Name: Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda o transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal em camundongos. Este método simplificado facilita a detecção de ilhotas enxertadas sem agentes de ligação ou sutura.

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Este estudo foi financiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão.

O procedimento a seguir é executado em três etapas. O primeiro passo inclui a indução de diabetes nos camundongos receptores e o isolamento das ilhotas doadoras. A segunda etapa envolve a preparação de ilhotas antes do transplante. Na terceira etapa, é realizado o transplante de ilhotas no tecido adiposo epididimal e a cobertura das ilhotas utilizando o tecido adiposo. Em seguida, os efeitos terapêuticos foram avaliados. O manuseio dos camundongos e os procedimentos experimentais realizados neste estudo estão em conformidade com os ''Princípios de Cuidados com Animais de Laboratório'' (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, National Institutes of Health publicação8ª edição, 2011), e o protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Fukuoka (número de aprovação: 186018).
1. Preparação cirúrgica
<ol><li>Indução de diabetes: Induzir diabetes em camundongos machos receptores de 8-12 mg de peso corporal de 20-25 g de idade através de injeção intravenosa de solução de estreptozotocina de 18 mg/mL preparada em tampão de citrato 0,1M (180 mg/kg de peso corporal). Ratos com níveis de glicose no sangue superiores a 400 mg / dL são considerados diabéticos. Use ratos diabéticos dentro de 1 semana após a indução do diabetes antes da atrofia excessiva do tecido adiposo branco epididimal para cobrir ilhotas.</li>
	<li>Isolamento de ilhotas: Realizar isolamento de ilhotas murinas um dia antes do transplante seguindo o método de Gotoh27 para isolamento de ilhotas.</li>
	<li>Em resumo, digerir o tecido pancreático usando solução de colagenase. Isolar ilhotas por centrifugação por gradiente de densidade utilizando uma solução de separação celular apropriada. Em seguida, cultivar ilhotas durante a noite em uma incubadora a 22 °C e 5% de CO2 (cultura a <37 °C foi relatada para prevenir a morte de ilhotas 28,29,30,31). NOTA: Manuseie as culturas de ilhotas purificadas em um armário de segurança. Filtrar-esterilizar todas as soluções utilizadas para isolamento e cultura de ilhotas usando um filtro de 0,22 μm.</li>
</ol>2. Preparação de ilhotas para transplante
<ol><li>Reúna os instrumentos e materiais apropriados, conforme indicado na Figura 1A.</li>
	<li>Como enzimas digestivas como amilase e lipase podem resultar em lesões nas ilhotas isoladas e transplantadas e uma perda de ilhotas pode ocorrer por estarem presas em tecidos fibrosos contaminantes dentro da placa de cultura, antes do transplante, use fórceps para escolher a dedo quaisquer componentes extra-ilhotas do pâncreas, incluindo tecidos acinares e fibrosos (Figura 1B), sob um microscópio de dissecação. Após a colheita, use um filtro de células para filtrar células acinares únicas.</li>
