfeld</td><td>703010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td> Acrilato de Sódio <td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>verifique a pureza&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> de coloração <td>produzida na oficina da universidade</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>ROTH</td><td>2367.1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo de vidro de 6 poços</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin-ExM 546&nbsp;</td><td>chrometra</td><td>indisponível</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Anti Podocin produzido em coelho</td><td>Sigma</td><td>P-0372-200UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Burro anti-cobaia CF633</td><td>Sigma</td><td>SAB4600129-50UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Cabra anti coelho 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Cobaia anti nefrina</td><td>Origene</td><td>BP5030</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AXIO Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>não disponível</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de proteínas podocíticas nephrin, actin e podocina com microscopia de expansão

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

A interrupção do filtro glomerular composto pelo endotélio glomerular, membrana glomerular do porão e podocitos, resulta em albuminúria. Os processos do pé podocyte contêm feixes de actina que se ligam a proteínas adaptadoras citoesquelletal, como a podocina. Essas proteínas adaptadoras, como a podocina, ligam a espinha dorsal do diafragma de fenda glomerular, como a nefrina, ao citoesqueleto de actina. Estudar a localização e função dessas e outras proteínas podocíticas é essencial para a compreensão do papel do filtro glomerular na saúde e na doença. O protocolo apresentado permite que o usuário visualize actina, podocina e nefrina em células com imagens de super resolução em um microscópio convencional. Primeiro, as células são manchadas com uma técnica convencional de imunofluorescência. Todas as proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas a um hidrogel inchado. Através da digestão com proteinase K, as proteínas estruturais são cortadas permitindo o inchaço isotropical do gel na última etapa. A diálise da amostra na água resulta em uma expansão de 4-4,5 vezes da amostra e a amostra pode ser imageda através de um microscópio de fluorescência convencional, tornando uma resolução potencial de 70 nm.

O conceito e o tempo deste protocolo proExM são retratados na Figura 1. No dia 5, as células transfeinadas são fixas e manchadas com anticorpos fluorescentes voltados para a proteína de interesse (Figura 1A,B). No dia 6, o tratamento com AcX leva à formação de grupos de amina em todas as proteínas (incluindo fluoroforos) (Figura 1A,B)12. Após ...

O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.

Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Este protocolo microscópico de expansão permite ao pesquisador visualizar proteínas glomerulares com resolução de nanoescala em um microscópio convencional. A principal vantagem da microscopia de expansão é que ela é acessível a uma grande comunidade de pesquisa. Comece fazendo espaçadores para a câmara de gelação.Corte número um e número 1,5 tampa de vidro desliza em listras de cinco milímetros, usando uma faca de diamante. Coloque um deslizamento de vidro em uma câmara de coloração e posicione as listras de deslizamento de cobertura número 1,5 no escorregador de vidro, de modo que eles formem um quadrado de 2,5 centímetros. Pipeta uma gota de água dupla destilada nos cantos da praça para aderir as listras de deslizamento de tampa de vidro uns aos outros e ao deslizamento de vidro.Aguarde aproximadamente 20 minutos para que os deslizamentos de cobertura número 1.5 sejam fixados. Pipeta uma gota de água em cada listra de deslizamento de cobertura número 1.5. Coloque quatro listras de deslizamento de tampa de vidro número um nos deslizamentos de cobertura número 1.5.Para a tampa da câmara de gelação, enrole um copo de cobertura com filme de parafina, evitando quaisquer dobras ou suj

imaging-podocytic-proteins-nephrin-actin-podocin-with-expansion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, descrevemos um método chamado patologia de expansão, uma variante da microscopia de expansão, em que as amostras de tecido clínico são expandidas quimicamente usando uma rede de polímeros para exame microscópico de estruturas em nanoescala.

Patologia de expansão: um método para imagens ópticas de alta resolução de amostras de tecido clínico

Alterações nos níveis de cálcio intracelular nos podócitos são um dos meios mais importantes para controlar a função de filtração dos glomérulos. Aqui, explicamos uma abordagem de alto rendimento que permite a detecção do manuseio de cálcio em tempo real e da atividade de canais iônicos únicos nos podócitos dos glomérulos recém-isolados.

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Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

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Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.

Imagem nanoscópica de seções do tecido humano através da expansão física e isotropic

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.

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Aprenda a visualizar proteínas glomerulares com resolução nanométrica usando microscopia de expansão em microscópio convencional. Este método acessível alcança 70 nm de resolução para estudos detalhados de biologia celular.

Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

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