Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

O modelo intestinal é uma maneira amplamente adaptável e fisiológica de medir o quão vazável é o intestino e como os leucócitos migram no intestino em camundongos, in vivo. Este método ajuda a entender melhor os mecanismos subjacentes ao aumento da permeabilidade intestinal e inflamação intestinal patológica. A técnica pode ser empregada para auxiliar em nossos mecanismos de compreensão da função da barreira intestinal, e inflamação patológica, como visto na colite ulcerativa e na doença de Crohn.

Este modelo emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado, seja do íleo ou cólon proximal, para o exame da função da barreira intestinal ou recrutamento de células imunes em camundongos. Com esta ampla aplicação, o modelo de loop intestinal pode fornecer insights sobre doenças que resultam tanto de uma barreira intestinal vazando, bem como da resposta inflamatória. As lutas podem ser superadas praticando os passos cirúrgicos.

É extremamente importante exteriorizar um segmento intestinal totalmente vascularizado e selecionar locais apropriados para as ligaduras para evitar sangramento. O modelo de loop intestinal é uma técnica microcirúrgica, assim, como em outros procedimentos cirúrgicos, beneficia-se muito da demonstração visual e de uma apresentação passo a passo do método. Depois de alcançar um plano cirúrgico de anestesia, comece esfregando a pele da linha média abdominal com cotonetes de álcool ou uma esponja de gaze encharcada com 70% de etanol.

Não molhe uma ampla área de pele com álcool para evitar hipotermia. Usando uma tesoura, faça uma laparotomia midline. Faça uma incisão horizontal no meio do abdômen, e exponha o peritônio, tomando cuidado para não ferir órgãos intra-abdominais.

Coloque gaze de algodão molhado pré-cortada sobre a cavidade intra-abdominal exposta. Use cotonetes de algodão molhado para mobilizar e exteriorizar o ceco e colocá-lo cuidadosamente em gaze de algodão molhado. Em seguida, mobilize e solize suavemente o íleo.

Implante pelo menos seis centímetros de íleo terminal na gaze de algodão molhado sem interromper os vasos mesenéricos e o suprimento de sangue. Mantenha os tecidos expostos úmidos o tempo todo com HBSS quente. Identifique a artéria principal que fornece o íleo na mesenteria, perto do ceco.

Então, localize dois locais de ligadura na mesenteria que estão livres de vasos sanguíneos críticos. Pegue firmemente o íleo terminal com fórceps de tecido contundente e use fórceps finos para fenestrar a mesenteria, evitando vasos sanguíneos. Coloque a sutura de seda através da perfuração, e amarre um nó cirúrgico para criar a primeira ligadura.

Use a régua para medir quatro centímetros de distância da primeira ligadura, e crie a segunda ligadura. Corte cuidadosamente ao lado de cada ligadura com uma tesoura fina para isolar o laço ileal de quatro centímetros, mantendo o suprimento de sangue e a membrana mesentérica intactas. Lave suavemente o conteúdo do segmento de loop ileal com HBSS quente usando um tubo de alimentação amarelo flexível ligado a uma seringa de 10 mililitros.

Certifique-se de retirar o conteúdo luminal da cavidade abdominal para manter o local cirúrgico limpo. Ligate as duas extremidades cortadas do laço ileal lavado com sutura de seda. Use uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 30 para injetar lentamente 250 microliters de reagente, como FITC-dextrans ou quimiocina, no lúmen intestinal.

O laço ileal irá inflar, causando uma distensão moderada da mucosa. Feche a parede abdominal usando um suporte de agulha, fórceps anatômicos e suturas de seda não absorvíveis de 3,0 com uma agulha de corte reversa. Depois de secar o animal para evitar hipotermia, coloque-o em uma câmara de anestesia regulada pela temperatura durante o período de incubação.

Prepare o rato para a cirurgia e exteriorize o ceco como demonstrado anteriormente. Usando cotonetes de algodão molhado, exteriorize todo o íleo e coloque-o em cima de uma gaze de algodão molhado. Identifique o cólon proximal e o suprimento de sangue localizado no mesocólon.

Mobilize o cólon proximal e crie a primeira ligadura em uma área livre de navios no mesocólon a cerca de 0,5 centímetros distal do ceco. Meça dois centímetros da primeira ligadura e crie uma segunda ligadura em uma área livre de suprimento de sangue no mesocólon. Usando uma tesoura fina, corte cuidadosamente ao lado de cada ligadura para isolar um pcLoop de dois centímetros de comprimento.

Lave suavemente o pcLoop com HBSS quente para remover fezes usando um tubo de alimentação amarelo flexível ligado a uma seringa de 10 mililitros. Certifique-se de retirar o conteúdo luminal da cavidade abdominal para manter o local cirúrgico limpo. Em seguida, ligate as duas extremidades cortadas do pcLoop lavado usando sutura de seda.

Use uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 30 para injetar lentamente 200 microliters de reagente, como FITC-dextran ou quimiokine, no lúmen intestinal. O pcLoop vai inflar, causando uma distensão moderada da mucosa. Use cotonetes de algodão molhado para colocar de volta suavemente o pcLoop, íleo e ceco.

Feche a parede abdominal usando um suporte de agulha, fórceps anatômicos e suturas de seda não absorvíveis de 3,0 com uma agulha de corte reversa. Após o período de incubação, eutanize o camundongo anestesiado e colete tecidos para análise. A fim de verificar a precisão do modelo de loop I para a avaliação da permeabilidade intestinal, foi realizado um ensaio FITC-dextran pcLoop para avaliar o papel da proteína associada à junção apertada Jam-a na regulação da função de barreira intestinal in vivo.

Com o modelo pcLoop, um aumento de 2,5 vezes nos níveis de soro FITC-dextran foi quantificado em camundongos nulos jam-a em comparação com os controles. Resultados semelhantes foram obtidos com camundongos abrigando perda seletiva de Jam-a em células epiteliais intestinais. O modelo pcLoop foi utilizado para estudar neutrófilo polimorfonuclear, ou PMN, recrutamento na mucosa intestinal e posterior migração transeptelial in vivo.

O número de PMN no conteúdo luminal do pcLoop foi quantificado pela análise de citometria de fluxo. O número de PMN presente no segmento do cólon proximal foi baixo em condições fisiológicas. O pré-tratamento com citocinas pró-inflamatórias, tnf alfa e gama IFN, antes da cirurgia, resultou em um número aumentado de PMN recrutado no lúmen pcLoop.

A administração da quimio-tramubo LTB4 levou a um aumento dramático nas contagens de PMN. A coloração imunohistoquímica do PMN na mucosa colonia corrobora o elevado recrutamento de PMN após estimulação com citocinas e LTB4. A contribuição de Jam-a para a migração transepitelial pmn foi estudada utilizando o modelo pcLoop em camundongos que abrigam perda seletiva de Jam-a em células epiteliais intestinais.

A perda de jam-a epitelial levou a um número reduzido de PMN transmigrado no lúmen colonico em comparação com os controles de ninhada. Um aspecto crítico para esta técnica é lembrar de preservar o suprimento de sangue para o segmento intestinal exteriorizado ao realizar a cirurgia. Seguindo este protocolo, outros métodos como um ensaio de permeabilidade intestinal e um ensaio de migração transepitelial de neutrófilo podem ser realizados para investigar a perda de integridade da barreira e inflamação intestinal in vivo.