	<li>Transfira as ilhotas filtradas para uma nova placa de cultura contendo qualquer meio de cultura apropriado ou solução tampão (por exemplo, DMEM com baixa glicose, RPMI1640, CMRL1066 ou HBSS) suplementada com soro bovino ou albumina para evitar a fixação das ilhotas ao plástico e girar o prato para posicionar as ilhotas no centro do prato (Figura 1C). Usando uma micropipeta P200 e o microscópio, escolha as ilhotas individuais em um tubo de coleta apropriado (Figura 1D).</li>
	<li>Coloque um novo filtro celular de 40 μm em cima de um tubo de plástico de 50 mL (Figura 1E esquerda e centro) e lave o filtro com meio fresco (Figura 1E à direita).</li>
	<li>Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar as ilhotas ao filtro para separar as ilhotas e as células acinares únicas (Figura 1 F1 e Figura 1F2). NOTA: As ilhotas purificadas no filtro celular serão aproximadamente 100% puras.</li>
	<li>Use fórceps para inverter o filtro em uma nova placa de cultura não tratada de 60 ou 100 mm contendo meio de cultura ou uma solução tampão apropriada suplementada com soro bovino ou albumina (Figura 1 F3 e Figura 1F4). Use meio fresco / tampão para lavar as ilhotas em um novo prato de cultura. Em seguida, adicione meio / tampão suficiente ao prato de cultura para atingir um volume total de aproximadamente 20 mL.</li>
	<li>Contar as ilhotas ao microscópio e dividir o número de ilhotas igualmente entre tubos de centrífuga plástica individuais de 1,5 mL de acordo com o número de animais doadores (Figura 1G). Por exemplo, duzentos equivalentes de ilhotas de 100-200 μm (IEQ) de dois ratos seriam adicionados a cada um dos dois tubos.</li>
	<li>Centrifugar as ilhotas a 2.100 x g no prazo de 1 minuto à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Cerca de 20-30 μL de solução residual normalmente permanecerão no tubo (Figura 1H).</li>
</ol>3. Transplante de ilhotas para tecido adiposo epididimal e cobertura com tecido adiposo branco epididimal
<ol><li>Antes da cirurgia, coletar uma máquina de anestesia para animais de pequeno porte, microscópio estéreo, fonte de luz, micropipeta de 50-200 μL com pontas de micropipeta de 200 μL, cotonetes, conjunto de sutura 4-0 e instrumentos cirúrgicos desinfetados (Figura 2A). Autoclave a tesoura de tanoeiro, tesoura oftálmica, pinça de ervilha, pinça e suportes de agulhas. Após a autoclavagem, imergir o equipamento em solução de iodopovidona a 1% (Figura 2A). Use cotonetes para mobilização do tecido adiposo branco epididimal e para hemostasia em casos de sangramento. Use uma micropipeta com pontas de 50-200 μL para transplante de ilhotas.</li>
	<li>Administrar anestesia ao rato receptor diabético utilizando um agente anestésico inalado (isoflurano a 2% em oxigénio). Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos para evitar a secagem. Em seguida, coloque o rato na posição supina (Figura 2B à esquerda) e remova o cabelo do abdômen para evitar a infecção usando cortadores de cabelo e / ou creme depilatório. Desinfetar o abdome e a região inguinal utilizando pelo menos três rodadas alternadas de solução de iodopovidona seguida de etanol a 70% (Figura 2B à direita). Antes da cirurgia, confirme a profundidade da anestesia através da ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé. Forneça suporte térmico intraoperatório usando uma almofada de aquecimento e use uma cortina cirúrgica para proteger a área cirúrgica estéril.</li>
	<li>Incidir a pele na área mediana inferior (Figura 2C à esquerda). Recomenda-se uma incisão na pele com aproximadamente 2 cm de comprimento. Aperte a parede abdominal esquerda com a pinça de ervilha (pinça atraumática ou afastador também pode ser usado) e puxe o tecido para o lado esquerdo do rato para fixar o campo cirúrgico (Figura 2C à direita). Após a laparotomia, diminua a porcentagem de isoflurano para 1,0-1,5% para manutenção da anestesia.</li>
	<li>Use um cotonete para mobilizar o intestino delgado e grosso para o lado direito do rato (ou seja, o lado esquerdo do operador). O tecido adiposo branco epididimal esquerdo na cavidade abdominal está localizado na área inguinal esquerda. Mobilizar o tecido adiposo branco epididimal e o testículo esquerdo para fora do abdômen (Figura 2D esquerda) e esticar o tecido (2D à direita).</li>
	<li>Use uma micropipeta P200 equipada com uma ponta de pipeta de 200 μL para coletar todo o volume de ilhotas de um tubo de 1,5 mL com pipetagem suave (Figura 2E à esquerda), cuidando para que nenhuma ilhota seja deixada no tubo após a coleta. Permitir que as ilhotas coletadas se depositem na ponta da pipeta por gravidade (Figura 2E à direita).</li>
	<li>Coloque a ponta da micropipeta levemente sobre o tecido adiposo distendido. Tomando cuidado para evitar a lavagem excessiva do meio/tampão na ponta, semeie cuidadosamente as ilhotas no tecido (Figura 2F à esquerda). Após a semeadura, confirme a colocação correta das ilhotas sob um microscópio de dissecação (Figura 2F à direita).</li>
	<li>Cobrir as ilhotas com o tecido adiposo branco epididimal (Figura 2G). O uso de suturas ou agentes bioligantes não é necessário.</li>
	<li>Colocar o testículo esquerdo sob o tecido adiposo branco epididimal e devolver os tecidos à cavidade intraperitoneal (Figura 2H). Feche a pele em duas camadas (peritônio, depois músculo e pele) usando uma sutura 4-0 (quaisquer suturas como nylon ou suturas absorvíveis podem ser usadas) (Figura 2I). Injetar ácido acetilsalicílico (300 mg/kg; SQ) próximo à ferida para analgesia pós-operatória. Em seguida, coloque o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore até a recuperação completa.</li>
</ol>4. Monitorização após transplante de ilhotas (Resumo)
<ol><li>Avaliar os efeitos terapêuticos do transplante de ilhotas por meio do monitoramento da glicemia, teste de tolerância à glicose e avaliação histológica no dia de pós-operatório (DPO) 28.<ol><li>Monitore a glicose no sangue, incluindo as medições de glicose no sangue no teste de tolerância à glicose, usando um pequeno medidor de glicose.</li>
		<li>Colete as amostras de sangue (um pouco de microlitros) da veia da cauda. Em relação à avaliação histológica, a insulina murina (para detecção de ilhotas enxertadas) e o fator de von Willebrand (para detecção de vasos, que é uma evidência de enxerto de ilhotas) foram detectados em ilhotas transplantadas no tecido adiposo epididimal recuperado por imuno-histoquímica.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mold-casted+non-degradable%2C+islet+macro-encapsulating+hydrogel+devices+for+restoration+of+normoglycemia+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).</li>
</ol>

Não temos conflito de interesses.

O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura incorpora técnicas de duas técnicas de transplante diferentes: transplante de ilhotas intraperitoneais e transplante de ilhotas de tecido adiposo. Como a membrana superficial do tecido adiposo branco epididimal é considerada o tecido adiposo branco que é coberto pelo peritônio e que está ligado ao epidídimo, o método de transplante de ilhotas cobertas de gordura pode ser anatomicamente categorizado como um tipo de transplante de ilhotas intraperitoneais. A técnica pe...

O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para pacientes com diabetes mellitus grave. Relatórios recentes têm mostrado que as taxas de independência de insulina em três anos após o transplante melhoram até 44%1 e que aproximadamente 80% dos receptores que recebem mais de 600.000 equivalentes totais de ilhotas atingem a independência da insulina2. Além disso, no mais recente relatório do Registro Colaborativo de Transplante de Ilhotas, foi revelado que os níveis de glicose no sangue em jejum foram mantidos em 60-140 mg / dL por um período de 5 anos em mais de 70% dos pacientes que foram submetidos apenas ao transplante de ilhotas. O estudo também determinou que cerca de 90% dos pacientes que receberam transplante de ilhotas isoladamente ou transplante de ilhotas após o transplante renal não desenvolveram nenhum evento hipoglicêmico grave por mais de 5 anos3.
Embora os desfechos clínicos desse tratamento tenham melhorado, algumas limitações ainda devem ser abordadas, incluindo a necessidade de estabelecer um local ideal para o transplante. O fígado é um local de transplante típico para o transplante clínico de ilhotas porque é o maior órgão que pode acomodar um alto volume de ilhotas. No entanto, em alguns pacientes, o fígado não está disponível (por exemplo, devido à hipertensão portal, hepatite e/ou cirrose4) e, portanto, a outros locais, incluindo o espaço subcapsular renal5,6, bolsa omental 7,8,9,10, mesentério 11, trato gastrointestinal 12, músculo esquelético 13, tecido subcutâneo13, medula óssea 14 e baço 15 ,16,17, têm sido considerados como locais alternativos de transplante.
Embora o transplante intraperitoneal de ilhotas possa ser realizado facilmente sob anestesia local, tornando a cavidade intraperitoneal um local atraente para o transplante clínico de ilhotas, após o transplante, as ilhotas são dispersas por toda a cavidade intraperitoneal, dificultando a detecção do enxerto de ilhotas e a confirmação bem-sucedida do enxerto. Portanto, a cavidade intraperitoneal não é amplamente reconhecida como um local ideal de transplante clínico. Em vez disso, é frequentemente utilizado como um modelo de controle para estudos pré-clínicos para investigar a eficácia de ilhotas encapsuladastransplantadas 18 e de ilhotas de bioengenharia19. No entanto, uma comparação exata entre a bioengenharia e as ilhotas de controle é difícil de alcançar devido aos desafios na realização de uma avaliação precisa do enxerto.
Em contraste, o uso de tecido adiposo branco intraperitoneal na bolsa omental8, mesentério e outras localizações extra-hepáticas tem sido bem relatado 10,20,21,22,23 e muitos dos estudos que investigaram a função de ilhotas de bioengenharia transplantadas com tecido adiposo branco foram capazes de relatar resultados terapêuticos promissores 20,24,25, 26. Como o uso de tecido adiposo epididimal facilita a detecção de ilhotas transplantadas, o "método de transplante de ilhotas cobertas de gordura", utilizando tecido adiposo epididimal, foi desenvolvido para superar as limitações do transplante de ilhotas intraperitoneais. Neste trabalho, o transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo epididimal é descrito.

<table><tbody><tr><td>4-0 Nylon</td><td>Alfresa</td><td>ER2004NA45-KF2</td><td>Abdômen de fechamento</td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugado burro anti-cobaia</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>706-546-148</td><td>Anticorpo secundário para anticorpo de insulina</td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugado burro anti-coelho</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>Anticorpo secundário para anticorpo do fator von Willebrand</td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>ilhotas de cultura, ilhotas transplantadas</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>051-06515</td><td>Usando para coloração de tecido por eosina</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Ilhotas coletoras&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 15 mL</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Ilhotas Coletoras</td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Usando para separar ilhotas de outros tecidos pancreáticos</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cônicos</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Descartando meio excessivo / tampão</td></tr><tr><td>cobaia anti-insulina</td><td>Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)</td> <td>IR002</td><td>Anticorpo primário para insulina murina</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd.</td><td>30002</td><td>Usando-se para manchar o tecido pela</td></tr><tr><td>solução 10%</td><td>Shionogi &Co.</td> da isodina da hematoxilina, Ltd.<td>sem número de catálogo</td><td>Usando para desinfecção</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>095-06573</td><td>Usando para anestesia</td></tr><tr><td>Labcon 1000 &micro; L ZapSilk Pontas de Pipeta de Baixa Retenção</td><td>Labcon</td><td>1177-965-008</td><td>Usando para separar ilhotas de outros tecidos pancreáticos</td></tr><tr><td>Labcon 200 &micro; L ZapSilk Pontas de Pipeta de Baixa Retenção</td><td>Labcon</td><td>1179-965-008</td><td>Uso para semear ilhotas no tecido adiposo branco epididimal</td></tr><tr><td>Mintsensor</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,</td><td>8AEB02E</td><td>Usando para monitorar a glicose no sangue</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Usando para separar ilhotas de outro tecido pancreático</td></tr><tr><td>Pipeman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Usando-se para semear ilhotas no tecido adiposo branco epididimal</td></tr><tr><td>Coelho anti-vWF</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td>Anticorpo primário para o fator de von Willebrand murino</td></tr></tbody></table>

transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

O transplante de ilhotas é uma terapia de reposição celular para diabetes mellitus grave. A cavidade intraperitoneal é tipicamente o local de transplante para este procedimento. No entanto, o transplante de ilhotas intraperitoneais tem algumas limitações, incluindo baixa eficácia do transplante, difícil capacidade de detecção do enxerto e falta de capacidade de enxertectomia para análise pós-transplante. Neste artigo, o "transplante de ilhotas cobertas de gordura", um método de transplante de ilhotas intraperitoneais que utiliza tecido adiposo branco epididimal, é usado para avaliar os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia. A simplicidade do método reside na semeadura de ilhotas no tecido adiposo branco epididimal e no uso do tecido para cobrir as ilhotas. Embora este método possa ser categorizado como uma técnica de transplante de ilhotas intraperitoneais, ele compartilha características com o transplante de ilhotas de tecido adiposo. O método de transplante de ilhotas cobertas de gordura demonstra efeitos terapêuticos mais robustos do que o transplante de ilhotas de tecido adiposo, no entanto, incluindo a melhoria dos níveis de glicose no sangue e insulina plasmática e o potencial para a remoção do enxerto. Recomenda-se a adoção deste método para avaliar os mecanismos de enxerto de ilhotas em tecido adiposo branco e os efeitos terapêuticos de ilhotas de bioengenharia.

Para comparar a eficácia do transplante do transplante de ilhotas cobertas de gordura com a do transplante de ilhotas intraperitoneais, o mesmo número de ilhotas foi implantado no peritônio no espaço paracólico esquerdo dos animais diabéticos receptores de controle. Observou-se que os níveis de glicose no sangue de camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura diminuíram gradual e significativamente em comparação com camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais (p = 0,0023; Fig...

Este método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é adequado para a detecção de ilhotas enxertadas na cavidade intraperitoneal. Notavelmente, não requer o uso de agentes bioligantes ou sutura.

Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Este protocolo permite avaliar o mecanismo de enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco. A principal vantagem deste método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é que é tecnicamente fácil de replicar. O método pode ser aplicado a outros modelos de doenças.Por exemplo, ele pode ser usado para criar um modelo de rato de câncer. Demonstrando o procedimento estará Naoaki Sakata, professor associado da Universidade de Fukuoka. Sob um microscópio de dissecação, use uma micropipeta P 200 para remover quaisquer componentes extras das ilhotas das digestão do pâncreas, incluindo tecidos acinares e fibrosos.Em seguida, use um filtro de células para filtrar células acinares únicas. Transfira as ilhotas filtradas para uma nova placa de cultura contendo o meio de cultura apropriado ou solução tampão suplementada com soro bovino ou albumina, e gire o prato para posicionar as ilhotas no centro. Usando uma micropipeta P 200, escolha as ilhotas individuais em um tubo de coleta apropriado.Coloque um novo filtro de células de 40 micrômetros em cima de um tubo de plástico de 50 mililitros. Use uma pipeta de 1000 microlitros para adicionar as ilhotas ao filtro para separar as ilhotas e as células acinares únicas. Use fórceps para inverter o filtro em um novo prato de cultura não tratado de 60 ou 100 mililitros contendo meio de cultura ou uma solução tampão apropriada, suplementada com soro bovino ou albumina.Use meio fresco, ou tampão para lavar as ilhotas em um novo prato de cultura, em seguida, adicione meio ou tampão suficiente ao prato de cultura para atingir um volume total de aproximadamente 20 mililitros. Conte as ilhotas sob um microscópio e divida o número de ilhotas igualmente entre tubos de centrífuga de plástico individuais de 1,5 mililitro de acordo com o número de animais doadores. Centrifugar as ilhotas a 2, 100 G durante um minuto à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante.Cerca de 20 a 30 microlitros de solução residual normalmente permanecerão no tubo. Depois de remover o cabelo do abdômen para evitar a infecção, coloque o rato em decúbito dorsal. Depois de desinfetar o abdômen e a região inguinal incidem a pele na área mediana inferior, criando uma incisão na pele com aproximadamente dois centímetros de comprimento.Campe a parede abdominal esquerda com pinça ou afastadores e puxe o tecido para o lado esquerdo do rato para fixar o campo cirúrgico. Use um cotonete para mobilizar o intestino delgado e grosso para o lado direito do rato. O tecido adiposo branco epidérmico esquerdo na cavidade abdominal está localizado na área inguinal esquerda.Mobilize o tecido adiposo branco epidérmico e o testículo esquerdo para o exterior do abdómen e estique o tecido. Use uma micropipeta P 200 para coletar todo o volume de ilhotas de um tubo de 1,5 mililitro, tomando cuidado para que nenhuma ilhota seja deixada no tubo após a coleta. Permita que as ilhotas coletadas se depositem na ponta da pipeta por gravidade.Coloque a ponta da micropipeta levemente sobre o tecido adiposo distendido, tomando cuidado para evitar a lavagem excessiva do meio ou tampão na ponta. Semeia cuidadosamente as ilhotas no tecido. Após a semeadura, confirme a colocação correta das ilhotas sob um microscópio de dissecação.Cubra as ilhotas com o tecido adiposo branco epidérmico, em seguida, coloque o testículo esquerdo sob o tecido adiposo branco episómico e devolva os tecidos à cavidade intraperitoneal. Feche a pele em duas camadas usando uma sutura 4-o. Quando terminar, coloque o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore-o até a recuperação completa.Para comparar a eficácia do transplante de ilhotas cobertas de gordura com a do transplante de ilhotas intraperitoneais, o mesmo número de ilhotas foi implantado no peritônio no espaço paracólico esquerdo dos animais diabéticos receptores de controle. Observou-se que os níveis de glicose no sangue de camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura diminuem gradualmente e significativamente em comparação com camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais. O teste intraperitoneal de tolerância à glicose foi realizado um mês após o transplante.A glicemia em camundongos com transplante de ilhotas cobertas de gordura foi mantida em níveis mais baixos do que os observados em camundongos transplantados de ilhotas intraperitoneais. O exame histológico foi utilizado para avaliar o enxerto de ilhotas no tecido adiposo branco epidérmico. Em animais receptores de transplante de ilhotas cobertas de gordura, a coloração de hematoxilina eoceno revelou a presença de ilhotas dentro do tecido adiposo branco epidérmico.Além disso, a coloração por anticorpos conjugados por fluorescência de ilhotas de insulina positiva facilitou a detecção de microvasos positivos para o fator de von Willebrand dentro do tecido adiposo branco epidérmico de todos os camundongos receptores. Para ter sucesso com este procedimento, certifique-se de permitir que as ilhotas se estabeleçam completamente na ponta da pipeta e semeie-as no tecido adiposo sem derramar.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo de validação em vivo de terapia celular baseada em hidrogel, ilustrada pelo exemplo de transplante de ilhotas. h-Omental ilhéu de Matrix (localizador) implantação de enchimento permite a implantação de uma célula-hidrogel mistura entre as camadas omental, perto dos vasos sanguíneos, para maximizar a enxertia em um ambiente apropriado e metabólica.

Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

De modo a compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes neotissue formação e desenvolvimento de estenose em válvulas cardíacas de engenharia de tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de transplante heterotópico de válvula cardíaca. A válvula cardíaca pulmonar foi transplantado para destinatário usando o coração técnica de transplante heterotópico.

O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Aprenda o transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal em camundongos. Este método simplificado facilita a detecção de ilhotas enxertadas sem agentes de ligação ou sutura.

Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

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